Este protocolo descreve vários métodos que podem ajudar no estudo da biologia da ATG9A, incluindo imunofluorescência seguida de análise de imagem, considerações de superexpressão transitória e investigação do estado de glicosilação da ATG9A usando western blot.
A autofagia é uma via altamente conservada que a célula usa para manter a homeostase, degradar organelas danificadas, combater patógenos invasores e sobreviver a condições patológicas. Um conjunto de proteínas, chamadas proteínas ATG, compõem a maquinaria de autofagia central e trabalham juntas em uma hierarquia definida. Estudos realizados nos últimos anos têm melhorado nosso conhecimento sobre a via da autofagia. Mais recentemente, foi proposto que as vesículas ATG9A estão no coração da autofagia, pois controlam a síntese rápida de novo de uma organela chamada fagóforo. O estudo da ATG9A tem se mostrado desafiador, uma vez que a ATG9A é uma proteína transmembrana e está presente em diferentes compartimentos da membrana. Como tal, compreender o seu tráfico é um elemento importante para a compreensão da autofagia. Aqui são apresentados métodos detalhados que podem ser usados para estudar a ATG9A e, em particular, sua localização usando técnicas de imunofluorescência, que podem ser avaliadas e quantificadas. As armadilhas da superexpressão transitória também são abordadas. A correta caracterização da função ATG9A e a padronização das técnicas de análise de seu tráfico são cruciais para caracterizar melhor os eventos que regem o início da autofagia.
A ATG9A é a única proteína transmembrana da maquinaria central de autofagia e é trafegada entre o compartimento de Golgi e um compartimento citosólico da vesícula ATG9A, transitando pelo compartimento endossômico1. Por muito tempo enigmática, a ATG9A foi recentemente descrita como uma scramblase lipídica, pois equilibra lipídios através das bicamadas da membrana 2,3. Está claro que a ATG9A reside no topo da hierarquia na formação dos autofagossomos, e seu estudo é, portanto, vital para a compreensão daautofagia4,5. Assim, vesículas ATG9A foram recentemente propostas como a “semente” do autofagossomo 6,7. Entretanto, estudos prévios demonstraram que a ATG9A interage apenas transitoriamente com o autofagossomo em diferentes etapas de sua maturação e não se integra à membrana autofágica 6,8,9,10,11. Assim, mais investigações são necessárias para desvendar completamente o papel e as potenciais múltiplas funções do ATG9A na formação do autofagossomo. No entanto, a discrepância entre os modelos atuais e os dados anteriores só pode ser resolvida por meio de experimentos direcionados abordando o tráfego de ATG9A usando abordagens quantitativas validadas e marcadores intracelulares.
Existem várias ferramentas em uso para estudar a ATG9A, cada uma com vantagens e desvantagens, e o uso dessas ferramentas é complicado pela estrutura da ATG9A, sua função molecular e tráfego celular 2,8,12. A ATG9A forma um homotrímero, é glicosilada e trafegada por toda a célula para compartimentos como o Golgi, os endossomos e a membrana plasmática13,14. Dado seu itinerário complexo, há vários desafios na interpretação de leituras como a dispersão ATG9A do Golgi sobre tratamentos ou estímulos específicos (como a falta de nutrientes e soro). A ATG9A é extremamente dinâmica em termos de tráfego vesicular; de fato, vesículas contendo ATG9A têm sido definidas como o compartimento ATG9A no contexto da autofagia induzida pela fome. O compartimento ATG9A, formado por essas vesículas dinâmicas, interage transitoriamente com várias organelas intracelulares 8,15,16,17. As técnicas aqui descritas, incluindo imunofluorescência, imagens vivas e ensaios de glicosilação, devem auxiliar na detecção e compreensão da biologia da ATG9A. Em particular, as abordagens descritas neste artigo ajudarão a abordar questões sobre localização em compartimentos celulares específicos e interações com parceiros proteicos específicos e/ou compartimentos de membrana. Como o domínio central conservado hidrofóbico ATG9A (domínio PFAM PF04109) tem uma topologia única e ciclos ATG9A entre vários compartimentos de membrana, os pesquisadores devem estar cientes de certas armadilhas e artefatos ao superexpressar transitoriamente ATG9A, incluindo, mas não restrito a, retenção de retículo endoplasmático (RE). Outros possíveis problemas podem surgir devido ao enovelamento incorreto da proteína, agregação artefactual em condições normais de crescimento ou detecção insuficiente do compartimento vesicular devido a protocolos de permeabilização subótimos para imunofluorescência.
Na obtenção de imagens de ATG9A endógeno, deve-se ter cuidado no preparo da amostra e na aquisição das imagens para garantir a qualidade da análise quantitativa subsequente e a correta interpretação dos dados. A combinação das técnicas descritas neste artigo com abordagens bioquímicas padrão (como experimentos de imunoprecipitação ou pull-down não descritos aqui) deve melhorar nossa compreensão da função ATG9A. Este kit de ferramentas experimentais destina-se a ajudar novos pesquisadores a navegar alguns dos ensaios necessários para determinar a função de ATG9A em seu sistema biológico.
Este estudo ilustra as várias ferramentas que podem ser usadas para investigar a localização da ATG9A. Primeiramente, este estudo descreve como a ATG9A pode ser visualizada por imunofluorescência e como esta pode ser quantificada. Em segundo lugar, são comparadas estratégias que podem ser usadas para marcar ATG9A com um marcador fluorescente para visualização em células fixas ou vivas. Finalmente, este trabalho descreve como investigar e usar o estado de glicosilação de ATG9A para determinar se ATG9A saiu do RE e trafegou através do Golgi.
Em relação à caracterização da localização endógena de ATG9A por imunofluorescência, deve-se ter cuidado com os métodos de fixação e permeabilização empregados no experimento. De acordo com os procedimentos padrão aqui descritos, a fixação do paraformaldeído associada à permeabilização da digitonina são boas condições para visualizar tanto as vesículas ATG9A associadas a Golgi quanto as positivas para ATG9A7. Juntamente com a fixação e permeabilização, o momento da incubação com a solução de anticorpos primários também é crítico. Observamos, mas não documentamos, que concentrações mais altas de solução de anticorpos primários e tempos de incubação mais longos podem levar a um aumento deturpado na coloração de Golgi de ATG9A, o que eventualmente compromete a detecção de redistribuição de ATG9A para outros compartimentos da membrana. Além disso, como a ATG9A está presente em muitos compartimentos intracelulares 1,13,17,22,23,24,27,28, é importante a utilização de marcadores de membrana específicos, juntamente com a ATG9A, para identificar onde a ATG9A está localizada. Várias abordagens foram usadas no passado para quantificar a localização de ATG9A, incluindo o coeficiente de correlação de Pearson para colocalização29. Entretanto, a sobreposição parcial do ATG9A com o Golgi e o compartimento vesicular distinto leva a um elevado número de outliers de pixels, o que pode enviesar a interpretação do coeficiente de correlação. Por esta razão, uma abordagem mais simplista baseada na razão da fluorescência média nos dois compartimentos a serem analisados é preferível, e essa abordagem é menos sensível à variabilidade célula a célula. Para maiores informações sobre análise de imagens através de microscopia, os leitores são direcionados para este livro capítulo30.
Ao investigar o estado de glicosilação de ATG9A, a seleção de géis para executar os western blots é importante. Para este protocolo, géis de Tris-acetato 3%-8% são preferidos porque oferecem a mais alta resolução para proteínas maiores, mas composições alternativas de gel ou tampões de corrida que oferecem uma boa separação de proteínas de alto peso molecular também podem ser usados. O experimentador pode garantir a separação máxima das proteínas aumentando o tempo de eletroforese.
Ao preparar as amostras para visualizar ATG9A no western blot, deve-se tomar cuidado para não ferver as amostras após a adição do tampão Laemmli; a ebulição a 95 °C induz a formação de agregados de ATG9A e, posteriormente, ATG9A não migra eficientemente para o gel1. Recomenda-se o aquecimento das amostras a 65 °C durante 5 min27.
Altos níveis de transfecção geralmente levam a maior acúmulo de ATG9A no RE, enquanto níveis moderados de expressão auxiliam na localização fisiológica da proteína. Curiosamente, tempos de incubação de 72 h em vez de 48 h geralmente ajudam a reduzir os artefatos de localização de RE. Notavelmente, o mRFP-ATG9A pode relatar com precisão o tráfego e a função de ATG9A se os níveis forem controlados através de níveis de expressão ou usando linhagens celulares estáveis 8,9,22,27.
A falha de uma população de ATG9A superexpressa em adquirir glicanos maduros ligados a N pode ser usada como uma leitura para o tráfico perturbado de ATG9A. Ao mutar ou excluir certas regiões de ATG9A, há um risco de aumento da retenção de RE, o que pode levar à falha em adquirir glicanos N-ligados maduros e, portanto, uma banda ATG9A de migração mais rápida no western blot. Os pesquisadores que trabalham com construções ATG9A truncadas devem verificar a retenção de RE, estados de glicosilação e localização de Golgi.
Para a imagem de células vivas do ATG9A, um microscópio Airyscan, contando com a função Airyscan rápida, fornece resolução ideal de tipicamente cerca de 120 nm. Para precisão de localização, as taxas de quadros de cerca de 1-2 quadros por segundo (fps) no modo de super-resolução são ideais, dependendo de quantos canais são fotografados. Microscópios confocais semelhantes que podem obter imagens em alta velocidade também podem ser usados para a obtenção de imagens de vesículas ATG9A; Entretanto, deve-se ressaltar que a velocidade da imagem pode afetar diretamente a detecção de eventos e, portanto, afetar a interpretação dos dados.
Em resumo, os protocolos apresentados descrevem maneiras de quantificar e caracterizar a localização de ATG9A por imunofluorescência, microscopia de células vivas e seu status de glicosilação. Esses protocolos podem ajudar os pesquisadores que trabalham com ATG9A e ajudar a evitar algumas armadilhas.
The authors have nothing to disclose.
Os autores agradecem a Rocco D’Antuono pela revisão dos aspectos do manuscrito, bem como a todos os membros atuais e passados do laboratório de Biologia Celular Molecular da Autofagia (MCBA) pelas discussões que levaram ao refinamento desses protocolos. A. v.V., S.d.T., E.A., S.A.T, foram apoiados pelo The Francis Crick Institute, que recebe seu financiamento principal da Cancer Research UK (CC2134), do Conselho de Pesquisa Médica do Reino Unido (CC2134). Esta pesquisa foi financiada no todo ou em parte pelo Wellcome Trust (CC2134). Para fins de acesso aberto, o autor aplicou uma licença pública de direitos autorais CC BY a qualquer versão do Manuscrito Aceito pelo Autor decorrente desta submissão.
24 multiwell plates | Falcon | 353047 | For tissue culture |
35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated | MATTEK | P35G-1.5-14-C | Cell culture dish for live-cell microscopy |
4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | |
60 mm tissue culture dish | Thermofischer Scientific | 10099170 | For tissue culture |
Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermofischer Scientific | A22287 | Actin stain |
anti-ATG9A antibody | home made | STO-215 | Rabbit anti N-terminal peptide ATG9A |
anti-Rabbit IgG, peroxidase-linked | Invitrogen | 10794347/NA934-1ml | Secondary antibody for rabbit polyclonal STO-215 |
anti-RFP antibody | Evrogen | AB233 | for Western Blot |
ATG9A Monoclonal Antibody (14F2 8B1), Invitrogen | Invitrogen | 15232826 | Antibody for immunofluorescence |
ATG9A-eGFP | home made | Construct which expresses tagged ATG9A | |
Bemis Parafilm | Thermofischer Scientific | 11747487 | self-sealing thermoplastic film |
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | 5000006 | For determining protein concentration |
Bovine serum albumin (BSA) | Merck | 10735086001 | For blocking non-specific labelling |
CaCl2.2H2O | / | For PBS and EBSS | |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | Supplement in lysis buffer to prevent protein degradation |
Cy3 AffiniPure Goat Anti-Armenian Hamster IgG | Jackson ImmunoResearch | 127-165-099 | Secondary antibody for i14F2 8B1 antibody for mmunofluorescence |
Cyclohexamide | Sigma Aldrich | 66-81-9 | To stop protein translation |
D-Glucose | / | For EBSS | |
Digitonin | Merck | 300410 | For permeabilizing cells |
DMEM | Merck | D6546-6x500ml | For tissue culture |
eGFP-ATG9A | home made | Construct which expresses tagged ATG9A | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | Supplement for DMEM for cell culture |
FIJI (ImageJ) | / | https:/fiji.sc/ | Open source image analysis software |
Hoechst | Thermofischer Scientific | H3570 | Stains the nucleus |
KCl | / | For EBSS | |
L-glutamine | Sigma | 67513 | For tissue culture |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | For Cell Transfection |
LSM880 Airyscan microscope | Zeiss | / | Confocal microscopy |
MgCl2 | / | For PBS | |
MgSO4.7H2O | / | For EBSS | |
Mowiol mounting solution | Millipore | 475904 | for permanent mounting glass coverslips |
NaCl | / | For EBSS | |
NaH2PO4.2H2O | / | For EBSS | |
NaHCO3 | / | For EBSS | |
NuPAGE 3 to 8%, Tris-Acetate, 1.5 mm, Mini Protein Gels | Thermofischer Scientific | EA0378BOX | for Western Blotting |
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Life Tech | NP0002 | for Western Blotting |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo | 31985062 | For Cell Transfection |
Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1026 | For fixing cells |
pcDNA3.1-mCherry-3xFlag-ATG9A | home made | Construct which expresses tagged ATG9A | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | / | For tissue culture | |
PNGaseF | NEB | P0710S | To remove N-linked glycans |
Poly-D-lysine hydrobromide mol wt 70,000-150,000 | Merck | P0899 | For coating coverslips |
Rapid PNGase F enzyme | NEB | P07105 | To remove N-linked glycans |
RFP-ATG9A | home made | Construct which expresses tagged ATG9A | |
Triton X-100 | Thermofischer Scientific | 13454259 | Detergent for Cell lysis |
Trypsin-EDTA solution | Sigma | T4049 | For tissue culture |
Whatman Filter Paper | Merck | WHA1001325 | For Western Blot and IF |
XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System | Invitrogen | EI0001 | For Western Blotting |
Zen Black edition | Zeiss | / | Used to operate the LSM 880 |