ハマダラカの精子形成を研究するためのホールマウント蛍光In Situハイブリダイゼーション

この研究では、WFISHを使用して、 An. gambiaeの精子形成中の染色体挙動を調査しました。このプロトコルを適用するための最初の重要なステップは、解剖後に低レベルの形態学的変化を示す精巣を得ることです。精巣解剖を成功させるには、蚊の解剖学に関する基本的な知識が必要であり、以下に、この手順に関するいくつかのガイダンスを示します。 ハマダラカ では、成熟した精巣が蛹と成虫の段階の第6腹部に横たわっているのが見られます21。 図1に示すように、 精管 は精巣を腹部の最後の部分にある男性副腺(MAG)に接続します。MAGは、精子および精液を交尾器官および男性生殖器21の外部部分に送達する独自の射精管に接続されている。男性の生殖器官全体は、蚊のライフステージに応じて異なるアプローチで解剖することができます。蛹の段階では、第6体節付近の腹側を見ることで、光キューティクル全体の実体顕微鏡を使用して精巣を簡単に識別できます(図1)。精巣を解剖するには、第6セグメントを含む腹部の下部を、一対の針を使用して体の他の部分から分離し、1x PBSのきれいな滴に移すことができます。最後のセグメントの除去に続いて、解剖針で穏やかな圧力をかけることにより、装置全体を腹部から押し出すことができます。成人男性の精巣を解剖するには、まず腹部全体を1x PBSの新鮮な滴で分離し、次に男性の交尾構造であるクラスプを運ぶ最後のセグメントを引き抜きます(図1)。この時点で、MAGの下部が浮かび上がり、黄色で簡単に識別できるはずです。次に、精 管 に取り付けられた一対の精巣が見えるまで、針または鉗子の助けを借りて、1x PBSの滴で男性装置全体をゆっくりと引き抜くことができます。固定を進める前に、精管の下部の近くで切断することにより、 精 巣を男性装置の他の部分から分離することが重要です(図1)。 蛹または成体オスの年齢は、調査中の精子形成段階に応じて考慮すべき重要な要素です。 An. gambiae では、精子形成は蛹の初期/中期に始まり、個体の生涯を通じて続きます24。蛹化後3時間から10時間の間に、減数分裂前期および減数分裂期が精巣に多く表され(減数分裂前期、減数分裂)、精子DNAは比較的凝縮されておらず、成熟精子はまだ形成されていない。後期の蛹と生後1日の成虫は、減数分裂前期、減数分裂期、減数分裂後の段階のバランスが取れています(図2 および 図3)。生後4日以上の成人では、減数分裂前期と精母嚢胞はあまり表されず、精巣は主に精子貯留層に含まれる成熟した精子によって占められています。 精子形成のさまざまな段階での性染色体の挙動を調査するために、WFISHは、プロセス全体の良好な表現を確保するために、蛹の後期に解剖された精巣に対して実施されました。これらの染色体の挙動を追跡するために、X染色体またはY染色体にのみ位置する反復配列に特異的な蛍光プローブを使用しました。蛍光プローブは、PCRを用いて作製するか、または3’末端標識オリゴヌクレオチドとして市販のものとして得ることができる。蛍光オリゴプローブからの良好なシグナル検出を可能にするために、>40 bpsの長さのオリゴの使用が推奨されます。私たちの経験では、3’末端標識オリゴは、シグナル検出の点でPCR標識プローブよりも優れた性能を発揮します。また、標的配列のコピー数はWFISHの有効性を左右する因子です。標識がうまくいかない場合は、より長いフラグメントにPCR標識法を使用するか、標的領域に特異的な複数のオリゴを設計することをお勧めします。 現在の分析法は、浸透性溶液(1x PBST 中の 1% Triton/0.1 M HCl)の使用に基づいており、プローブの精巣透過と浸透を良好に行うことができ、ハイブリダイゼーション反応が成功します。性染色体反復配列に特異的なオリゴプローブは、Hallらによって行われた反復要素の広範な特性評価に基づいて設計することができる20。さらに、X−またはY−連結された反復要素に特異的なコンセンサス配列は、RedKmerパイプライン30などのバイオインフォマティクスプラットフォームを用いて得ることができる。性染色体プローブは、サテライトやレトロトランスポゾンなどの反復要素を標的とすることができ、検査中の種に応じてX染色体またはY染色体とのハイブリダイゼーションのレベルが異なる可能性があることに注意することが重要です20,31,32。図3に示すように、プローブのハイブリダイゼーションのレベルが良好でバックグラウンドが低いため、精子形成全体を通して標的染色体を可視化することができました。標識された性染色体のペアは、減数分裂前期と減数分裂期で見られました。これに続いて、減数分裂から生じる一倍体細胞核染色体中のX染色体またはY染色体のいずれかを検出しました。その後、XまたはYを持つ精子は、さまざまなレベルのDNA凝縮によって特徴付けられる精子形成全体から、矢印の形をした成熟精子の最終段階まで追跡することができました。本実験では、共焦点Zスタックを用いて、この過程で細胞の3次元空間構成に関する情報を取得しました(動画1)。 図1:蛹と生後1日の成虫のガンビアハマダラカのオスから解剖した精巣。 (A)蛹後期に解剖された腹部で、第6腹部付近の精巣の位置を示す。精巣はキューティクル全体で識別でき、腹部の両側に茶色がかった構造として現れます(矢印付き)。(B)蛹期に解剖された精巣は、成熟精巣(1)、精管(2)、MAG(3)、射精管(4)を示しています。(C)生後1日の成人男性の腹部を、基底クラスプ部分を取り除いた後に解剖した。MAGは、穏やかな圧力をかけることで腹部から押しつぶすことができます(白い矢印)。(D)生後1日の成人男性から解剖された男性の体内生殖器官。白い矢印は、精巣の基底極に白い凝集体として現れる成熟した精子が占める位置を示しています。スケールバー:(A、C)200μm;(B,D)100μm。IからVIIIまでのローマ数字は腹部を示しています。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図2:ガンビアハマダラカ(Anopheles gambiae)における精子形成の表現。左の画像は、An. gambiaeの後期蛹の精巣をホールマウントDAPI染色した後のものです。右側は、視覚化しやすいように回路図バージョンです。核の形と凝縮レベルを観察することで、二倍体細胞から一倍体精子までのすべての精子形成段階を比較的簡単に追跡できます。幹細胞ニッチは器官の上極に位置し、そこで精原細胞への分化が始まります。精原細胞は有糸分裂後に数が増加し(緑色の細胞)、精母嚢胞のサイズが大きくなります(黄色の細胞)。精原細胞は、有糸分裂(青色細胞)を複数回繰り返した後、精母細胞に分化します。プロセスの他の段階の細胞よりも比較的大きな核を特徴とする精母細胞は、減数分裂を受ける細胞です。減数分裂を起こしている細胞は、さまざまな減数分裂段階で染色体の存在を調べることによって検出できます。キアズマ染色体と中期染色体は、低倍率でも検出できます。減数分裂前期は、蛹の初期段階で解剖された精巣で過剰に表現されています。第1および第2減数分裂の後、精子細胞が産生され、通常、精巣の真ん中に横たわっているのが見られます。精子の核は、丸い形から矢印のような形まで、その形状にある程度の変化を示します。精子は精子形成プロセスに入り、その間に核が凝縮し始め、それらの構造は矢印のような点に変化します。蚊が羽化後に性的に成熟すると、成熟した精子を含む精嚢胞は、発達の異なる段階にある精子嚢胞を犠牲にして、精巣の体積の大部分を占める可能性があります。スケールバー:20 μm。アスタリスク(*)は精巣の頂端部分を示します。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図3:蛹後期から解剖した An. gambiae精 巣のWFISH。 WFISHは、X染色体(Contig_240)およびY染色体(AgY53Bに特異的オリゴプローブ)に特異的なプローブを用いて実施した。(A)WFISHは、二倍体細胞から一倍体精子への精子形成中の性染色体の挙動を追跡することができます。この画像では、精子形成中に核が受ける劇的な変化を理解することができます。性染色体を標識することで、二倍体細胞と一倍体細胞を区別することができます。二倍体細胞では、性染色体からのシグナルは同じ核に結合しています。一倍体細胞(精子細胞と精子)では、減数分裂により性染色体のシグナルが解かれます。(B、C)精巣の高倍率(63倍)画像を(A)に示す。これらは、Z軸に沿ったさまざまな位置で取得されました。白い点線の枠は、取得領域を示します。(B)精母細胞と精子細胞の間の移行段階であり、一倍体細胞の形成と性染色体からのシグナルの別々の核への分離を示しています。(C)一倍体精子と成熟精子の間の移行段階。この段階は、核凝縮レベルの変化を示します。成熟した精子は、精子よりも凝縮して細長い形状を示します。スケールバー:(A)、30 μm;(B、C)、10μm;グレー:DAPI。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 ターゲット・シーケンス プライマー配列とオリゴプローブのコンセンサス 参考 Contig_240 (X) 5′-CAATAAATTTCCTTTTTAATGATGCAAAATCTACGTCTCTAGC-3′-[蛍光色素] 19 AgY53B(Y) 5’アガアアタガアタカガアタグトクTTTCTTCATCCTGAAAGCC-3′-[蛍光色素] この研究 AgY477-AgY53B型ジャンクション地域 (Y) 5′-TTCTAAGTTTCTAGGCTTTAAGGATGAAGAAACCGACTATTC-3′-[蛍光色素] 19 18S rDNA(X) F:AACTGTGGAAAAGCCAGAGCの研究:TCCACTTGATCCTTGCAAAA 19 AgY53B(Y) F:CCTTTAAACACATGCTCAAATTR:GTTTCTTCATCCTTAAAGCCTAG 19 表1: An. gambiaeのX染色体またはY染色体に特異的なオリゴプローブのリスト。 ビデオ1:蛹後期から解剖した An. gambiae 精巣で実施されたWFISHの3Dスタック。 精子形成過程の3D表現を得るために、構造変化の数が少ない精巣に対して共焦点3Dスタックを実行することができる。この研究では、細胞の3D空間構成に関する情報を失わないように、63倍または40倍のオイルレンズの下で、2つの光学セクションの間に1.25μmの間隔でスタックを実行しました。グレー:DAPI、イエロー:Contig_240(X)、マゼンタ:AgY53B(Y)。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。