Cilt Biyopsilerinden Hasta Kaynaklı Podositlerin Üretimi

Protokol, Friedrich-Alexander Üniversitesi Erlangen-Nuremberg (251_18B) etik kurulu tarafından onaylandı ve tüm hastalar ve probandlar yazılı onay verdi. Tüm deneyler ilgili kılavuz ilkelere ve yönetmeliklere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Burada kullanılan tüm ortam ve çözeltilerin bileşimi için Tablo 1’e bakınız. 1. Deri punch biyopsisinden dermal fibroblastların büyümesi Cilt punch biyopsisini, 10 mL önceden ısıtılmış fibroblast ortamı ile steril bir 15 mL konik tüpe aktarın. Ortamı çıkarın ve cilt punch biyopsisini 5 mL steril, önceden ısıtılmış 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile üç kez yıkayın. Steril forseps ile deri punch biyopsisini 10 cm’lik bir hücre kültürü plakasına aktarın ve steril bir neşterle üç veya dört parça halinde enine keserek epidermis ve dermisi terk edin. Her bir parçayı steril bir 35 mm plastik hücreli kültür kabına aktarın ve yavaşça kültür kabına bastırın. Biyopsi parçalarının etrafındaki fazla ortamı çıkarın. Sıvı buharlaşana ve biyopsi hücre kültürü plastiğine bağlanana kadar 5-10 dakika kurumaya bırakın. Biyopsi etrafına 1.000 μL pipet ile damla damla 1 mL fibroblast ortamı ekleyin ve 3 mL’lik son hacme dikkatlice doldurun. Kabı beslemeden ve hareket ettirmeden 7 gün boyunca 37 ° C,% 5 CO2’de yetiştirin. Ortamı dikkatlice taze, önceden ısıtılmış fibroblast ortamına değiştirin. 7 gün sonra, büyümüş iğ benzeri fibroblastlar, bir faz kontrast mikroskobu36 kullanılarak cilt biyopsisi etrafında izlenebilir.NOT: Büyümüş fibroblastlar çanağın kenarına ulaştığında, başka bir fibroblast grubu oluşturmak için adım 1.3’ten tekrar ilerleyin. Büyümüş fibroblastların genişlemesi için, 2 mL önceden ısıtılmış 1x PBS ile yıkayın, fibroblastları 1 mL 1x tripsin-etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile ayırın ve 37 ° C’de,% 5 CO2’de 5 dakika inkübe edin. Ayrılan hücreleri 15 mL’lik bir konik tüpe aktarın ve hücre kültürü kabını 2 mL taze, önceden ısıtılmış fibroblast ortamı ile yıkayın. Ayrışma maddesini nötralize etmek için yıkama ortamını tüp içinde havuzlayın ve 20 ° C’de 5 dakika boyunca 200 x g’de santrifüj. Süpernatantı aspire edin ve hücre peletini 1 mL taze, önceden ısıtılmış fibroblast ortamı ile yeniden askıya alın. Taze hücre kültürü şişelerindecm2 başına tripan mavisi ve tohum 2,5 x 10 3 ila 5 x 103 fibroblast kullanarak Neubauer odası veya otomatik hücre sayacı ile hücreleri sayın. Şişeleri inkübatöre geri yerleştirin ve şişeleri her yönde üç kez hareket ettirerek hücreleri eşit olarak dağıtın. Ertesi gün, ortamı taze, önceden ısıtılmış fibroblast ortamı ile değiştirin. Ortamı haftada iki kez değiştirin ve fibroblastlar yaklaşık% 80 akıcılığa ulaştığında bölün. 2. Dondurucu dermal fibroblastlar Fibroblastları dondurmak için, 5 mL önceden ısıtılmış 1x PBS ile yıkayın. PBS’yi aspire edin ve fibroblastları 4 mL 1x tripsin-EDTA ile ayırın. Şişeyi inkübatöre geri yerleştirin ve% 5 CO2’de 37 ° C’de 5-7 dakika inkübe edin. Bir faz kontrast mikroskobu kullanarak ayrılmayı izleyin ve hücreleri ayırmak için şişenin yan tarafına dokunun. Ayrılan hücreleri 15 mL’lik bir konik tüpe aktarın. Hücre kültürü şişesini 5 mL taze, önceden ısıtılmış fibroblast ortamı ile yıkayın. Yıkama ortamını konik tüp içinde havuzlayın ve 20 ° C’de 5 dakika boyunca 200 x g’de santrifüjleyin. Süpernatantı aspire edin ve hücre peletini 2 mL taze, önceden ısıtılmış fibroblast ortamı ile yeniden askıya alın. Hücreleri sayın ve 1 x 106 hücreleri yeni bir konik tüpe aktarın. 20 °C’de 5 dakika boyunca 200 x g’de santrifüj. Süpernatantı aspire edin ve hücre peletini% 90 fetal buzağı serumu ve% 10 dimetil sülfoksitten (DMSO) oluşan 1 mL soğuk fibroblast dondurma ortamı ile yeniden askıya alın. Bir kriyoviyal içine aktarın, dondurucu bir kaba koyun ve gece boyunca -80 ° C’de dondurun. Uzun süreli depolama için, kriyoviyal ertesi gün bir sıvı azot tankına yerleştirin. 3. HiPSC’ler üretmek için fibroblastların epizomal olarak yeniden programlanması Epizomal yeniden programlama için, 4’ten 8’e kadar olan pasajlarda 1,5 x 106 fibroblast kullanın. Bu hücre sayısına ulaşmak için, yaklaşık% 70 akıcılığa sahip iki ila üç adet 250 mL şişe kullanın. Yeniden programlamadan bir gün önce, proliferatif durumlarını sağlamak için fibroblastları 1: 2 oranında bölün. Bu nedenle, ortamı aspire edin ve şişeleri şişe başına 5 mL önceden ısıtılmış 1x PBS ile yıkayın. PBS’yi aspire edin ve fibroblastları 4 mL 1x tripsin-EDTA ile ayırın. Şişeleri inkübatöre geri yerleştirin ve 37 ° C’de ve% 5 CO2’de 5-7 dakika inkübe edin. Bir faz kontrast mikroskobu kullanarak ayrılmayı izleyin ve hücreleri plastik yüzeyden ayırmak için şişenin yan tarafına dokunun. Ayrılan hücreleri 50 mL’lik bir konik tüpe aktarın ve hücre kültürü şişelerini 5 mL taze, önceden ısıtılmış fibroblast ortamı ile yıkayın. Yıkama ortamını konik tüp içinde havuzlayın ve 20 ° C’de 5 dakika boyunca 200 x g’de santrifüjleyin. Süpernatantı aspire edin ve hücre peletini 6 mL taze, önceden ısıtılmış fibroblast ortamında yeniden askıya alın. Şişe başına 5 mL taze, önceden ısıtılmış fibroblast ortamı ekleyerek altı yeni hücre kültürü şişesi hazırlayın. Her şişeye 1 mL fibroblast hücre süspansiyonu ekleyin. Şişeleri inkübatöre geri yerleştirin ve şişeleri her yönde üç kez hareket ettirerek hücreleri eşit olarak dağıtın. Epizomal yeniden programlama için, hiPSC kültürüne uygun iki adet 10 cm’lik hücre kültürü plakasını, plaka başına 4 mL soğuk kaplama çözeltisi ile kaplayın. Plakaları 37 ° C’de 1 saat inkübe edin.NOT: Kültür hiPSC’leri için, farklı hücre kültürü plastikleri ve ek hücre dışı matris kaplama gereklidir (bkz. Ortamı fibroblastlardan çıkarın ve şişe başına 10 mL önceden ısıtılmış 1x PBS ile yıkayın. PBS’yi aspire edin ve 37 ° C’de 5-7 dakika inkübe ederek şişe başına 4 mL 1x tripsin-EDTA ile fibroblastları ayırın. Bir faz kontrast mikroskobu kullanarak ayrılmayı izleyin ve gerekirse, hücreleri plastik yüzeyden ayırmak için şişenin yan tarafına dokunun. Ayrılan hücreleri 50 mL’lik bir konik tüpe aktarın. Kalan hücreleri toplamak ve konik tüpte toplamak için boş şişeleri 6 mL önceden ısıtılmış fibroblast ortamı ile yıkayın. 20 °C’de 5 dakika boyunca 200 x g’de santrifüj. Süpernatantı aspire edin ve hücre peletini 3 mL taze, önceden ısıtılmış 1x PBS’de yeniden askıya alın. Hücreleri sayın ve 1.5 x 106 fibroblastları yeni bir konik tüpe aktarın. 20 °C’de 5 dakika boyunca 200 x g’de santrifüj. Süpernatantı atın ve hücre peletini 5 mL elektroporasyon ortamında yeniden askıya alın ve tekrar santrifüjleyin. Bu arada, kaplama çözeltisini kaplanmış 10 cm’lik hücre kültürü plakalarından aspire edin ve 7 mL önceden ısıtılmış fibroblast ortamı ekleyin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı atın ve hücre peletini 250 μL’de 1.5 x 106 hücre konsantrasyonuyla elektroporasyon ortamında yeniden askıya alın. 250 μL hücre süspansiyonunu 4 mm boşluk mesafesine sahip bir elektroporasyon küvetine aktarın (bkz. Toplam 50 μL elektroporasyon ortamına her plazmidden 4 μg (pCXLE-hOCT3/4, pCXLE-hSK, pCXLE-hMLN) ekleyerek bir plazmid transfeksiyon karışımı hazırlayın. Küvete aktarın ve hafifçe hafifçe vurarak karıştırın. 280 V’ta bir darbe ile elektroporat. Steril makas kullanarak bir pipet ucu kesin ve elektropore fibroblastların 125 μL’sini hazırlanan 10 cm’lik hücre kültürü plakalarının her birine aktarın. Plakaları her yöne üç kez çalkalayarak hücreleri dağıtın ve inkübatöre geri yerleştirin. Gece boyunca 37 °C’de %5 CO2 ile rahatsız edilmeden inkübe edin. Ölü hücreleri çıkarmak için, ertesi gün ortamı 7 mL taze, önceden ısıtılmış fibroblast ortamı ile değiştirin. Elektroporasyondan 2 gün sonra ortamı hiPSC kültür ortamına değiştirin ve sonraki 20 gün boyunca her gün değiştirin. 4. Üretilen hiPSC’lerin seçimi, genişletilmesi ve kalite kontrolü Elektroporasyondan sonra hiPSC kolonilerinin oluşumunu gözlemlemek için 10x veya 20x hedefe sahip bir faz kontrast mikroskobu kullanarak hücreleri en az 20 gün boyunca günlük olarak izleyin. Eğer hiPSC kolonileri farklı sınırlara sahip yaklaşık 300 μm çapındaysa ve hiPSC’ler yüksek çekirdek-gövde oranı gösteriyorsa, hiPSC kolonileri toplanarak seçime hazırdır (Şekil 2B,C ve Şekil 3). Toplamadan önce, hiPSC kültürüne uygun 96 delikli bir plakayı kuyu başına 100 μL kaplama çözeltisi ile kaplayın ve 37 ° C’de 1 saat boyunca inkübe edin. Kuluçka sırasında, hücre kültürü kabının altındaki ilgi çekici kolonileri bir kalemle işaretleyin. 96 delikli plakanın son hazırlığı için, kaplama çözeltisini çıkarın ve her bir kuyucuğa 10 μM ROCK inhibitörü Y27632 içeren 100 μL önceden ısıtılmış hiPSC kültür ortamı ekleyin. Hücreleri önceden ısıtılmış 1x PBS ile yıkayın ve ölü hücreleri çıkarmak için toplamadan önce 10 μM ROCK inhibitörü Y27632 içeren taze, önceden ısıtılmış hiPSC kültür ortamı ekleyin. HiPSC kolonilerini seçmek için, bir ölçü iğnesi kullanın ve her koloniye bir ızgara çizerek hiPSC kolonilerini küçük parçalara bölün. Bir faz kontrast mikroskobu kullanarak, kolonilerin başarılı bir şekilde parçalara ayrıldığını kontrol edin. Bunları 100 μL pipetle hazırlanan 96 delikli plakaya aktarın. Koloninin çizilmesini ve kaybolmasını önlemek için pipeti hücrelere dokunmadan koloninin üzerinde dik tutun. 96 delikli plakayı inkübatöre %5 CO2 ile 37 °C’de yerleştirin ve hücrelerin gece boyunca rahatsız edilmeden yapışmasına izin verin. Toplamanın başarılı olmaması ihtimaline karşı bulaşıkları fibroblast ve hiPSC karışımı ile saklayın. Bu nedenle, ortamı hiPSC kültür ortamına değiştirerek ROCK inhibitörü Y27632’yi çıkarın ve plakaları inkübatöre geri yerleştirin. Ertesi gün, 96 delikli plakanın ortamını 200 μL taze hiPSC kültür ortamına değiştirin ve her geçen gün değiştirin. Ertesi gün 96 kuyucuklu plakayı izleyin ve kuyuları başarıyla seçilmiş klonlarla işaretleyin.NOT: Toplanan hiPSC klonları ilk denemeden sonra tam olarak seçilmezse ve fibroblastlar kuyuda bulunabilirse, 96 kuyucuğundan toplamayı tekrarlayın veya fibroblastları plakadan kazıyın. 5. Seçilen hiPSC klonlarının genişletilmesi Bir faz kontrast mikroskobu kullanarak hiPSC klonlarını izleyin. Seçilen hiPSC’ler yaklaşık akıcılığa ulaşırsa, hiPSC klonları genişlemeye hazırdır. HiPSC kültürüne uygun 48 delikli bir plakayı, kuyu başına 250 μL kaplama çözeltisi ile 37 °C’de 1 saat boyunca kaplayın. Kaplama çözeltisini, 10 μM ROCK inhibitörü Y27632 içeren 200 μL taze, önceden ısıtılmış hiPSC kültür ortamı ile değiştirin. HiPSC’leri 96 delikli plakadan ayırmak için plastik yüzeyi 1.000 μL pipet ucuyla kazıyın. Ayrılmış hiPSC’leri 96 delikli plakadan 48 delikli bir plakaya aktarın. Ölü hücreleri ve ROCK inhibitörü Y27632’yi çıkarmak için ertesi gün ortamı taze, önceden ısıtılmış hiPSC kültür ortamına değiştirin. HiPSC klonları yaklaşık% 70 akıcılığa ulaşırsa, hiPSC’leri 24 delikli bir plakaya aktarın. Bu nedenle, hiPSC kültürüne uygun 24 delikli bir plakayı, 37 ° C’de 1 saat boyunca kuyu başına 400 μL kaplama çözeltisi ile kaplayın. Kaplama çözeltisini, 10 μM ROCK inhibitörü Y27632 içeren 400 μL taze, önceden ısıtılmış hiPSC kültür ortamı ile değiştirin. Ortamı 48 kuyucuktan aspire edin ve 500 μL önceden ısıtılmış 1x PBS ile yıkayın. PBS’yi 10 μM ROCK inhibitörü Y27632 içeren 100 μL enzimatik hücre ayırma çözeltisi ile değiştirin ve 37 ° C’de 4 dakika boyunca inkübe edin. 1.000 μL pipet kullanarak hiPSC’leri plakadan durulayın. Ayrışmış hücreleri 15 mL’lik bir konik tüpe aktarın. Boş 48 delikli plakayı, 10 μM ROCK inhibitörü Y27632 içeren hiPSC kültür ortamı ile yıkayın ve konik tüp içinde biriktirin. 20 °C’de 5 dakika boyunca 200 x g’de santrifüj. Süpernatantı aspire edin ve hiPSC’leri 10 μM ROCK inhibitörü Y27632 içeren 1 mL hiPSC kültür ortamında yeniden askıya alın ve 24 delikli bir plakaya aktarın. Plakayı inkübatöre 37 ° C’de% 5 CO2’de yerleştirin ve plakayı her yöne üç kez çalkalayarak hücreleri dağıtın. Hücrelerin gece boyunca rahatsız edilmeden bağlanmasına izin verin. Ertesi gün, ortamı ROCK inhibitörü Y27632 olmadan hiPSC kültür ortamına değiştirin.NOT: HiPSC klonları yaklaşık akıcılığa ulaşırsa, 12 delikli formata uygun daha yüksek hacimlerle 5,4 ila 5,7 arasındaki adımları tekrarlayarak hiPSC’leri 12 delikli bir plakaya aktarın. 12 delikli plakadaki hiPSC’ler yaklaşık akıcılığa ulaşırsa, hiPSC klonlarını 6 delikli bir format için hacimleri artırılmış 6 delikli bir plakaya aktarın. 6. Seçilen hiPSC klonlarının dondurulması Seçilen hiPSC klonlarını dondurmak için, ortamı 6 delikli bir plakadan aspire edin. Kuyucukları 2 mL 1x PBS ile yıkayın. HiPSC’leri 10 μM Y27632 içeren 1 mL enzimatik hücre ayrılma çözeltisi ile aspire edin ve ayırın. Plakayı inkübatöre geri yerleştirin ve 37 ° C’de ve% 5 CO2’de 4 dakika inkübe edin. 1.000 μL’lik bir pipet kullanarak hiPSC’leri plakadan durulayın ve ayrılan hücreleri 15 mL’lik bir konik tüpe aktarın. Plakayı, 10 μM ROCK inhibitörü Y27632 içeren 2 mL taze, önceden ısıtılmış hiPSC kültür ortamı ile yıkayın. Konik tüp içinde havuzlayın ve 20 ° C’de 5 dakika boyunca 200 x g’de santrifüj. Süpernatantı aspire edin ve hücre peletini 10 μM ROCK inhibitörü Y27632 içeren 2 mL taze, önceden ısıtılmış hiPSC kültür ortamı ile yeniden askıya alın. Hücreleri sayın ve 1 x 106 hücreleri yeni bir konik tüpe aktarın. 20 °C’de 5 dakika boyunca 200 x g’de santrifüj. Süpernatanı aspire edin, hücre peletini 1 mL soğuk, serumsuz hiPSC dondurma ortamında yeniden askıya alın ve -80 ° C’de gece boyunca bir dondurma kabı kullanarak bir kriyoviyal içinde dondurun. Uzun süreli depolama için, kriyoviyal ertesi gün bir sıvı azot tankına yerleştirin. 7. HiPSC kalite kontrol HiPSC morfolojisinin karakterizasyonuKarakteristik hiPSC morfolojisini, 20x hedefe sahip bir faz kontrast mikroskobu kullanarak kontrol edin. Yeniden programlamadan sonra, hücre morfolojisi uzun, iğ benzeri fibroblastlardan küçük, yuvarlak hiPSC’lere dönüşür ve farklı sınırları olan kolonilerde büyüyen yüksek çekirdek-vücut oranı sunar (Şekil 2C). HiPSC kolonileri çok yoğunlaşırsa ve kendiliğinden farklılaşma meydana gelirse, farklılaşmış parçaları bir pipet ucu kullanarak plakadan kazıyın (Şekil 3). HiPSC’ler yüksek proliferasyon hızına sahip olduklarından, hiPSC kültürlerini her gün taze, önceden ısıtılmış hiPSC besleme ortamı ile besleyin. İmmünofloresan boyama ile pluripotens belirteçlerinin karakterizasyonuİmmünofloresan boyama yoluyla pluripotens marker için üretilen hiPSC’leri kontrol etmek için, plastik kapakları 24 delikli bir plakaya yerleştirin ve 37 ° C’de 1 saat ve% 5 CO2’de 250 μL kaplama çözeltisi ile kaplayın. Kaplama çözeltisini, 10 μM ROCK inhibitörü Y27632 içeren 1 mL önceden ısıtılmış hiPSC kültür ortamı ile değiştirin. Tohum 1.9 x 1024 kuyucuk başına 4 ayrışmış hiPSC. HiPSC’lerin gece boyunca 37 ° C’de ve% 5 CO2’de bozulmadan takılmasına izin verin. HiPSC’lerin ayrışması için 5.4 ile 5.6 arasındaki adımlara bakın. Ertesi gün ortamı, ROCK inhibitörü Y27632 içermeyen hiPSC kültür ortamıyla değiştirin. Boyama için, hücreleri 1 mL önceden ısıtılmış 1x PBS ile yıkayın ve daha sonra hiPSC’leri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin. Sabit hiPSC’leri 1x PBS ile yıkayın ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca kuyu başına 200 μL ön inkübasyon çözeltisi ile spesifik olmayan bağlanma bölgelerini bloke edin. Primer antikorlar Ki67 (1:300), OCT3/4 (1:200), SSEA4 (1:100) antikor seyreltici içinde seyreltin. Plastik bir folyoyu% 70 etanol ile temizleyin ve bir su haznesi ile doldurulmuş bir boyama odasına yerleştirin. Folyo üzerine 30 μL primer antikor seyreltme damlacıkları yerleştirin. Sabit numuneleri seyreltmeye baş aşağı yerleştirin ve gece boyunca 4 ° C’de inkübe edin. Ertesi gün, numuneleri 5 dakika boyunca 1x PBS ile üç kez yıkayın ve folyo üzerindeki temiz noktalara 30 μL ikincil antikor seyreltme damlacıkları (1:1.000) yerleştirin. Kapak kızaklarını seyreltmede baş aşağı yerleştirin. Karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Kuluçkadan sonra, 5 dakika boyunca 1x PBS ile üç kez yıkayın. Numuneleri, DAPI içeren montaj ortamındaki cam kızaklara monte edin. Gece boyunca oda sıcaklığında ve karanlıkta kurumaya bırakın ve örnekleri konfokal mikroskop kullanarak görüntüleyin (Şekil 4). Bakteri ve mikoplazma kontaminasyonunun dışlanmasıBakteri kontaminasyonunu dışlamak için, 500 μL ayrışmış hiPSC’leri 5 mL önceden ısıtılmış Luria-Bertani (LB) ortamına aktarın. HiPSC’lerin ayrışması için 5.4 ile 5.6 arasındaki adımlara bakın. Gece boyunca 37 ° C’de inkübe edin. LB ortamı bulanık görünüyorsa, bakteri kontaminasyonu muhtemelen meydana gelmiştir. Hücreleri atın. Mikoplazma kontaminasyonunu dışlamak için, yaklaşık% 90 akışkan hiPSC’lere sahip 6 kuyudan 2 gün boyunca değiştirilmemiş ortamları toplayın. Mikoplazma kontaminasyonunu tespit etmek için kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) kullanın. Bu amaçla birçok ticari mikoplazma tespit kiti mevcuttur. 8. HiPSC’lerin podositlere farklılaşması Büyüme faktörlerinin hazırlanması ve depolanması10 mM Y27632’lik bir stok konsantrasyonu hazırlamak için, 3.12 mL steril suda 10 mg Y27632’yi (moleküler ağırlık 320.26 g / mol) yeniden oluşturun. -20 ° C’de 100 μL alikotları saklayın ve 10 μM’lik nihai konsantrasyona ulaşmak için hücre kültürü ortamında 1:1.000 oranında seyreltin. 30 mM CHIR99021’lik bir stok konsantrasyonu hazırlamak için, 358.2 μL steril DMSO’da 5 mg CHIR99021’i (moleküler ağırlık 465.34 g / mol) yeniden oluşturun. -20 ° C’de 50 μL alikot saklayın ve 3 μM’lik nihai konsantrasyona ulaşmak için hücre kültürü ortamında 1:10.000 oranında seyreltin. 100 μg/mL aktivin A’nın stok konsantrasyonunu hazırlamak için, %0.1 sığır serum albümini (BSA) içeren 1x PBS’nin 1 mL’sinde 100 μg aktivin A’yı yeniden oluşturun. -20 ° C’de 100 μL alikot saklayın ve 50 ng / mL’lik nihai konsantrasyona ulaşmak için hücre kültürü ortamında 1: 2.000 seyreltin. 100 μg/mL kemik morfojenik protein 7 (BMP7) stok konsantrasyonunu hazırlamak için, %0,1 BSA içeren 1 mL steril suda 100 μg BMP7’yi yeniden oluşturur. -20 ° C’de 100 μL alikot saklayın ve 50 ng / mL’lik nihai konsantrasyona ulaşmak için hücre kültürü ortamında 1: 2.000 seyreltin. 100 μg/mL vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) stok konsantrasyonu hazırlamak için, 1 mL steril suda 100 μg VEGF’yi yeniden oluşturur. -20 ° C’de 100 μL alikot saklayın ve 25 ng / mL’lik nihai konsantrasyona ulaşmak için hücre kültürü ortamında 1: 4.000 seyreltin. 10 mM’lik bir all-trans retinoik asit stok konsantrasyonu hazırlamak için, 3.33 mL steril DMSO’da 10 mg all-trans retinoik asidi yeniden oluşturun. -20 ° C’de 100 μL alikot saklayın ve 0,5 μM’lik nihai konsantrasyona ulaşmak için hücre kültürü ortamında 1:100 oranında seyreltin. Mezoderm soyunu indüklemek için WNT sinyal yolunun aktivasyonuHiPSC’lerin hiPSC türevi podositlere, kaplama hücre kültürü plakalarına veya hiPSC kültürüne uygun şişelere farklılaşması için, 37 ° C’de 1 saat ve %5 CO2’de kaplama çözeltisi ile. Kaplama çözeltisinin toplam hacmi, 6 delikli kültür plakası başına 1 mL veya 10 cm’lik hücre kültürü plakası başına 4 mL’dir. Ortamı aspire edin ve hiPSC’leri önceden ısıtılmış 1x PBS ile yıkayın. PBS’yi aspire edin ve 6 delikli kültür plakası başına toplam 1 mL veya 10 cm hücre kültürü plakası başına 4 mL hacimde 10 μM Y27632 içeren enzimatik hücre ayrılma çözeltisi ekleyin. Plakayı inkübatöre geri yerleştirin ve 37 ° C’de ve% 5 CO2’de 4 dakika inkübe edin. 1.000 μL pipet kullanarak hiPSC’leri plakadan durulayın. Ayrılan hücreleri konik bir tüpe aktarın. Plakayı 10 μM ROCK inhibitörü Y27632 içeren taze, önceden ısıtılmış hiPSC kültür ortamı ile yıkayın. Ayrışma reaktifini nötralize etmek için yıkama ortamını konik tüp içinde toplayın. 20 °C’de 5 dakika boyunca 200 x g’de santrifüj. Süpernatantı aspire edin ve hücre peletini 10 μM ROCK inhibitörü Y27632 içeren 2 mL taze, önceden ısıtılmış hiPSC kültür ortamı ile yeniden askıya alın. Hücreleri ve tohumu sayın 1 x 104 hiPSC / cm2. Hücreleri her yöne üç kez çalkalayarak dağıtın. HiPSC’lerin 37 °C’de gece boyunca %5 CO2 ile bozulmadan takılmasına izin verin. Ertesi gün, ortamı 1x B27 takviyesi,% 1 penisilin-streptomisin, 3 μM CHIR99021, 50 ng / mL aktivin A ve 10 μM ROCK inhibitörü Y27632 içeren 2 mL önceden ısıtılmış mezoderm farklılaşma ortamı ile değiştirin. Nefron progenitör hücrelere farklılaşma2 gün sonra, mezoderm ortamını 1x B27 takviyesi,% 1 penisilin-streptomisin, 3 μM CHIR99021, 50 ng / mL aktivin A ve 6 kuyucuklu kültür plakası başına 50 ng / mL BMP7 veya 10 cm hücre kültürü plakası başına 6 mL içeren önceden ısıtılmış nefron progenitör farklılaşma ortamının 2 mL’sine değiştirin. Sonraki 14 gün boyunca ortamı her gün değiştirin.NOT: Nefron progenitör hücreleri çoğalır ve nefron progenitör genişleme ortamında 7 günlük farklılaşmadan sonra pasajlanıp dondurulabilir. Nefron progenitör hücrelerini bölmek için, hiPSC kültürüne uygun hücre kültürü plastiklerini 37 ° C’de 1 saat boyunca kaplama çözeltisi ile kaplayın. Kaplama solüsyonunu nefron progenitör genleşme ortamı ile değiştirin. Ortamı aspire edin ve hücreleri önceden ısıtılmış 1x PBS ile yıkayın. PBS’yi çıkarın ve hücreleri 1x tripsin-EDTA ile ayırın. 37 ° C’de ve% 5 CO2’de 5 dakika inkübe edin. Bir faz kontrast mikroskobu kullanarak hücrelerin ayrılmasını izleyin. Gerekirse, hücreleri yüzeyden ayırmak için plastiğin yan tarafına dokunun. Hücreleri plakadan durulayın ve konik bir tüpe aktarın. Boş şişeyi veya plakayı, ayrışma reaktifi ile aynı hacimde önceden ısıtılmış nefron progenitör genleşme ortamı ile yıkayın. Yıkama ortamını konik tüp içinde havuzlayın. 20 °C’de 5 dakika boyunca 200 x g’de santrifüj. Süpernatantı aspire edin ve hücre peletini 2 mL taze, önceden ısıtılmış nefron progenitör genişleme ortamı ile yeniden askıya alın. Daha fazla farklılaşma içincm2 başına hücreleri ve tohumu 1.5 x 104 nefron progenitör hücreleri sayın.NOT: Nefron progenitör hücrelerini dondurmak için, 1 mL soğuk serumsuz kriyoprezervasyon ortamında 1 x 106 hücreyi yeniden askıya alın ve bir kriyoviyal içine aktarın. Gece boyunca -80 ° C’de dondurucu bir kapta dondurun ve uzun süreli depolama için bir sıvı azot tankına aktarın. Plakaları inkübatöre geri yerleştirin ve hücreleri her yöne üç kez ajitasyonla eşit olarak dağıtın. Ertesi gün ortamı taze, önceden ısıtılmış nefron progenitör farklılaşma ortamına değiştirin. Nefron progenitör farklılaşma ortamında hücreler 14 gün boyunca farklılaşana kadar ortamı her gün değiştirin. HiPSC türevi podositlere terminal farklılaşmasıOrtamı aspire edin ve 1x B27 takviyesi,% 1 penisilin-streptomisin, 3 μM CHIR99021, 50 ng / mL aktivin A, 50 ng / mL BMP7, 25 ng / μL VEGF ve 6 kuyucuklu kültür plakası başına 0.5 μM all-trans retinoik asit veya 10 cm hücre kültürü plakası başına 6 mL içeren 2 mL önceden ısıtılmış podosit farklılaşma ortamı ekleyin. Plakaları inkübatöre 37 ° C’de ve% 5 CO2’de geri yerleştirin. Taze, önceden ısıtılmış podosit farklılaşma ortamı ile 4 gün boyunca her gün ortamı değiştirin. HiPSC-podositleri farklılaşmadan sonra kültürde tutmak için, hücreleri haftada iki kez% 10 fetal buzağı serumu,% 1 penisilin-streptomisin ve% 0.1 insülin-transferrin-selenyum içeren podosit bakım ortamı ile besleyin.NOT: Terminal diferansiye hiPSC-podositler artık çoğalmaz. Bununla birlikte, onları hücre kültüründe 4 haftaya kadar tutmak mümkündür. Dondurulmuş nefron progenitör hücrelerin çözülmesi ve genişlemesiHiPSC kültürüne uygun yeni bir hücre kültürü plastik şişesini, 37 °C’de 1 saat ve %5 CO2’de kaplama çözeltisi ile kaplayın. Kaplama çözeltisini 5 mL nefron progenitör genleşme ortamı ile değiştirin. 7 mL önceden ısıtılmış nefron progenitör genleşme ortamına sahip 15 mL’lik bir konik tüp hazırlayın. Dondurulmuş hücreleri 37 ° C’de yaklaşık 20 s boyunca hareket etmeden bir su banyosunda çözün. Hücrelerin yarısı çözüldüğünde ve bir miktar buz kaldığında kriyoviyal su banyosundan çıkarın. Kriyoviyal% 70 etanol ile püskürtün ve bir biyogüvenlik kabinine yerleştirin. Çözülmüş hücreleri, önceden ısıtılmış nefron progenitör genleşme ortamı ile konik tüpe aktarın. 1.000 μL’lik bir pipet kullanın ve hücrelerin tüpün duvarından çok yavaş akmasına izin verin. Kalan hücreleri toplamak ve konik tüpte biriktirmek için boş kriyoviyal 1 mL nefron progenitör genleşme ortamı ile yıkayın. 20 °C’de 5 dakika boyunca 200 x g’de santrifüj yapın ve hücre peletini taze, önceden ısıtılmış nefron progenitör genleşme ortamında yeniden askıya alın. Çözülmüş hücreleri kaplanmış şişeye aktarın ve ertesi gün ortamı taze, önceden ısıtılmış nefron progenitör genleşme ortamına değiştirin. Daha fazla farklılaşmadan önce, hücrelerin her gün ortamı değiştirerek nefron progenitör genişleme ortamında çoğalmasına izin verin ve adım 8.3.5’ten devam edin. 9. HiPSC türevli podositlerin immünofloresan boyama ile karakterizasyonu İmmünofloresan boyama yoluyla podosit spesifik belirteç için farklılaşmış podositleri kontrol etmek için, plastik kapakları 24 delikli bir plakaya yerleştirin ve 37 ° C’de 1 saat ve% 5 CO2’de 250 μL kaplama çözeltisi ile kaplayın. Kaplama çözeltisini 1 mL önceden ısıtılmış nefron progenitör genleşme ortamı ile değiştirin. Tohum 2.5 x 104 ayrışmış nefron progenitör hücreleri 24 delikli plaka başına. Nefron progenitör hücrelerinin ayrışması için 8.3.2 ila 8.3.4 arasındaki adımlara bakın. Hücrelerin gece boyunca 37 ° C’de ve% 5 CO2’de bozulmadan bağlanmasına izin verin. Ertesi gün ortamı önceden ısıtılmış nefron progenitör farklılaşma ortamı ile değiştirin. Nefron progenitör diferansiyasyon ortamında toplam 14 gün ve podosit diferansiyasyon ortamında 5 gün daha hücreler farklılaşana kadar ortamı her gün değiştirerek farklılaşmayı bitirin. Son farklılaşmadan sonra, hücreleri 1 mL önceden ısıtılmış 1x PBS ile yıkayın. HiPSC-podositleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin. Sabit hücreleri 1x PBS ile yıkayın ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca kuyu başına 200 μL ön inkübasyon çözeltisi ile spesifik olmayan bağlanma bölgelerini bloke edin. Primer antikorlar sinaptopodin (1:200), podosin (1:100) ve nefrin (1:25) antikor seyreltici içinde seyreltin ve 30 μL primer antikor seyreltme damlacıklarını su haznesi içeren bir boyama odasında temiz bir plastik folyo üzerine yerleştirin. Sabit hiPSC-podositli kapak slaytlarını seyreltmeye baş aşağı yerleştirin. Gece boyunca 4 ° C’de inkübe edin. Ertesi gün, 5 dakika boyunca 1x PBS ile üç kez yıkayın. İkincil antikorları (1:1.000) 1x PBS’de seyreltin ve folyo üzerindeki temiz noktalara 30 μL sekonder antikor seyreltme damlacıkları yerleştirin. Kapak kızaklarını seyreltmede baş aşağı yerleştirin. Karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Kuluçkadan sonra, 5 dakika boyunca 1x PBS ile üç kez yıkayın. Numuneleri DAPI içeren montaj ortamındaki cam kızaklara monte edin. Gece boyunca oda sıcaklığında ve karanlıkta kurumaya bırakın. Örnekleri konfokal mikroskop kullanarak görüntüleyin.