В этой рукописи описывается двухэтапный протокол для получения специфических для пациента подоцитов из дермальных фибробластов посредством эписомального перепрограммирования в индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) и последующей дифференцировки в подоциты.
Подоциты представляют собой эпителиальные клетки, расположенные на мочевом участке клубочкового фильтрационного барьера, которые способствуют селективной фильтрующей функции клубочка. Мутации в специфических для подоцитов генах могут вызывать фокальный сегментарный гломерулосклероз (ФСГС), и подоциты также поражаются при многих других первичных и вторичных нефропатиях. Из-за своей дифференцированной природы модели первичных клеточных культур ограничены для подоцитов. Поэтому обычно используются условно иммортализированные клетки. Однако эти условно иммортализированные подоциты (циподоциты) имеют ряд ограничений: клетки могут дедифференцироваться в культуре, особенно когда они достигают слияния, а некоторые подоцитарно-специфические маркеры либо незначительны, либо вообще не экспрессируются. Это ставит под сомнение использование циподоцитов и их применимость для физиологического, патофизиологического и клинического охвата. Здесь мы описываем протокол генерации подоцитов человека, в том числе специфических для пациента подоцитов, из биопсии пунша кожи путем эписомального перепрограммирования дермальных фибробластов в ИПСК и последующей дифференцировки в подоциты. Эти подоциты гораздо лучше напоминают подоциты in vivo с точки зрения морфологических характеристик, таких как развитие стопных отростков и экспрессия подоцитарного специфического маркера. Наконец, что важно, эти клетки поддерживают мутации пациентов, что приводит к улучшенной модели ex vivo для изучения заболеваний подоцитов и потенциальных терапевтических веществ в индивидуальном подходе.
Подоциты представляют собой специализированные постмитотические эпителиальные клетки почек, которые образуют клубочковый фильтрационный барьер почки вместе с клубочковой базальной мембраной (GBM), клубочковыми эндотелиальными клетками и гликокаликсом. Фенотипически подоциты состоят из клеточного тела и первичных, управляемых микротрубочками мембранных расширений, а также вторичных расширений, называемых ножными отростками 1,2. Клубочковый фильтрационный барьер, который фильтрует мочу из крови, построен из фенестрированного эндотелия, GBM и специализированного типа межклеточного соединения, которое соединяет соседние отростки стопы подоцитов, называемого щелевой диафрагмой подокта3. В здоровых условиях белки, крупнее альбумина, удерживаются от фильтрационного барьера из-за их размера и заряда4.
Известно, что мутации в генах, специфичных для цитоскелета или подоцитов, а также циркулирующие факторы, влияющие на сигнальные пути подоцитов, индуцируют стирание, отслоение или апоптоз подоцитов, что приводит к протеинурии и клубочковому склерозу. В частности, ключевыми являются перестройка цитоскелета, изменение полярности подоцитов или повреждение отростков стопы с сопутствующей потерей щелевых соединений5. Из-за их терминально дифференцированного статуса подоциты вряд ли могут быть заменены после отслоения GBM. Однако, если подоциты прикреплены к GBM, они все еще могут восстанавливаться после стирания и реформировать межпальцевые отростки стопы 6,7,8. Дальнейшее понимание событий, которые приводят к повреждению подоцитов при различных клубочковых расстройствах, может обеспечить новые терапевтические цели, которые помогут в разработке методов лечения этих заболеваний. Повреждение подоцитов является отличительной чертой различных клубочковых заболеваний, включая фокальный сегментарный гломерулосклероз (ФСГС), диабетическую нефропатию, болезнь минимальных изменений и мембранозную гломерулонефропатию, что требует надежных моделей подоцитов ex vivo для изучения патологических механизмов и потенциальных подходов к лечению этих заболеваний 9,10. Подоциты могут быть изучены ex vivo с помощью классической первичной клеточной культуры, основанной на выделении клубочков методом дифференциального просеивания11. Однако из-за терминально дифференцированного состояния с ограниченной способностью к пролиферации большинство исследователей используют клеточные линии циподоцитов мыши или человека, которые экспрессируют чувствительные к температуре варианты большого Т-антигена SV40. В качестве альтернативы циподоциты выделяют от трансгенных мышей, несущих ген 1,12 SV40 Tag.
Циподоциты размножаются при 33 ° C, но вступают в остановку роста и начинают дифференцироваться при 37 ° C13,14. Следует иметь в виду, что экспериментальные данные, полученные с этими клетками, следует интерпретировать с определенной осторожностью, поскольку клетки генерируются с использованием неестественной вставки генов15. Поскольку эти клетки содержат иммортализирующий ген, клеточная физиология изменяется из-за продолжающейся пролиферации12. Клеточные линии подоцитов, полученные с помощью этого подхода, недавно были поставлены под сомнение, поскольку циподоциты мышей, человека и крыс экспрессируют менее 5% синаптоподина и нефрина на уровне белка, а также NPHS1 и NPHS2 на уровне мРНК по сравнению с клубочковой экспрессией16. Более того, большинство клеточных линий подоцитов не экспрессируют нефрин17,18. Chittiprol et al. также описали значительную разницу в подвижности клеток и ответах на пуромицин и доксорубицин в циподоцитах16. Подоциты могут быть обнаружены в моче после отделения от ГБМ при различных клубочковых заболеваниях 19,20,21,22. Жизнеспособные мочевые подоциты можно культивировать ex vivo до 2-3 недель, но большинство клеток подвергаются апоптозу23,24. Интересно, что подоциты обнаруживаются не только в моче пациентов с гломерулярной болезнью, но и в моче здоровых добровольцев, скорее всего, когда они стареют снова с ограниченным потенциалом репликации в культуре24. Кроме того, количество подоцитов, полученных из мочи, ограничено, и клетки дедифференцируются в культуре, показывают меньше отростков стопы, изменяют морфологию и, что наиболее важно, имеют ограниченную способность к пролиферации. Экспрессия генов, специфичных для подоцитов, отсутствует, исчезает в течение нескольких недель или варьируется среди этих клеточных клонов. Некоторые клетки, положительные на подоцитарно-специфический маркер, совместно экспрессировали маркер канальцевых эпителиальных клеток или миофибробластов и мезангиальных клеток, что предполагает дедифференцировку и/или трансдифференцировку культивируемых мочевых подоцитов24,25.
Недавно была описана генерация клеточных линий циподоцитов, полученных из мочи пациентов и здоровых добровольцев путем трансдукции термочувствительным большим Т-антигеном SV40 иhTERT26. Экспрессия мРНК синаптоподина, нестина и CD2-ассоциированного белка была обнаружена, но мРНК подоцина отсутствовала во всех клонах. В дополнение к проблемам с мочевыми подоцитами, эти клетки также содержат вставленный иммортализирующий ген, что приводит к недостаткам, рассмотренным выше.
Напротив, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека (ИПСК) обладают огромной способностью к самообновлению и дифференцировке в несколько типов клеток при соответствующих условиях. Ранее было показано, что ИПСК могут служить практически неограниченным источником подоцитов27,28.
Здесь описан двухэтапный протокол генерации специфических для пациента подоцитов из дермальных фибробластов биопсии кожного пунша с последующим эписомальным перепрограммированием в ИПСК и окончательной дифференцировкой в подоциты, полученные из ИПСК (рис. 1).
Рисунок 1: Протокол генерации специфических для пациента подоцитов, полученных из hiPSC. Графический обзор протокола получения специфических для пациента подоцитов из дермальных фибробластов биопсии кожи путем перепрограммирования в ИПСК и дифференцировки в подоциты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
В качестве первого шага соматические дермальные фибробласты были выращены из биопсии кожи и перепрограммированы в ИПСК с использованием метода без интеграции путем электропорации с плазмидами, экспрессирующими факторы транскрипции OCT3/4, KLF4, SOX2 и c-MYC 29,30,31. Возникшие колонии hiPSC впоследствии были отобраны и расширены. Дифференцировка началась с индукции мезодермальной линии путем активации сигнального пути WNT с последующей генерацией клеток-предшественников нефрона, которые все еще были способны размножаться. Наконец, клетки дифференцировались в подоциты. В этой процедуре мы модифицировали и объединили ранее опубликованные протоколы эписомального перепрограммирования для генерации ИПСК Bang et al.32 и Okita et al.33, а также протокол дифференцировки hiPSC в подоциты Musah et al.28,34,35.
Действительно, подоциты, полученные по нашему протоколу, имели фенотип, более близкий к подоцитам in vivo, в отношении развития отдельной сети первичных и вторичных отростков стопы и экспрессии специфических для подоцитов маркеров, таких как синаптоподин, подоцин и нефрин. При использовании подоцитов, полученных из hiPSC, генетический фон пациента сохраняется при перепрограммировании и дифференцировке. Это позволяет моделировать специфическое для пациента заболевание подоцитов и обнаруживать потенциальные терапевтические вещества ex vivo в практически неограниченном количестве клеток. Кроме того, этот протокол является минимально инвазивным, экономически эффективным, этически приемлемым и может способствовать новым возможностям разработки лекарств.
Этот протокол, основанный на клеточных культурах, сочетает в себе эписомальное перепрограммирование дермальных фибробластов человека в специфические для пациента ИПСК и последующую дифференцировку в подоциты, полученные из ИПСК. Это позволяет изучать мутационные изменения подоцитов у пациентов с генетическим гломерулярным заболеванием в отношении повреждения подоцитов. Протокол перепрограммирования дермальных фибробластов методом без интеграции путем электропорации адаптирован из опубликованных работ Bang et al.32 и Okita et al.33. Протокол дифференциации подоцитов от ИПСК адаптирован из опубликованного протокола Musah et al.28,34,35. Уже имеются публикации, описывающие генерацию подоцитов из ИПСК 27,34,35. Тем не менее, представленный здесь протокол оптимизирован и менее дорог в отношении дифференцировки ИПСК в подоциты. По сравнению с опубликованным протоколом Musah et al., мы протестировали этот протокол на различных реагентах покрытия, таких как витронектин, ламининовый шелк-511 и солюбилизированная матрица базальной мембраны. Концентрации витронектина и ламинина шелк-511 могут быть снижены до 2,5 мкг/мл вместо 5 мкг/мл 28,34,35. Кроме того, удалось снизить концентрацию BMP7 и активина А – двух очень дорогих факторов роста – на 50%, со 100 нг/мл до 50 нг/мл.
Это позволяет снизить затраты на дифференциацию. Клетки-предшественники нефрона с 7-го дня все еще размножались, и ранее была показана возможность замораживания. Мы расширили эти клетки после оттаивания и перед окончательной дифференцировкой в основной среде, содержащей модифицированную среду Dulbecco Eagle (DMEM) и B27, в течение нескольких дней, что еще больше снизило затраты. В дополнение к этапам дифференцировки, этот протокол описывает рост фибробластов из биопсии кожи с последующей генерацией специфических для пациента ИПСК посредством эписомального перепрограммирования. Комбинация этих двух методов позволяет генерировать специфические для пациента подоциты. Таким образом, здесь представлен полный пошаговый протокол для создания специфических для пациента подоцитов, полученных из hiPSC, который ранее не был описан так подробно.
Поскольку общий протокол включает в себя несколько различных типов клеток, крайне важно охарактеризовать генерируемые типы клеток на разных этапах. Клетки находятся в культуре в течение длительного периода времени, поэтому контроль качества должен проводиться на разных проходах. При работе с ИПСК необходимо ежедневное кормление, а также мониторинг поведения и морфологии клеток. Стерильность дифференциационных сред должна быть обеспечена стерилизацией фильтра через фильтр 0,2 мкм. Весь протокол, от биопсии кожи до подоцитов, полученных из hiPSC, занимает несколько месяцев, но можно заморозить клетки на разных этапах процесса. Фибробласты, отобранные клоны hiPSC и пролиферативные клетки-предшественники нефрона через 7 дней в среде дифференцировки предшественников нефронов могут быть заморожены, и может быть создан рабочий банк клеток.
Несмотря на то, что здоровые подоциты, полученные из hiPSC, развивают четкую сеть первичных и вторичных отростков стопы (рис. 5A, B) и экспрессируют типичный маркер, специфичный для подоцитов (рис. 6A-C), характерные щелевые диафрагмы, как видно in vivo, трудно имитировать в классических двумерных моделях клеточных культур. Более того, межклеточная связь с другими типами клубочковых клеток невозможна в условиях монокультуры.
Из-за их терминального дифференцированного состояния и недостаточной способности к пролиферации трудно изучать подоциты ex vivo. С помощью условно иммортализации первичных подоцитов можно преодолеть это ограничение путем введения термочувствительного переключателя, в результате чего получается модель клеточной культуры, в которой клетки размножаются при 33 °C и дифференцируются при 37 °C13,14. Хотя эти циподоциты обладают высоким потенциалом для исследования подоцитов, существуют ограничения, такие как отсутствие экспрессии маркеров, дедифференцированная морфология и неспособность формировать отростки стопы15,16.
Дифференцировка подоцитов от соматических клеток, полученных от пациента, позволяет генерировать и сравнивать больные подоциты со здоровыми контрольными клетками ex vivo. Это позволяет изучать повреждение подоцитов из-за мутаций в специфических для подоцитов генах. Кроме того, работа с ИПСК имеет потенциал для создания трехмерных моделей заболеваний клеточных культур, или, скорее, органоидов43,44. Совместное культивирование подоцитов, полученных из hiPSC, с другими клубочковыми клетками, такими как клубочковые эндотелиальные клетки или мезангиальные клетки, может привести к новому пониманию межклеточной коммуникации в здоровье и клубочковых заболеваниях.
Кроме того, характеристика и лечение специфических для пациента подоцитов могут быть выполнены ex vivo в высокопроизводительном анализе. Индивидуальный подход открывает возможность исследовать новые терапевтические мишени для конкретных мутаций и выполнять индивидуализированную медицину в будущем.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была профинансирована Междисциплинарным центром клинических исследований (IZKF) Университета Фридриха-Александра в Эрлангене-Нюрнберге с номером гранта M4-IZKF-F009, предоставленным Янине Мюллер-Дейле, и Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) под названием проекта STOP-FSGS-Speed Translation-Oriented Progress to Treatment FSGS, грант No 01GM2202D, предоставленный Янине Мюллер-Дейле. Мы благодарим Анналену Краус за поддержку в создании снимков SEM.
0.2 µm sterile filter | Rotilab | P668.1 | for sterilization of differentiation medium |
all-trans retinoic acid | Stem Cell Technologies | 72262 | supplement for differentiation |
B27 supplement (50 x), serum free | Gibco | 17504044 | supplement for serum-free differentiation medium |
BG iMatrix-511 Silk | biogems | RL511S | additional option of extracellular matrix reagent used in coating solution to coat cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
Bovine serum albumin (BSA) | Roth | 8076.4 | |
CELLSTAR Filter Cap Cell Culture Flasks, T75, 250 mL | Greiner bio-one | 82050-856 | cell culture plastics suitable for fibroblast culture |
CHIR99021 (5 mg) | Sigma-Aldrich | 252917-06-9 | supplement for differentiation |
Corning Matrigel hESC qualified matrix | Corning | 354277 | additional option of extracellular matrix reagent used in coating solution to coat cell culture plastics suitable for hiPSC culture (solubilized basement membrane matrix) |
countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10283 | to count cells |
countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | to count cells | |
cryoPure tubes, 2 ml, QuickSeal screw cap, white | Sarstedt | 72380 | cryovials for freezing of cells |
dimethyl sulfoxide (DMSO) | Roth | A994.1 | for fibroblast freezing medium |
DMEM/F12 (1:1) (1 x) | Gibco | 11320074 | basic medium for differentiation |
DMEM/F12 + Glutamax | Gibco | 10565018 | basic medium for fibroblast medium |
EVOS M5000 Imaging System | Thermo Fisher Scientific | AMF5000 | phase contrast microscope |
fetal bovine serum premium, inactivated (FCS) | PAN Biotech | P301902 | serum for fibroblast medium, fibroblast freezing medium and podocyte maintenance medium |
fisherbrand Electroporation Cuvettes Plus, 4 mm gap, 800 µL capacity, sterile | Fisherbrand | FB104 | cuvette used for electroporation/episomal reprogramming of fibroblasts (4mm gap) |
fluoromount-G Mounting Medium, with DAPI | Invitrogen | 00-4959-52 | mounting medium containing dapi |
gauge needle (0.6 x 30 mm) | BD Microlance3 | 300700 | for separation of hiPSC colonies into small pieces |
human Recombinant Activin A Protein | 78001.1 | Stem cell technologies | supplement for differentiation |
human recombinant bone morphogenetic protein 7 (BMP7) | Peprotech | 120-03P | supplement for differentiation |
human VEGF-165 Recombinant Protein | Thermo Scientific | PHC9394 | supplement for differentiation |
insulin-transferrin-selenium (ITS -G) (100 x) | Gibco | 41400045 | supplement for podocyte maintenance medium |
LB medium | Roth | X964.1 | for sterility test of hiPSC culture |
lookOut Mycoplasma PCR Detection Kit | Sigma Aldrich | MP0035-1KT | commercial mycoplasma detection kit |
microscope slides | Diagonal GmbH & Co.KG | 21,102 | |
microtube 1.5 mL | Sarstedt | 72706400 | |
mTeSR1 Complete Kit | Stem Cell Technologies | 85850 | basic medium for serum-free hiPSC culture medium |
nalgene freezing container Mr.Frosty | Roth | AC96.1 | to ensure optimal freezing conditions |
normal goat serum | abcam | ab 7481 | for preincubation solution and antibody diluent |
nunc 24 well plates | Thermo Scientific | 142485 | cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
nunc 48 well plates | Thermo Scientific | 152640 | cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
nunc 6 well plates | Thermo Scientific | 140685 | cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
nunc EasYDish Dishes 100 mm | Thermo Scientific | 150466 | cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate | Thermo Scientific | 167008 | cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
nutriFreez D10 Cryopreservation Medium | Sartorius | 05-713-1E | serum-free cryopreservation medium for cryopreservation of hiPSC and nephron progenitor cells |
Opti-MEM | Gibco | 11058021 | electroporation medium |
pCXLE-hMLN | Addgene | #27079 | plasmid for episomal reprogramming |
pCXLE-hOCT3/4 plasmid | Addgene | #27077 | plasmid for episomal reprogramming |
pCXLE-hSK plasmid | Addgene | #27078 | plasmid for episomal reprogramming |
penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | to avoid bacterial contamination |
plastic coverslips | Sarstedt | 83.1840.002 | for immunofluorescent stainings of hiPSCs and hiPSC-derived podocytes |
ROTI Histofix | Roth | P087.3 | commercial paraformaldehyde (4 %) for fixation of cells |
RPMI 1640 + L-Glutamine | Gibco | 21875034 | basic medium for podocyte maintenance medium |
staining chamber StainTray Black lid | Roth | HA51.1 | |
stemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | enzymatic cell detachment solution used for dissociation of hiPSCs |
sterile phosphate buffered saline (PBS) (1 x) | Gibco | 14190094 | used for washing and coating |
sterile water | Roth | T1432 | |
syringe without needle 20 mL | BD Plastipak | 300629 | to filter sterilize differentiation medium |
TC dish 100 mm | Sarstedt | 8,33,902 | sterile cell culture plastics used for cutting the skin biopsy and fibroblast culture |
TC dish 35 mm | Sarstedt | 8,33,900 | sterile cell culture plastics used for outgrowing fibroblasts from skin biopsy |
triton X 100 | Roth | 3051.3 | for preincubation solution |
trypan Blue Stain (0.4 %) for use with the Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | T10282 | to count cells |
trypsin-EDTA (10 x) | Biowest | X0930-100 | dissociation reagent used for fibroblasts and nephron progenitor cells |
tube 15 mL | Greiner bio-one | 188271-N | |
tube 50 mL | Greiner bio-one | 227261 | |
vitronectin ACF | Sartorius | 05-754-0002 | extracellular matrix reagent used in coating solution to coat cell culture plastics suitable for hiPSC culture |
Y-27632 dihydrochloride (10 mg) | Tocris | 1254 | to avoid apoptosis of hiPSCs during splitting |
Primary antibodies | |||
OCT4 | Stem Cell Technologies | 60093.1 | pluripotency marker, dilution 1:200 |
SSEA-4 | Stem Cell Technologies | 60062FI.1 | pluripotency marker, dilution 1:100 |
Ki67 | Abcam | ab15580 | proliferation marker, dilution 1:300 |
synaptopodin | Proteintech | 21064-1-AP | podocyte-specific marker, dilution 1:200 |
nephrin | Progen | GP-N2 | podocyte-specific marker, dilution 1:25 |
podocin | proteintech | 20384-1-AP | podocyte-specific marker, dilution 1:100 |
Secondary antibodies | |||
goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21435 | secondary anditbody, dilution 1:1000 |
alexa Fluor 647 Goat Anti-Rabbit SFX Kit, highly cross-adsorbed | Invitrogen | A31634 | secondary anditbody, dilution 1:1000 |
donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | secondary anditbody, dilution 1:1000 |
goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21422 | secondary anditbody, dilution 1:1000 |
goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | secondary anditbody, dilution 1:1000 |