تصوير ATG9A ، وهو بروتين غشائي متعدد الامتدادات
Summary
يصف هذا البروتوكول الطرق المختلفة التي يمكن أن تساعد في دراسة بيولوجيا ATG9A ، بما في ذلك التألق المناعي متبوعا بتحليل الصور ، واعتبارات التعبير المفرط العابر ، والتحقيق في حالة الغليكوزيل ATG9A باستخدام اللطخة الغربية.
Abstract
الالتهام الذاتي هو مسار محفوظ للغاية تستخدمه الخلية للحفاظ على التوازن ، وتدهور العضيات التالفة ، ومكافحة مسببات الأمراض الغازية ، والبقاء على قيد الحياة في الحالات المرضية. مجموعة من البروتينات ، تسمى بروتينات ATG ، تشتمل على آلية الالتهام الذاتي الأساسية وتعمل معا في تسلسل هرمي محدد. حسنت الدراسات في السنوات الأخيرة معرفتنا بمسار الالتهام الذاتي. في الآونة الأخيرة ، تم اقتراح أن حويصلات ATG9A تقع في قلب الالتهام الذاتي ، لأنها تتحكم في التوليف السريع من جديد لعضية تسمى البلعمة. أثبتت دراسة ATG9A أنها صعبة ، لأن ATG9A هو بروتين عبر الغشاء ، وهو موجود في مقصورات غشائية مختلفة. على هذا النحو ، فإن فهم الاتجار بها هو عنصر مهم لفهم الالتهام الذاتي. هنا ، يتم تقديم طرق مفصلة يمكن استخدامها لدراسة ATG9A ، وعلى وجه الخصوص ، توطينها باستخدام تقنيات التألق المناعي ، والتي يمكن تقييمها وقياسها. كما يتم تناول مخاطر الإفراط في التعبير العابر. يعد التوصيف الصحيح لوظيفة ATG9A وتوحيد التقنيات لتحليل الاتجار بها أمرا بالغ الأهمية لزيادة توصيف الأحداث التي تحكم بدء الالتهام الذاتي.
Introduction
ATG9A هو البروتين الوحيد عبر الغشاء لآلية الالتهام الذاتي الأساسية ويتم الاتجار به بين جولجي وحجرة حويصلة ATG9A الخلوية ، ويمر عبر المقصورة الاندوسومية1. بعد أن كان غامضا منذ فترة طويلة ، تم وصف ATG9A مؤخرا بأنه يعمل على أنه تدافع الدهون ، لأنه يوازن الدهون عبر طبقات الغشاءالثنائية 2,3. من الواضح الآن أن ATG9A يقع في الجزء العلوي من التسلسل الهرمي في تكوين البلعمة الذاتية ، وبالتالي فإن دراسته حيوية لفهم الالتهام الذاتي 4,5. على هذا النحو ، تم اقتراح حويصلات ATG9A مؤخرا على أنها “بذرة” البلعمة الذاتية 6,7. ومع ذلك ، فقد أظهرت الدراسات السابقة أن ATG9A يتفاعل بشكل عابر فقط مع البلعمة الذاتية المشكلة في خطوات مختلفة من نضجه ولا يندمج في غشاء الالتهام الذاتي6،8،9،10،11. وبالتالي ، هناك حاجة إلى مزيد من التحقيقات للكشف تماما عن الدور والوظائف المتعددة المحتملة ل ATG9A في تكوين البلعمة الذاتية. ومع ذلك ، لا يمكن حل التناقض بين النماذج الحالية والبيانات السابقة إلا من خلال التجارب المستهدفة التي تعالج الاتجار ب ATG9A باستخدام مناهج كمية تم التحقق من صحتها وعلامات داخل الخلايا.
هناك العديد من الأدوات المستخدمة لدراسة ATG9A ، ولكل منها مزايا وعيوب ، واستخدام هذه الأدوات معقد بسبب بنية ATG9A ووظيفتها الجزيئية والاتجار الخلوي2،8،12. يشكل ATG9A متجانسا ، وهو جليكوزيلاتي ، ويتم تهريبه في جميع أنحاء الخلية إلى مقصورات مثل جولجي ، والإندوسومات ، وغشاء البلازما13,14. نظرا لمسار الرحلة المعقد ، هناك العديد من التحديات في تفسير القراءات مثل تشتت ATG9A من Golgi على علاجات أو محفزات محددة (مثل المغذيات وتجويع المصل). ATG9A دينامية للغاية من حيث الاتجار الحويصلي. في الواقع ، تم تعريف الحويصلات المحتوية على ATG9A على أنها حجرة ATG9A في سياق الالتهام الذاتي الناجم عن الجوع. تتفاعل حجرة ATG9A ، التي تشكلها هذه الحويصلات الديناميكية ، بشكل عابر مع العديد من العضيات داخل الخلايا8،15،16،17. يجب أن تساعد التقنيات الموصوفة هنا ، بما في ذلك التألق المناعي والتصوير الحي ومقايسات الجليكوزيل ، في اكتشاف وفهم بيولوجيا ATG9A. على وجه الخصوص ، ستساعد الأساليب الموضحة في هذه المقالة في معالجة الأسئلة المتعلقة بالتوطين إلى مقصورات خلوية محددة والتفاعلات مع شركاء بروتين محددين و / أو مقصورات غشائية. نظرا لأن المجال الأساسي المحفوظ الكارهة للماء ATG9A (مجال PFAM PF04109) له طوبولوجيا فريدة ودورات ATG9A بين عدة مقصورات غشائية ، يجب أن يكون الباحثون على دراية ببعض المزالق والتحف عند الإفراط في التعبير عن ATG9A بشكل عابر ، بما في ذلك ، على سبيل المثال لا الحصر ، الاحتفاظ بالشبكة الإندوبلازمية (ER). قد تنشأ مشكلات محتملة أخرى بسبب اختلال البروتين ، أو التجميع الاصطناعي في ظروف النمو العادية ، أو عدم كفاية الكشف عن المقصورة الحويصلية بسبب بروتوكولات النفاذية دون المستوى الأمثل للتألق المناعي.
عند تصوير ATG9A الداخلي ، يجب توخي الحذر في إعداد العينة والحصول على الصور لضمان جودة التحليل الكمي اللاحق والتفسير الصحيح للبيانات. يجب أن يؤدي الجمع بين التقنيات الموضحة في هذه المقالة مع الأساليب الكيميائية الحيوية القياسية (مثل الترسيب المناعي أو التجارب المنسدلة غير الموصوفة هنا) إلى تحسين فهمنا لوظيفة ATG9A. تهدف مجموعة الأدوات التجريبية هذه إلى مساعدة الباحثين الجدد على التنقل في بعض المقايسات المطلوبة لتحديد وظيفة ATG9A في نظامهم البيولوجي.
Protocol
Representative Results
Discussion
توضح هذه الدراسة الأدوات المختلفة التي يمكن استخدامها للتحقيق في توطين ATG9A. أولا ، تصف هذه الدراسة كيف يمكن تصور ATG9A عن طريق التألق المناعي وكيف يمكن قياس ذلك. ثانيا ، تتم مقارنة الاستراتيجيات التي يمكن استخدامها لوضع علامة ATG9A بعلامة الفلورسنت للتصور في الخلايا الثابتة أو الحية. أخيرا ، يصف هذا العمل كيفية التحقيق في حالة الغليكوزيل الخاصة ب ATG9A واستخدامها لتحديد ما إذا كان ATG9A قد خرج من ER وتم الاتجار به عبر Golgi.
فيما يتعلق بتوصيف توطين ATG9A الداخلي عن طريق التألق المناعي ، يجب توخي الحذر مع طرق التثبيت والنفاذية المستخدمة في التجربة. وفقا للإجراءات القياسية الموصوفة هنا ، يعد تثبيت بارافورمالدهيد إلى جانب نفاذية الديجيتونين ظروفا جيدة لتصور كل من الحويصلات الإيجابية ATG9A المرتبطة بجولجي و ATG9A7. جنبا إلى جنب مع التثبيت والنفاذية ، فإن توقيت الحضانة مع حل الأجسام المضادة الأولية أمر بالغ الأهمية أيضا. لقد لاحظنا ، ولكن لم يتم توثيقه ، أن التركيزات الأعلى من محلول الأجسام المضادة الأولية وأوقات الحضانة الأطول يمكن أن تؤدي إلى زيادة تحريف في تلطيخ جولجي ل ATG9A ، مما يضر في النهاية باكتشاف إعادة توزيع ATG9A إلى مقصورات الغشاء الأخرى. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لوجود ATG9A في العديد من المقصورات داخل الخلايا1،13،17،22،23،24،27،28 ، فمن المهم استخدام علامات غشاء محددة ، جنبا إلى جنب مع ATG9A ، لتحديد مكان وجود ATG9A. تم استخدام العديد من الأساليب في الماضي لتحديد توطين ATG9A ، بما في ذلك معامل ارتباط بيرسون للتمركزالمشترك 29. ومع ذلك ، فإن التداخل الجزئي ل ATG9A مع Golgi والمقصورة الحويصلية المميزة يؤدي إلى عدد كبير من القيم المتطرفة للبكسل ، مما قد يؤدي إلى تحيز تفسير معامل الارتباط. لهذا السبب ، يفضل اتباع نهج أكثر بساطة يعتمد على نسبة متوسط التألق في الجزأين المراد تحليلهما ، وهذا النهج أقل حساسية لتباين كل خلية على حدة. لمزيد من المعلومات حول تحليل الصور من خلال الفحص المجهري ، يتم توجيه القراء إلى هذا الكتاب الفصل30.
عند التحقيق في حالة الجليكوزيل ل ATG9A ، من المهم اختيار المواد الهلامية لتشغيل البقع الغربية. بالنسبة لهذا البروتوكول ، يفضل استخدام 3٪ -8٪ من المواد الهلامية Tris-acetate لأنها توفر أعلى دقة للبروتينات الأكبر ، ولكن يمكن أيضا استخدام تركيبات هلام بديلة أو مخازن مؤقتة توفر فصلا جيدا للبروتينات عالية الوزن الجزيئي. يمكن للمجرب ضمان الفصل الأقصى للبروتينات عن طريق زيادة وقت الرحلان الكهربائي.
عند تحضير العينات لتصور ATG9A على اللطخة الغربية ، يجب الحرص على عدم غلي العينات بعد إضافة المخزن المؤقت Laemmli ؛ يؤدي الغليان عند 95 درجة مئوية إلى تكوين مجاميع ATG9A ، وبالتالي ، لا يهاجر ATG9A بكفاءة إلى الجل1. يوصى بتسخين العينات عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق27.
عادة ما تؤدي المستويات العالية من النقل إلى تراكم أعلى ل ATG9A في غرفة الطوارئ ، بينما تساعد مستويات التعبير المعتدلة على التوطين الفسيولوجي للبروتين. من الناحية القصصية ، غالبا ما تساعد أوقات الحضانة البالغة 72 ساعة بدلا من 48 ساعة في تقليل عناصر توطين ER. والجدير بالذكر أن mRFP-ATG9A يمكنه الإبلاغ بدقة عن الاتجار ب ATG9A ووظيفته إذا تم التحكم في المستويات من خلال مستويات التعبير أو باستخدام خطوط خلوية مستقرة8،9،22،27.
يمكن استخدام فشل مجموعة من ATG9A المبالغة في التعبير في الحصول على جليكان ناضج مرتبط ب N كقراءة للاتجار ب ATG9A المضطرب. عند تحور أو حذف مناطق معينة من ATG9A ، هناك خطر زيادة الاحتفاظ ب ER ، مما قد يؤدي إلى الفشل في الحصول على جليكان ناضج مرتبط ب N ، وبالتالي ، نطاق ATG9A أسرع هجرة على اللطخة الغربية. يجب على الباحثين الذين يعملون مع تركيبات ATG9A المقطوعة التحقق من الاحتفاظ ب ER وحالات الجليكوزيل وتوطين Golgi.
بالنسبة لتصوير الخلايا الحية ل ATG9A ، يوفر مجهر Airyscan ، الذي يعتمد على وظيفة Airyscan السريعة ، دقة مثالية تبلغ عادة حوالي 120 نانومتر. للحصول على دقة التعريب ، تكون معدلات الإطارات التي تبلغ حوالي 1-2 إطار في الثانية (fps) في وضع الدقة الفائقة مثالية اعتمادا على عدد القنوات التي يتم تصويرها. يمكن أيضا استخدام المجاهر متحدة البؤر المماثلة التي يمكنها التصوير بسرعة عالية لتصوير حويصلات ATG9A. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن سرعة التصوير يمكن أن تؤثر بشكل مباشر على اكتشاف الأحداث ، وبالتالي تؤثر على تفسير البيانات.
باختصار ، تصف البروتوكولات المقدمة طرقا لتحديد وتوصيف توطين ATG9A عن طريق التألق المناعي ، والفحص المجهري للخلايا الحية ، وحالة الجليكوزيل الخاصة به. يمكن أن تساعد هذه البروتوكولات الباحثين الذين يعملون مع ATG9A وتساعد في تجنب بعض المزالق.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون روكو دانتونو على التدقيق اللغوي لجوانب المخطوطة ، وكذلك جميع الأعضاء الحاليين والسابقين في مختبر بيولوجيا الخلية الجزيئية للالتهام الذاتي (MCBA) على المناقشات التي أدت إلى تحسين هذه البروتوكولات. تم دعم A. V.V. ، S.D.T. ، E.A. ، S.A.T ، من قبل معهد فرانسيس كريك الذي يتلقى تمويله الأساسي من أبحاث السرطان في المملكة المتحدة (CC2134) ، ومجلس البحوث الطبية في المملكة المتحدة (CC2134). تم تمويل هذا البحث كليا أو جزئيا من قبل Wellcome Trust (CC2134). لغرض الوصول المفتوح ، قام المؤلف بتطبيق ترخيص حقوق الطبع والنشر العام CC BY على أي نسخة مخطوطة مقبولة من المؤلف تنشأ عن هذا التقديم.
Materials
| 24 multiwell plates | Falcon | 353047 | For tissue culture |
| 35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated | MATTEK | P35G-1.5-14-C | Cell culture dish for live-cell microscopy |
| 4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | |
| 60 mm tissue culture dish | Thermofischer Scientific | 10099170 | For tissue culture |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermofischer Scientific | A22287 | Actin stain |
| anti-ATG9A antibody | home made | STO-215 | Rabbit anti N-terminal peptide ATG9A |
| anti-Rabbit IgG, peroxidase-linked | Invitrogen | 10794347/NA934-1ml | Secondary antibody for rabbit polyclonal STO-215 |
| anti-RFP antibody | Evrogen | AB233 | for Western Blot |
| ATG9A Monoclonal Antibody (14F2 8B1), Invitrogen | Invitrogen | 15232826 | Antibody for immunofluorescence |
| ATG9A-eGFP | home made | Construct which expresses tagged ATG9A | |
| Bemis Parafilm | Thermofischer Scientific | 11747487 | self-sealing thermoplastic film |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | 5000006 | For determining protein concentration |
| Bovine serum albumin (BSA) | Merck | 10735086001 | For blocking non-specific labelling |
| CaCl2.2H2O | / | For PBS and EBSS | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | Supplement in lysis buffer to prevent protein degradation |
| Cy3 AffiniPure Goat Anti-Armenian Hamster IgG | Jackson ImmunoResearch | 127-165-099 | Secondary antibody for i14F2 8B1 antibody for mmunofluorescence |
| Cyclohexamide | Sigma Aldrich | 66-81-9 | To stop protein translation |
| D-Glucose | / | For EBSS | |
| Digitonin | Merck | 300410 | For permeabilizing cells |
| DMEM | Merck | D6546-6x500ml | For tissue culture |
| eGFP-ATG9A | home made | Construct which expresses tagged ATG9A | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | Supplement for DMEM for cell culture |
| FIJI (ImageJ) | / | https:/fiji.sc/ | Open source image analysis software |
| Hoechst | Thermofischer Scientific | H3570 | Stains the nucleus |
| KCl | / | For EBSS | |
| L-glutamine | Sigma | 67513 | For tissue culture |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | For Cell Transfection |
| LSM880 Airyscan microscope | Zeiss | / | Confocal microscopy |
| MgCl2 | / | For PBS | |
| MgSO4.7H2O | / | For EBSS | |
| Mowiol mounting solution | Millipore | 475904 | for permanent mounting glass coverslips |
| NaCl | / | For EBSS | |
| NaH2PO4.2H2O | / | For EBSS | |
| NaHCO3 | / | For EBSS | |
| NuPAGE 3 to 8%, Tris-Acetate, 1.5 mm, Mini Protein Gels | Thermofischer Scientific | EA0378BOX | for Western Blotting |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) | Life Tech | NP0002 | for Western Blotting |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo | 31985062 | For Cell Transfection |
| Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1026 | For fixing cells |
| pcDNA3.1-mCherry-3xFlag-ATG9A | home made | Construct which expresses tagged ATG9A | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | / | For tissue culture | |
| PNGaseF | NEB | P0710S | To remove N-linked glycans |
| Poly-D-lysine hydrobromide mol wt 70,000-150,000 | Merck | P0899 | For coating coverslips |
| Rapid PNGase F enzyme | NEB | P07105 | To remove N-linked glycans |
| RFP-ATG9A | home made | Construct which expresses tagged ATG9A | |
| Triton X-100 | Thermofischer Scientific | 13454259 | Detergent for Cell lysis |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T4049 | For tissue culture |
| Whatman Filter Paper | Merck | WHA1001325 | For Western Blot and IF |
| XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System | Invitrogen | EI0001 | For Western Blotting |
| Zen Black edition | Zeiss | / | Used to operate the LSM 880 |
References
- Young, A. R., et al. Starvation and ULK1-dependent cycling of mammalian Atg9 between the TGN and endosomes. Journal of Cell Science. 119, 3888-3900 (2006).
- Maeda, S., et al. lipid scrambling activity and role in autophagosome formation of ATG9A. Nature Structural & Molecular Biology. 27 (12), 1194-1201 (2020).
- Matoba, K., et al. Atg9 is a lipid scramblase that mediates autophagosomal membrane expansion. Nature Structural & Molecular Biology. 27 (12), 1185-1193 (2020).
- Mercer, T. J., Gubas, A., Tooze, S. A. A molecular perspective of mammalian autophagosome biogenesis. Journal of Biological Chemistry. 293 (15), 5386-5395 (2018).
- Yamamoto, H., Zhang, S., Mizushima, N. Autophagy genes in biology and disease. Nature Reviews: Genetics. , (2023).
- Sawa-Makarska, J., et al. Reconstitution of autophagosome nucleation defines Atg9 vesicles as seeds for membrane formation. Science. 369 (6508), (2020).
- Melia, T. J., Lystad, A. H., Simonsen, A. Autophagosome biogenesis: From membrane growth to closure. Journal of Cell Biology. 219 (6), 202002085 (2020).
- Orsi, A., et al. Dynamic and transient interactions of Atg9 with autophagosomes, but not membrane integration, are required for autophagy. Molecular Biology of the Cell. 23 (10), 1860-1873 (2012).
- Judith, D., et al. ATG9A shapes the forming autophagosome through Arfaptin 2 and phosphatidylinositol 4-kinase IIIbeta. Journal of Cell Biology. 218 (5), 1634-1652 (2019).
- Karanasios, E., et al. Autophagy initiation by ULK complex assembly on ER tubulovesicular regions marked by ATG9 vesicles. Nature Communications. 7, 12420 (2016).
- Koyama-Honda, I., Itakura, E., Fujiwara, T. K., Mizushima, N. Temporal analysis of recruitment of mammalian ATG proteins to the autophagosome formation site. Autophagy. 9 (10), 1491-1499 (2013).
- Guardia, C. M., et al. Structure of human ATG9A, the only transmembrane protein of the core autophagy machinery. Cell Reports. 31 (13), 107837 (2020).
- Soreng, K., et al. SNX18 regulates ATG9A trafficking from recycling endosomes by recruiting Dynamin-2. EMBO Reports. 19 (4), e44837 (2018).
- Staudt, C., Gilis, F., Boonen, M., Jadot, M. Molecular determinants that mediate the sorting of human ATG9A from the endoplasmic reticulum. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1863 (9), 2299-2310 (2016).
- Knaevelsrud, H., Carlsson, S. R., Simonsen, A. SNX18 tubulates recycling endosomes for autophagosome biogenesis. Autophagy. 9 (10), 1639-1641 (2013).
- Takahashi, Y., et al. The Bif-1-Dynamin 2 membrane fission machinery regulates Atg9-containing vesicle generation at the Rab11-positive reservoirs. Oncotarget. 7 (15), 20855-20868 (2016).
- Imai, K., et al. Atg9A trafficking through the recycling endosomes is required for autophagosome formation. Journal of Cell Science. 129 (20), 3781-3791 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- van Vliet, A. R., et al. ATG9A and ATG2A form a heteromeric complex essential for autophagosome formation. Molecular Cell. 82 (22), 4324-4339 (2022).
- Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. Bradford assay for determining protein concentration. Cold Spring Harbor Protocols. 2020 (4), 102269 (2020).
- Kurien, B. T., Scofield, R. H. Validating antibody specificities for immunohistochemistry by protein blotting. Methods in Molecular Biology. 2593, 21-33 (2023).
- Lamb, C. A., et al. TBC1D14 regulates autophagy via the TRAPP complex and ATG9 traffic. EMBO Journal. 35 (3), 281-301 (2016).
- Longatti, A., et al. TBC1D14 regulates autophagosome formation via Rab11- and ULK1-positive recycling endosomes. Journal of Cell Biology. 197 (5), 659-675 (2012).
- Ravussin, A., Brech, A., Tooze, S. A., Stenmark, H. The phosphatidylinositol 3-phosphate-binding protein SNX4 controls ATG9A recycling and autophagy. Journal of Cell Science. 134 (3), (2021).
- DesMarais, V., Eddy, R. J., Sharma, V. P., Stone, O., Condeelis, J. S. Optimizing leading edge F-actin labeling using multiple actin probes, fixation methods and imaging modalities. BioTechniques. 66 (3), 113-119 (2019).
- Ennis, H. L., Lubin, M. Cycloheximide: Aspects of inhibition of protein synthesis in mammalian cells. Science. 146 (3650), 1474-1476 (1964).
- Webber, J. L., Tooze, S. A. Coordinated regulation of autophagy by p38alpha MAPK through mAtg9 and p38IP. EMBO Journal. 29 (1), 27-40 (2010).
- Claude-Taupin, A., et al. ATG9A protects the plasma membrane from programmed and incidental permeabilization. Nature Cell Biology. 23 (8), 846-858 (2021).
- Aaron, J. S., Taylor, A. B., Chew, T. L. Image co-localization – Co-occurrence versus correlation. Journal of Cell Science. 131 (3), 211847 (2018).
- D’Antuono, R., Nechyporuk-Zloy, V. Basic digital image acquisition, design, processing, analysis, management, and presentation. Principles of Light Microscopy: From Basic to Advanced. , 77-104 (2022).
