Este manuscrito describe un protocolo de dos pasos para generar podocitos específicos del paciente a partir de fibroblastos dérmicos a través de la reprogramación episomal en células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC) y la posterior diferenciación en podocitos.
Los podocitos son células epiteliales que se encuentran en el sitio urinario de la barrera de filtración glomerular que contribuyen a la función de filtro selectivo del glomérulo. Las mutaciones en genes específicos de podocitos pueden causar glomeruloesclerosis focal y segmentaria (GFS), y los podocitos también se ven afectados en muchas otras nefropatías primarias y secundarias. Debido a su naturaleza diferenciada, los modelos de cultivo celular primario son limitados para los podocitos. Por lo tanto, comúnmente se utilizan células inmortalizadas condicionalmente. Sin embargo, estos podocitos inmortalizados condicionalmente (cipodocitos) tienen varias limitaciones: las células pueden desdiferenciarse en cultivo, especialmente cuando alcanzan la confluencia, y varios marcadores específicos de podocitos son solo ligeramente o no se expresan en absoluto. Esto pone en tela de juicio el uso de cipodocitos y su aplicabilidad para el alcance fisiológico, fisiopatológico y clínico. Aquí, describimos un protocolo para la generación de podocitos humanos, incluidos los podocitos específicos del paciente, a partir de una biopsia por punción cutánea mediante la reprogramación episomal de fibroblastos dérmicos en hiPSC y la posterior diferenciación en podocitos. Estos podocitos se parecen mucho mejor a los podocitos in vivo en términos de características morfológicas, como el desarrollo de procesos del pie y la expresión del marcador específico de podocitos. Finalmente, pero importante, estas células mantienen las mutaciones de los pacientes, lo que resulta en un modelo ex vivo mejorado para estudiar enfermedades de podocitos y posibles sustancias terapéuticas en un enfoque individualizado.
Los podocitos son células epiteliales renales postmitóticas especializadas que forman la barrera de filtración glomerular del riñón junto con la membrana basal glomerular (GBM), las células endoteliales glomerulares y el glicocálix. Fenotípicamente, los podocitos consisten en un cuerpo celular y extensiones primarias de membrana impulsadas por microtúbulos, así como extensiones secundarias llamadas procesos del pie 1,2. La barrera de filtración glomerular que filtra la orina de la sangre está construida de endotelio fenestrado, GBM, y un tipo especializado de unión intercelular que conecta los procesos vecinos del pie de podocitos, llamado diafragma de hendidura de podoctyes3. En condiciones saludables, las proteínas más grandes que la albúmina son retenidas de la barrera de filtración debido a su tamaño y carga4.
Se sabe que las mutaciones en genes citoesqueléticos o específicos de podocitos, así como los factores circulantes que afectan las vías de señalización de los podocitos, inducen borramiento, desprendimiento o apoptosis de podocitos, lo que resulta en proteinuria y esclerosis glomerular. En particular, el reordenamiento citoesquelético, los cambios en la polaridad de los podocitos o el daño de los procesos del pie con una pérdida asociada de las uniones de hendidura son fundamentales5. Debido a su estado terminalmente diferenciado, los podocitos difícilmente pueden ser reemplazados después del desprendimiento del GBM. Sin embargo, si los podocitos están unidos al GBM, aún pueden recuperarse de la borración y reformar los procesos interdigitados del pie 6,7,8. Una mayor comprensión de los eventos que conducen al daño de los podocitos en diversos trastornos glomerulares puede proporcionar nuevos objetivos terapéuticos que ayudarán a desarrollar tratamientos para estas enfermedades. El daño de los podocitos es un sello distintivo de diferentes enfermedades glomerulares, incluyendo la glomeruloesclerosis focal y segmentaria (GFS), la nefropatía diabética, la enfermedad de cambios mínimos y la glomerulonefropatía membranosa, que requieren modelos fiables de podocitos ex vivo para estudiar los mecanismos patológicos y los posibles enfoques de tratamiento para estas enfermedades 9,10. Los podocitos pueden ser estudiados ex vivo por cultivo celular primario clásico basado en el aislamiento de glomérulos por tamizado diferencial11. Sin embargo, debido al estado terminalmente diferenciado con capacidad de proliferación limitada, la mayoría de los investigadores utilizan líneas celulares de cipodocitos de ratón o humanos que expresan variantes sensibles a la temperatura del antígeno T grande SV40. Alternativamente, los cipodocitos se aíslan de ratones transgénicos que albergan el gen inmortalizador SV40 Tag 1,12.
Los cipodocitos proliferan a 33 °C, pero entran en detención del crecimiento y comienzan a diferenciarse a 37 °C13,14. Hay que tener en cuenta que los datos experimentales obtenidos con estas células deben interpretarse con cierta cautela, ya que las células se generan utilizando una inserción génica antinatural15. Como estas células albergan un gen inmortalizante, la fisiología celular se altera debido a la proliferación en curso12. Las líneas celulares de podocitos generadas por este enfoque han sido cuestionadas recientemente, ya que los cipodocitos de ratón, humanos y ratas expresan menos del 5% de sinaptopodina y nefrina a nivel de proteína, así como NPHS1 y NPHS2 a nivel de ARNm en comparación con la expresión glomerular16. Además, la mayoría de las líneas celulares de podocitos no expresan nefrina17,18. Chittiprol et al. también describieron una diferencia significativa en la motilidad celular y las respuestas a la puromicina y doxorrubicina en cipodocitos16. Los podocitos se pueden encontrar en la orina después del desprendimiento del GBM en diferentes enfermedades glomerulares 19,20,21,22. Los podocitos urinarios viables pueden cultivarse ex vivo hasta por 2-3 semanas, pero la mayoría de las células sufren apoptosis23,24. Curiosamente, los podocitos no sólo se encuentran en la orina de pacientes con enfermedad glomerular, sino también en la orina de sujetos sanos, muy probablemente cuando son senescentes de nuevo con un potencial limitado de replicación en cultivo24. Además, el número de podocitos derivados de la orina es limitado, y las células se desdiferencian en cultivo, muestran menos procesos del pie, cambian la morfología y, lo que es más importante, tienen una capacidad de proliferación limitada. La expresión de genes específicos de podocitos está ausente, desaparece en unas pocas semanas o varía entre estos clones celulares. Algunas células positivas para el marcador específico de podocitos co-expresaron el marcador de células epiteliales tubulares o miofibroblastos y células mesangiales, lo que sugiere desdiferenciación y/o transdiferenciación de los podocitos urinarios cultivados24,25.
Recientemente, se ha descrito la generación de líneas celulares de cipodocitos derivadas de la orina de pacientes y voluntarios sanos por transducción con un antígeno T grande SV40 termosensible y hTERT26. Se detectó la expresión de ARNm para sinaptopodina, nestina y proteína asociada a CD2, pero el ARNm de podocina estuvo ausente en todos los clones. Además de los problemas con los podocitos urinarios, estas células también contienen el gen inmortalizador insertado, lo que resulta en las desventajas discutidas anteriormente.
Por el contrario, las células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC) tienen una enorme capacidad para autorrenovarse y diferenciarse en múltiples tipos de células en condiciones adecuadas. Se ha demostrado antes que las hiPSCs pueden servir como una fuente casi ilimitada de podocitos27,28.
Aquí, se describe un protocolo de dos pasos para generar podocitos específicos del paciente a partir de fibroblastos dérmicos de biopsias de punción cutánea con posterior reprogramación episomal en hiPSC y una diferenciación final en podocitos derivados de hiPSC (Figura 1).
Figura 1: Protocolo para generar podocitos derivados de hiPSC específicos del paciente. Resumen gráfico del protocolo para generar podocitos específicos del paciente a partir de fibroblastos dérmicos de una biopsia de piel mediante la reprogramación en hiPSCs y la diferenciación en podocitos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Como primer paso, los fibroblastos dérmicos somáticos se superaron a partir de una biopsia por punción cutánea y se reprogramaron en hiPSCs utilizando un método libre de integración por electroporación con plásmidos que expresan los factores de transcripción OCT3/4, KLF4, SOX2 y c-MYC 29,30,31. Las colonias hiPSC emergentes fueron posteriormente seleccionadas y expandidas. La diferenciación comenzó con la inducción del linaje mesodérmico mediante la activación de la vía de señalización WNT, seguida de la generación de células progenitoras de nefronas que aún podían proliferar. Finalmente, las células se diferenciaron en podocitos. En este procedimiento, modificamos y combinamos protocolos previamente publicados para la reprogramación episomal para la generación de hiPSCs por Bang et al.32 y Okita et al.33, así como un protocolo para la diferenciación de hiPSCs en podocitos por Musah et al.28,34,35.
De hecho, los podocitos generados por nuestro protocolo tenían un fenotipo más cercano a los podocitos in vivo, con respecto al desarrollo de una red distinta de procesos primarios y secundarios del pie y la expresión de marcadores específicos de podocitos, como sinaptopodina, podocina y nefrina. Con el uso de podocitos derivados de hiPSC, los antecedentes genéticos del paciente se mantienen durante la reprogramación y diferenciación. Esto permite el modelado de la enfermedad de los podocitos específicos del paciente y el descubrimiento de posibles sustancias terapéuticas ex vivo en un número de células casi ilimitado. Además, este protocolo es mínimamente invasivo, rentable, éticamente aceptable y puede facilitar nuevas vías para el desarrollo de fármacos.
Este protocolo basado en cultivo celular combina la reprogramación episomal de fibroblastos dérmicos humanos en hiPSC específicas del paciente y la posterior diferenciación en podocitos derivados de hiPSC. Esto nos permite estudiar las alteraciones relacionadas con mutaciones de los podocitos de pacientes con enfermedad glomerular genética con respecto a la lesión de los podocitos. El protocolo para reprogramar fibroblastos dérmicos con un método libre de integración por electroporación está adaptado del trabajo publicado de Bang et al.32 y Okita et al.33. El protocolo para diferenciar los podocitos de las hiPSCs está adaptado del protocolo publicado de Musah et al.28,34,35. Ya existen publicaciones disponibles que describen la generación de podocitos a partir de hiPSCs 27,34,35. Sin embargo, el protocolo proporcionado aquí está optimizado y es menos costoso con respecto a la diferenciación de hiPSC en podocitos. En comparación con el protocolo publicado de Musah et al., probamos este protocolo en diferentes reactivos de recubrimiento, como vitronectina, laminina seda-511 y matriz de membrana basal solubilizada. Las concentraciones de vitronectina y laminina seda-511 podrían reducirse a 2,5 μg/ml en lugar de 5 μg/ml 28,34,35. Además, fue posible disminuir las concentraciones de BMP7 y activina A, dos factores de crecimiento muy caros, en un 50%, de 100 ng / ml a 50 ng / ml.
Esto permite una diferenciación menos costosa. Las células progenitoras de nefronas desde el día 7 seguían proliferando, y la posibilidad de congelación se demostró antes. Expandimos estas células después de la descongelación y antes de la diferenciación final en medio básico que contiene el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) y B27 durante varios días, disminuyendo aún más los costos. Además de los pasos de diferenciación, este protocolo describe el crecimiento de fibroblastos de biopsias de piel con la posterior generación de hiPSC específicas del paciente a través de la reprogramación episomal. La combinación de estos dos métodos permite la generación de podocitos específicos del paciente. Por lo tanto, aquí se proporciona un protocolo completo paso a paso para generar podocitos derivados de hiPSC específicos del paciente que no se describió antes con tanto detalle.
Como el protocolo general incluye varios tipos de células diferentes, es crucial caracterizar los tipos de células generadas en diferentes pasos. Las células están en cultivo durante un período prolongado de tiempo, por lo que el control de calidad debe realizarse en diferentes pasajes. Cuando se trabaja con hiPSCs, es necesaria la alimentación diaria, así como el comportamiento celular y el monitoreo de la morfología. La esterilidad de los medios de diferenciación debe garantizarse mediante la esterilización del filtro a través de un filtro de 0,2 μm. Todo el protocolo, desde la biopsia de piel hasta los podocitos derivados de hiPSC, lleva varios meses, pero es posible congelar las células en distintas etapas del proceso. Los fibroblastos, los clones de hiPSC seleccionados y las células progenitoras proliferativas de nefronas después de 7 días en el medio de diferenciación progenitora de nefronas se pueden congelar y se puede generar un banco de células funcional.
A pesar de que los podocitos sanos derivados de hiPSC desarrollan una red distinta de procesos primarios y secundarios del pie (Figura 5A, B) y expresan un marcador típico específico de podocitos (Figura 6A-C), los diafragmas característicos de hendidura, como se ve in vivo, son difíciles de imitar en los modelos clásicos de cultivo celular bidimensional. Además, la comunicación intercelular con otros tipos de células glomerulares no es posible en este entorno de monocultivo.
Debido a su estado terminal diferenciado y la falta de capacidad de proliferación, es difícil estudiar los podocitos ex vivo. Con la ayuda de la inmortalización condicional de podocitos primarios, es posible superar esta limitación mediante la inserción de un interruptor termosensible, lo que resulta en un modelo de cultivo celular donde las células proliferan a 33 °C y se diferencian a 37 °C13,14. A pesar de que estos cipodocitos tienen un alto potencial para la investigación de podocitos, existen limitaciones, como la falta de expresión del marcador, la morfología desdiferenciada y la falta de formación de procesos del pie15,16.
La diferenciación de podocitos de células somáticas derivadas de pacientes permite la generación y comparación de podocitos enfermos con células de control sanas ex vivo. Esto nos permite estudiar el daño de los podocitos debido a mutaciones en genes específicos de podocitos. Además, trabajar con hiPSCs tiene el potencial de crear modelos tridimensionales de enfermedades de cultivo celular, o más bien organoides43,44. El cocultivo de podocitos derivados de hiPSC con otras células glomerulares, como las células endoteliales glomerulares o las células mesangiales, podría conducir a nuevos conocimientos sobre la comunicación intercelular en la salud y la enfermedad glomerular.
Además, la caracterización y el tratamiento de los podocitos específicos del paciente se pueden realizar ex vivo en análisis de alto rendimiento. El enfoque individualizado abre la oportunidad de investigar nuevos objetivos terapéuticos para mutaciones específicas y realizar medicina individualizada en el futuro.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue financiado por el Centro Interdisciplinario de Investigación Clínica (IZKF) de la Universidad Friedrich-Alexander de Erlangen-Nürnberg con el número de subvención M4-IZKF-F009 otorgado a Janina Müller-Deile, y por Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) bajo el nombre de proyecto STOP-FSGS-Speed Translation-Oriented Progress to Treat FSGS, número de subvención 01GM2202D otorgado a Janina Müller-Deile. Agradecemos a Annalena Kraus por el apoyo en la toma de imágenes SEM.
0.2 µm sterile filter | Rotilab | P668.1 | for sterilization of differentiation medium |
all-trans retinoic acid | Stem Cell Technologies | 72262 | supplement for differentiation |
B27 supplement (50 x), serum free | Gibco | 17504044 | supplement for serum-free differentiation medium |
BG iMatrix-511 Silk | biogems | RL511S | additional option of extracellular matrix reagent used in coating solution to coat cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
Bovine serum albumin (BSA) | Roth | 8076.4 | |
CELLSTAR Filter Cap Cell Culture Flasks, T75, 250 mL | Greiner bio-one | 82050-856 | cell culture plastics suitable for fibroblast culture |
CHIR99021 (5 mg) | Sigma-Aldrich | 252917-06-9 | supplement for differentiation |
Corning Matrigel hESC qualified matrix | Corning | 354277 | additional option of extracellular matrix reagent used in coating solution to coat cell culture plastics suitable for hiPSC culture (solubilized basement membrane matrix) |
countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10283 | to count cells |
countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | to count cells | |
cryoPure tubes, 2 ml, QuickSeal screw cap, white | Sarstedt | 72380 | cryovials for freezing of cells |
dimethyl sulfoxide (DMSO) | Roth | A994.1 | for fibroblast freezing medium |
DMEM/F12 (1:1) (1 x) | Gibco | 11320074 | basic medium for differentiation |
DMEM/F12 + Glutamax | Gibco | 10565018 | basic medium for fibroblast medium |
EVOS M5000 Imaging System | Thermo Fisher Scientific | AMF5000 | phase contrast microscope |
fetal bovine serum premium, inactivated (FCS) | PAN Biotech | P301902 | serum for fibroblast medium, fibroblast freezing medium and podocyte maintenance medium |
fisherbrand Electroporation Cuvettes Plus, 4 mm gap, 800 µL capacity, sterile | Fisherbrand | FB104 | cuvette used for electroporation/episomal reprogramming of fibroblasts (4mm gap) |
fluoromount-G Mounting Medium, with DAPI | Invitrogen | 00-4959-52 | mounting medium containing dapi |
gauge needle (0.6 x 30 mm) | BD Microlance3 | 300700 | for separation of hiPSC colonies into small pieces |
human Recombinant Activin A Protein | 78001.1 | Stem cell technologies | supplement for differentiation |
human recombinant bone morphogenetic protein 7 (BMP7) | Peprotech | 120-03P | supplement for differentiation |
human VEGF-165 Recombinant Protein | Thermo Scientific | PHC9394 | supplement for differentiation |
insulin-transferrin-selenium (ITS -G) (100 x) | Gibco | 41400045 | supplement for podocyte maintenance medium |
LB medium | Roth | X964.1 | for sterility test of hiPSC culture |
lookOut Mycoplasma PCR Detection Kit | Sigma Aldrich | MP0035-1KT | commercial mycoplasma detection kit |
microscope slides | Diagonal GmbH & Co.KG | 21,102 | |
microtube 1.5 mL | Sarstedt | 72706400 | |
mTeSR1 Complete Kit | Stem Cell Technologies | 85850 | basic medium for serum-free hiPSC culture medium |
nalgene freezing container Mr.Frosty | Roth | AC96.1 | to ensure optimal freezing conditions |
normal goat serum | abcam | ab 7481 | for preincubation solution and antibody diluent |
nunc 24 well plates | Thermo Scientific | 142485 | cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
nunc 48 well plates | Thermo Scientific | 152640 | cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
nunc 6 well plates | Thermo Scientific | 140685 | cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
nunc EasYDish Dishes 100 mm | Thermo Scientific | 150466 | cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate | Thermo Scientific | 167008 | cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
nutriFreez D10 Cryopreservation Medium | Sartorius | 05-713-1E | serum-free cryopreservation medium for cryopreservation of hiPSC and nephron progenitor cells |
Opti-MEM | Gibco | 11058021 | electroporation medium |
pCXLE-hMLN | Addgene | #27079 | plasmid for episomal reprogramming |
pCXLE-hOCT3/4 plasmid | Addgene | #27077 | plasmid for episomal reprogramming |
pCXLE-hSK plasmid | Addgene | #27078 | plasmid for episomal reprogramming |
penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | to avoid bacterial contamination |
plastic coverslips | Sarstedt | 83.1840.002 | for immunofluorescent stainings of hiPSCs and hiPSC-derived podocytes |
ROTI Histofix | Roth | P087.3 | commercial paraformaldehyde (4 %) for fixation of cells |
RPMI 1640 + L-Glutamine | Gibco | 21875034 | basic medium for podocyte maintenance medium |
staining chamber StainTray Black lid | Roth | HA51.1 | |
stemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | enzymatic cell detachment solution used for dissociation of hiPSCs |
sterile phosphate buffered saline (PBS) (1 x) | Gibco | 14190094 | used for washing and coating |
sterile water | Roth | T1432 | |
syringe without needle 20 mL | BD Plastipak | 300629 | to filter sterilize differentiation medium |
TC dish 100 mm | Sarstedt | 8,33,902 | sterile cell culture plastics used for cutting the skin biopsy and fibroblast culture |
TC dish 35 mm | Sarstedt | 8,33,900 | sterile cell culture plastics used for outgrowing fibroblasts from skin biopsy |
triton X 100 | Roth | 3051.3 | for preincubation solution |
trypan Blue Stain (0.4 %) for use with the Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | T10282 | to count cells |
trypsin-EDTA (10 x) | Biowest | X0930-100 | dissociation reagent used for fibroblasts and nephron progenitor cells |
tube 15 mL | Greiner bio-one | 188271-N | |
tube 50 mL | Greiner bio-one | 227261 | |
vitronectin ACF | Sartorius | 05-754-0002 | extracellular matrix reagent used in coating solution to coat cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
Y-27632 dihydrochloride (10 mg) | Tocris | 1254 | to avoid apoptosis of hiPSCs during splitting |
Primary antibodies | |||
OCT4 | Stem Cell Technologies | 60093.1 | pluripotency marker, dilution 1:200 |
SSEA-4 | Stem Cell Technologies | 60062FI.1 | pluripotency marker, dilution 1:100 |
Ki67 | Abcam | ab15580 | proliferation marker, dilution 1:300 |
synaptopodin | Proteintech | 21064-1-AP | podocyte-specific marker, dilution 1:200 |
nephrin | Progen | GP-N2 | podocyte-specific marker, dilution 1:25 |
podocin | proteintech | 20384-1-AP | podocyte-specific marker, dilution 1:100 |
Secondary antibodies | |||
goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21435 | secondary anditbody, dilution 1:1000 |
alexa Fluor 647 Goat Anti-Rabbit SFX Kit, highly cross-adsorbed | Invitrogen | A31634 | secondary anditbody, dilution 1:1000 |
donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | secondary anditbody, dilution 1:1000 |
goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21422 | secondary anditbody, dilution 1:1000 |
goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | secondary anditbody, dilution 1:1000 |