쥐 장 오가노이드의 생성과 조작

알림: 모든 세포 배양은 조직 배양 후드에서 적절한 무균 기술을 사용하여 처리해야 합니다. 이 연구의 모든 동물 연구는 Yale의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다. 1. 세포 배양 시약의 제조 제조업체의 지침에 따라 R-spondin 1 컨디셔닝 미디어를 준비합니다. 제조업체의 지침에 따라 Wnt3a 컨디셔닝된 미디어를 준비합니다. 표 1에 설명된 대로 AdDMEM+를 준비합니다. 가스트린을 멸균 dH2O에 재현탁시켜 100μM 스톡을 준비합니다. 분취하여 -80 °C에서 보관하십시오. N-아세틸시스테인을 멸균수에 재현탁시켜 100mM 스톡을 준비합니다. 분취 및 -20 °C에서 최대 1개월 동안 보관하십시오. 인산염 완충 식염수 (PBS) + 0.1 % 소 혈청 알부민 (BSA)에 재조합 인간 Noggin을 재현탁시켜 250 μg / mL 스톡을 준비합니다. 분취하여 -80 °C에서 보관하십시오. PBS + 0.1% BSA에서 재조합 마우스 표피 성장 인자(EGF)를 재현탁하여 100μg/mL 스톡을 준비합니다. 분취하여 -80 °C에서 보관하십시오. 재조합 인간 IGF-1을 PBS + 0.1% BSA에 희석하여 100μg/mL 스톡을 준비합니다. 분취하여 -80 °C에서 보관하십시오. 재조합 인간 FGF-2를 5mM Tris, pH 7.6에 재현탁시켜 100μg/mL 스톡을 준비합니다. 분취하여 -80 °C에서 보관하십시오.참고: 모든 성장 인자에 대해 PBS + 0.1% BSA의 중간 희석액을 배양 배지의 최종 농도의 100배로 사용합니다. -20 °C에서 보관하십시오. 2. 쥐 소장 오가노이드 구축 참고: 이 프로토콜은 쥐 장 오가노이드23,24에 대해 이전에 발표된 두 가지 프로토콜에서 수정되었습니다. 표 2에 따라 쥐의 장 오가노이드 배지(rIOM)를 준비하고 37°C의 수조를 설정합니다. 이 완전한 배지는 4°C에서 5일 동안 안정적입니다. PBS에서 15mL 원뿔형 튜브에 10mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 10mL를 준비하고 얼음 위에 보관합니다. 얼음 위에서 250μL의 세포외 기질 추출물(EME)을 해동합니다. 하룻밤 사이에 쥐를 단식하고 물을 마실 수 있습니다. IACUC가 승인한 프로토콜에 따라 쥐를 안락사시킵니다. 이 프로토콜에서 성인 수컷 Sprague Dawley 쥐(체중~200g)는CO2 흡입을 통해 안락사되었습니다(재료 표). 자궁경부 탈구는 안락사의 2차 방법으로 사용되었다. 해부를 위해 멸균 오토클레이브 겸자와 해부 가위를 사용하십시오. 안락사된 쥐를 해부면의 복부 면이 위로 향하게 놓습니다. 집게로 피부층을 꼬집습니다. 다음 절개는 표면 수준에서 이루어져야 하므로 이 피부층만 절개하고 내부 장기를 손상시킬 만큼 깊지 않습니다. 복강을 열려면 크고 날카로운 해부 가위를 사용하여 복부 중앙의 크고 세로로 표면 높이를 절단하여 피부층을 절단합니다. 다음으로, 그 절단에서 벗어나 양쪽에 하나씩 두 개의 더 짧은 수평 절단을 만듭니다. 집게를 사용하여 피부를 벗겨내어 복강을 노출시킵니다. 복막(peritoneal membrane)을 절단하여 복강의 내부 장기를 완전히 노출시켜 장에 쉽게 접근할 수 있도록 합니다. 가위와 집게를 사용하여 위의 위치를 찾고 약 2-3cm 원위부의 십이지장을 식별하면 노란색 분절로 나타납니다. 근위 jejunum은 Treitz 인대에서 약 4-5cm 원위부에 위치하며, 십이지장과 jejunum 사이의 랜드 마크 역할을합니다. 분리된 장 조각을 10cm 페트리 접시에 담습니다. 장간막의 원하는 장 부분을 가능한 한 많이 청소하십시오. 발광 내용물이 제거될 때까지 얼음처럼 차가운 PBS 10mL로 씻어냅니다. 종이 타월에 장 부분을 ~ 2cm 길이로 자릅니다. 각 장 조각을 세로로 열어 상피를 노출시킵니다. 유리 현미경 슬라이드를 사용하여 노출된 내강 표면을 긁어 융모를 제거합니다. 얼음 위에 준비된 EDTA 용액에 장 조각을 넣습니다. 4rpm으로 설정된 튜브 리볼버에서 30분 동안 10°C로 회전합니다. 해부 현미경에서 원뿔형 튜브의 내용물을 10cm 페트리 접시에 붓습니다. 얼음처럼 차가운 PBS를 ~5mL를 추가합니다. 미세한 집게를 사용하여 장 부분을 잡고 세게 흔듭니다. 상피가 PBS로 방출되는 것을 볼 수 있습니다. 처음에 PBS는 주로 융모를 포함합니다. 계속 흔듭니다. 융모가 함유된 PBS를 주기적으로 버리고 10mL의 신선한 얼음처럼 차가운 PBS를 장 조각에 추가합니다. 조각을 계속 흔들고 융모가 더 이상 PBS로 방출되지 않고 대신 PBS에 주로 크립트가 포함될 때까지 이 세척 단계를 반복합니다. 세포 생존력이 손상되지 않도록 crypt 분리의 경우 15분을 초과하지 마십시오. 남은 장 조각은 버립니다. 장 크립트를 위해 페트리 접시에 남아 있는 PBS를 풍부하게 합니다. 조직 배양 후드에서 PBS 함유 크립트를 수집하고 70μm 세포 스트레이너를 통해 여과합니다(재료 표). 250 x g 에서 5분 동안 원심분리기 상층액을 제거하고 펠릿을 5mL의 AdDMEM+에 재현탁시킵니다. 250 x g 에서 5분 동안 다시 원심분리합니다.알림: 스윙 버킷 로터가 있는 원심분리기를 사용하는 것이 좋습니다. 상층액을 제거하고 펠릿과 함께 ~50μL의 배지를 남깁니다. 펠릿을 나머지 매체에 다시 현탁시키고 얼음 위의 EME 부분 표본에 추가합니다. EME 전체에 크립트가 고르게 매달릴 수 있도록 위아래로 부드럽게 피펫팅합니다. 거품이 생기지 않도록 하십시오. 50μL의 EME 돔을 35mm 조직 배양 접시에 담고 37°C, 5%CO2 조직 배양 인큐베이터에서 20분 동안 배양합니다. 10μM Y27632 및 10μM CHIR99021를 포함하는 2mL의 rIOM(표 2)을 추가합니다(표 3). 통과 후 Y27632 및 CHIR99021는 중단될 수 있습니다. 2-3일마다 rIOM을 변경합니다. 필요에 따라 통과하며, 일반적으로 초기 오가노이드 수, 크기 및 성장 속도에 따라 3-7일 사이입니다. 3. 쥐의 장 오가노이드 통과 얼음 위에서 EME 250μL 부분 표본을 해동하고 rIOM을 37°C로 예열합니다. 오가노이드가 포함된 35mm 플레이트에서 배지를 흡입하고 1mL의 해리 시약을 추가하여 EME 돔에서 오가노이드를 즉시 방출합니다. 조각난 오가노이드가 있는 해리 시약을 15mL 코니컬 튜브로 즉시 옮깁니다. 2mL의 AdDMEM+로 배양 플레이트를 세척하고 조각난 오가노이드가 들어 있는 15mL 코니컬 튜브에 추가합니다. 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 15-20회 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 오가노이드를 조각냅니다. 350 x g 에서 2분 동안 원심분리기 원뿔형 튜브 바닥에서 EME로 ~50μL의 용액을 추가합니다. 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다. 거품을 만들지 마십시오. 50μL의 EME 돔을 35mm 접시에 담고 37°C, 5%CO2 조직 배양 인큐베이터에서 20분 동안 배양합니다. 10 μM Y27632 및 10 μM CHIR99021와 함께 2mL의 rIOM을 추가합니다. 2-3일마다 성장 배지를 교체하십시오. 미디어를 변경할 때 Y27632 및 CHIR99021 생략할 수 있습니다. 4. 쥐 장 오가노이드의 냉동 보존 및 해동 쥐의 장 오가노이드를 냉동 보존하는참고: 동결 보존 프로토콜은 인간 및 마우스 오가노이드25에 대한 이전 프로토콜에서 수정되었습니다. 동결하기 전에 오가노이드는 1차 배양에서 최소 2개의 통로를 가지고 있어야 합니다. 냉동 보존 전에 오가노이드를 큰 스페로이드 또는 약간 싹이 트는 오가노이드 지점까지 성장시키는 것이 좋으며, 이는 해동 후 생존 가능한 오가노이드의 수율을 높일 수 있기 때문입니다. 이는 R-spondin 조절 배지를 15%로 증가시키거나 오가노이드 배양에 10mM 니코틴아미드(표 3)를 첨가하여 달성할 수 있습니다.현미경을 사용하여 35mm 접시의 오가노이드 수를 계산합니다. 200개의 오가노이드가 각 극저온 비알에 분주되도록 극저온 비셜에 라벨을 붙입니다. 35mm 접시에서 rIOM을 제거합니다. 2mL의 저온 조직 배양 등급 PBS로 교체합니다. P1000 팁을 사용하여 위아래로 피펫팅하여 배양 접시 바닥에서 PBS로 EME 돔을 분리합니다. EME를 분해하고 오가노이드를 방출하기 위해 위아래로 20회 피펫팅을 계속합니다. 오가노이드와 PBS를 15mL 코니컬 튜브에 수집합니다. 배양 접시에 2mL의 차가운 PBS를 추가하고 피펫팅을 위아래로 하여 남아 있는 오가노이드를 PBS로 방출합니다. PBS를 15mL 코니컬 튜브로 옮깁니다. 290 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 오가노이드를 펠트합니다. 오가노이드 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 제거하고 폐기하십시오. 5mL의 차가운 AdDMEM+에 부드럽게 재현탁하여 펠릿을 세척합니다. 200 x g 에서 4분 동안 원심분리기 상층액을 조심스럽게 제거하고 폐기하십시오. 오가노이드 펠릿을 200개의 오가노이드당 1mL의 저온 동결 배지에 재현탁시킵니다. 라벨링된 cryovial당 동결 배지에서 1mL의 오가노이드를 분취합니다. 냉동 용기에 냉동 용기를 넣습니다. 오가노이드를 -80°C의 냉동 용기에 24시간 동안 보관한 다음 극저온 수소를 액체 질소로 옮겨 장기간 보관합니다. 쥐 장 오가노이드 해동참고: 이 프로토콜은 인간 및 마우스 장 오가노이드26을 해동하기 위한 이전 프로토콜에서 수정되었습니다.얼음 위에서 EME 250μL 분취액을 해동합니다. 15% R-spondin 컨디셔닝 배지, 10μM Y27632 및 10μM CHIR99021로 보충된 rIOM을 준비합니다. 37 °C에서 데우십시오. 실온에서 2mL의 원뿔형 튜브에 해동 배지(표 3)(표 3)를 추가합니다. 바이알이 거의 완전히 해동될 때까지 바이알을 37°C 수조에 넣어 액체 질소에서 오가노이드 바이알을 회수하고 해동합니다. 바이알에 해동 배지 1mL를 추가하고 모든 내용물을 해동 배지가 들어 있는 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 1mL의 해동 배지로 바이알을 두 번 세척하고 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 200 x g 에서 5분 동안 원심분리기 매체를 흡인하고 오가노이드에 ~50μL의 매체를 남깁니다. 오가노이드가 포함된 배지를 250μL의 EME로 옮깁니다. 기포를 피펫팅하여 EME를 통해 오가노이드를 고르게 분배합니다. 6개의 50μL 돔을 35mm 조직 배양 접시에 피펫팅합니다. EME가 중합될 수 있도록 조직 배양 인큐베이터에서 15-20분 동안 배양합니다. 준비된 rIOM 2mL를 접시에 추가합니다. 2일 후 미디어를 rIOM으로 교체합니다. Y27632 및 CHIR99021의 사용을 일시 중단할 수 있습니다. 오가노이드 성장은 해동 후 첫 번째 통로에서 느릴 수 있습니다. 실험을 시작하기 전에 해동 후 오가노이드를 두 번 통과시키는 것이 좋습니다. 5. 3D 오가노이드에서 쥐 장 2D 단층 생성 참고: 다음 프로토콜은 ~300개의 장 오가노이드/돔(스케일: 하나의 돔이 4개의 웰을 생성함)을 포함하는 50μL(35mm 접시)의 6개 돔으로 시작하여 EME로 코팅된 48웰 플레이트의 24개 웰을 생성하는 데 필요한 부피를 설명하지만 필요에 따라 확장 또는 축소할 수 있습니다. 쓰여진 바와 같이이 프로토콜은 4-5 일 안에 ~ 80 %의 합류를 달성합니다. 밀도가 높을수록 세포는 3D 오가노이드 구조를 다시 획득하기 시작합니다. 낮은 합류도(≤40%)에서 세포는 단층으로 남아 있으며 ~14일 동안 생존할 수 있습니다. 연구의 목적이 2D 단층을 사용하는 것이라면 하나의 돔이 24웰 플레이트의 8웰을 생성하도록 축소합니다. 웰은 또한 콜라겐 I로 코팅되어 단층을 형성할 수 있습니다. 코팅된 표면의 준비플레이트를 EME로 코팅하려면 EME를 차가운 AdDMEM+에 1:20으로 희석합니다(표 1). 콜라겐 코팅을 위해 제조업체의 지침에 따라 콜라겐 I을 준비하십시오. AdDMEM+에서 5mg/mL 콜라겐 I을 100μg/mL(이 경우 1:50)로 희석합니다. 200μL의 희석된 EME 또는 콜라겐으로 플레이트를 코팅하여 웰 표면을 완전히 덮습니다. 조직 배양 인큐베이터에서 37°C에서 1-2시간 동안 배양합니다. 표 4에 따라 2D 단층 배양(rIOM2D)을 위한 쥐 장 오가노이드 배지를 준비합니다. 단층 생성오가노이드가 들어 있는 35mm 플레이트에서 배지를 흡입합니다. PBS 1mL를 추가합니다. P1000 팁으로 긁어 우물의 EME를 방해합니다. 피펫을 위아래로 약 20회 움직여 모든 EME를 풉니다. 모든 것을 15mL 코니컬 튜브로 옮깁니다. 35mm 플레이트에 PBS 1mL를 추가하여 추가 오가노이드를 회수하고 동일한 15mL 코니컬 튜브로 옮깁니다. 350 x g 에서 2분 동안 원심분리하고 EME 잔류물을 포함한 상층액을 흡입합니다. 오가노이드 펠릿에 트립신 용액 1mL를 추가하고 37°C에서 2분 동안 배양합니다. P1000 팁을 사용하여 위아래로 10회 피펫팅하고 AdDMEM+ 2mL를 추가하여 트립신을 중화합니다. 350 x g 에서 5분 동안 원심분리기 상층액을 흡인하고 4.8mL의 rIOM2D를 추가합니다(표 4). 세포 펠릿을 재현탁시킵니다. 오가노이드를 배치하기 전에 웰에서 AdDMEM+의 과도한 EME 또는 콜라겐을 제거합니다. 그런 다음 rIOM2D에 200μL의 오가노이드와 10μM Y27632를 사전 코팅된 각 웰에 추가합니다. 4-16시간 후 배지와 원심분리기를 1,000 x g 에서 1분 동안 수집합니다. 상층액을 새 15mL 코니컬 튜브로 옮기고 펠릿을 버립니다. 각 웰을 300μL의 PBS로 세척하고 원심분리된 rIOM2D 200μL를 각 웰에 추가합니다. 2-3일마다 rIOM2D를 교체하고 Y27632의 사용을 일시 중단합니다. 2D 단층에서 3D 오가노이드 개질참고: EME에서 성장한 단층은 3D 오가노이드를 재형성하도록 유도할 수 있는 반면, 콜라겐 I에서 성장한 단층은 3D 오가노이드로 효율적으로 돌아가지 않습니다. 일반적으로 단층에서 생성된 오가노이드 2-3웰을 사용하여 5일차에 50μL의 EME 돔 하나를 만들 수 있습니다.EME를 rIOM1D에서 4:2로 희석합니다. 단층이 ~80% 밀도에 도달하면 배지를 조심스럽게 흡입하고 단층이 포함된 웰에 100μL의 희석된 EME를 추가합니다. 37 °C, 5 % CO2 조직 배양 인큐베이터에서 20 분 동안 배양 합니다. 그런 다음 100μL의 rIOM2D를 추가하고 조직 배양 인큐베이터로 돌아갑니다. 3D 오가노이드는 희석된 EME를 첨가한 후 5일 이내에 생성됩니다. 작은 오가노이드가 재형성된 후(~5일차) rIOM을 준비합니다. 모든 웰 내용물을 수집하고, 위아래로 피펫팅하여 EME를 방해하고, 15mL 코니컬 튜브로 옮깁니다. 350 x g 에서 2분 동안 원심분리기 상층액과 EME 잔류물을 흡인합니다. 차가운 AdDMEM+ 1mL를 넣고 350 x g 에서 2분 동안 원심분리합니다. ~50μL의 배지를 남기고 상층액을 제거합니다. 50μL의 배지 및 오가노이드를 250μL EME 부분 표본으로 옮깁니다. 피펫을 위아래로 움직여 EME 전체에 오가노이드를 분배합니다. 50μL의 EME 돔을 35mm 접시에 피펫팅하고 조직 배양 인큐베이터에서 20분 동안 배양합니다. 2mL의 rIOM에 10μM Y27632를 추가합니다. 2-3일마다 성장 배지를 교체하십시오. 미디어를 변경할 때 Y27632를 생략할 수 있습니다. 6. 유전자 조작 2D 단층의 과도 transfection주의: 섹션 5.1에 따라 48웰 플레이트에서 쥐의 장 상피 단층을 준비합니다. transfection은 70%-80% 밀도에서 수행해야 합니다. transfection하기 전에 항상 well의 배지를 200μL의 새 rIOM2D로 교체하십시오. 플라스미드 DNA의 260/280 nm 및 260/230 nm 흡광도를 계산합니다. 이 수치는 1.8 이상이어야 우수한 transfection 결과를 얻을 수 있습니다.NOTE: plasmid control을 사용하여 transfection의 효율을 계산합니다. 형광 단백질을 암호화하는 플라스미드를 사용하는 것이 좋습니다. 이 프로토콜에서는 pLJM1-EGFP27 을 사용하였다.1mg/mL의 20kDa 폴리에틸렌시민(PEI; 표 3). 각 웰에 대해 튜브 A(플라스미드 0.6μg + 환원 혈청 배지 50μL)와 튜브 B(PEI 1.8μL + 환원 혈청 배지 50μL)를 준비합니다. DNA:PEI 비율을 1:3으로 유지합니다. 30초 동안 두 튜브를 모두 소용돌이칩니다. 튜브 A와 튜브 B를 결합하고 다시 30초 동안 소용돌이칩니다. 필요한 경우 원심분리기를 사용하여 회전합니다. 실온에서 20분 동안 배양합니다. DNA/PEI 복합체를 2D 단층에 적하 방향으로 부드럽게 추가합니다. 접시를 부드럽게 휘저어 섞습니다. 37 °C, 5 % CO2 에서 배양합니다. 이 발현은 일반적으로 24시간 후에 감지할 수 있습니다.참고: 3D 오가노이드 구조로 돌아가야 하는 경우 transfection 후 희석된 EME를 추가하기 위해 48시간 동안 기다리십시오. 쥐 장 오가노이드의 렌티바이러스 형질도입참고: 렌티바이러스를 사용하기 전에 해당 기관에서 적절한 승인과 전문 교육을 받으십시오. 렌티바이러스를 취급할 때는 항상 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용하십시오. 여기에 설명되어 있지는 않지만, 고품질의 농축 렌티바이러스는 오가노이드의 성공적인 감염에 필수적입니다. 이 프로토콜은 빈 pLJM1-EGFP 벡터를 사용했습니다.27 가용성 GFP를 발현합니다. 이 프로토콜은 이전에 게시된 프로토콜에서 수정되었습니다28. transduction 효율은 바이러스 입자의 품질과 농도, 오가노이드를 작은 세포 클러스터로 효율적으로 분리하고 발현되는 유전자에 따라 달라집니다. 감염 5일 후 계산했을 때, 선택 전 평균 형질도입 효율은 19.4%(± 6.5% 표준편차)였다.렌티바이러스 감염 2일 전, 형질도입될 각 렌티바이러스에 대해 24웰 플레이트의 조밀한 웰 2개를 통과할 계획(섹션 3)합니다. 24웰 플레이트의 각 웰은 EME의 50μL 돔 1개를 수용할 수 있습니다. EME가 응고되면 10mM 니코틴아미드, 10μM Y27632 및 2.5μM CHIR99021가 보충된 0.5mL의 rIOM을 추가합니다. 이는 큰 스페로이드 형태를 유도하며, 이는 렌티바이러스 형질도입의 효율성에 유리합니다. 도금 후 2일 이내에 쥐 오가노이드는 큰 스페로이드가 되어야 합니다. 유의미한 분화(즉, 발아)가 관찰되면 오가노이드를 다시 통과시킵니다. 농축된 바이러스를 얼음 위에서 해동합니다. 표 3에 따라 새로운 형질주입 배지를 준비합니다. P1000 팁을 사용하여 피펫팅을 위아래로 하여 EME 돔을 세포 배양 접시 바닥에서 배지로 방출합니다. 위아래로 20회 피펫팅을 계속하여 EME를 분해하고 오가노이드를 방출합니다. 오가노이드와 배지를 15mL 코니컬 튜브에 피펫팅합니다. 오가노이드가 동일한 유전자형을 가지고 있고 동일한 계통에서 온 경우 모든 웰을 함께 모을 수 있습니다. 차가운 AdDMEM+ 1mL로 각각 두 번 잘 씻습니다. AdDMEM+를 채취하여 동일한 15mL 코니컬 튜브로 옮깁니다. 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 쥐 오가노이드를 기계적으로 파괴합니다. 이것은 작은 다세포 세포 클러스터가 목표이기 때문에 중요한 단계입니다. 피펫을 위아래로 ~30회 합니다. 4x 대물렌즈를 사용하여 현미경으로 파쇄의 효율성을 확인하십시오. 세포 현탁액이 오가노이드가 거의 남아 있지 않은 세포 클러스터로 주로 구성될 때까지 이 과정을 계속합니다.참고: 또는 오가노이드를 실온에서 200 x g 에서 5분 동안 원심분리하고, 상층액을 조심스럽게 제거하고, 조직 배양 인큐베이터에서 37°C로 예열하여 기존 트립신/EDTA를 대체하는 1mL의 재조합 효소에 재현탁할 수 있습니다. 트립신 보충 오가노이드를 37°C 수조에서 2분 동안 배양하고 해리를 촉진하기 위해 정기적으로 볼텍싱합니다. 트립신 대체품으로 장기간 배양하면 세포 사멸을 촉진할 수 있으므로 피하십시오. 4x 대물렌즈를 사용하여 현미경으로 파괴의 효율성을 정기적으로 확인하십시오. 현탁액이 세포 배양이 거의 없는 주로 단일 세포로 구성된 경우 AdDMEM+ 4mL를 추가하여 트립신 대체물을 희석하고 다음 단계를 진행합니다. 세포 클러스터가 들어 있는 15mL 코니컬 튜브를 200 x g 에서 4°C에서 5분 동안 회전시킵니다. 세포 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서 상층액을 조심스럽게 제거하고 폐기하십시오. 감염시킬 웰당 230μL의 형질주입 배지에 세포 클러스터를 재현탁시킵니다. 감염의 경우, 각 렌티바이러스에 대해 48웰 플레이트 중 하나의 웰을 사용하십시오. 230μL의 셀 현탁액을 라벨링된 48웰 플레이트의 각 웰에 플레이트합니다. 각 웰에 농축된 바이러스 20μL를 추가합니다. P1000 팁을 사용하여 각 웰에 바이러스/세포 용액을 혼합하고 투명 필름으로 플레이트를 밀봉합니다. 회전 수행: 플레이트를 600 x g 에서 32°C에서 1시간 동안 원심분리합니다. 플레이트의 밀봉을 풀고 37°C, 5% CO2 에서 6시간 동안 배양합니다. 37°C 인큐베이터에서 24웰 플레이트를 예열합니다. 배양 후 각 웰을 위아래로 피펫팅하고 내용물을 라벨링된 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 각각 750μL의 AdDMEM+로 잘 세척하고 튜브로 옮깁니다. 600 x g 에서 4°C에서 5분 동안 튜브를 회전시킵니다. 원심분리기에서 튜브를 제거하고 얼음 위에 보관합니다. P1000 팁을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거하고 적절하게 폐기하십시오. 셀 펠릿을 EME에 재현탁시키고 50μL 돔을 예열된 24웰 플레이트에 플레이트합니다. EME가 중합될 때까지 37°C에서 15-20분 동안 배양합니다. 각 웰에 10mM 니코틴아미드, 10μM Y27632 및 2.5μM CHIR99021가 보충된 500μL의 rIOM을 추가합니다. 감염 1일 후 배지를 rIOM과 10μM Y27632로 교체합니다. 2-3일마다 미디어를 교체하십시오. 선택을 수행하는 경우 감염 후 48-72시간 후에 선택을 추가합니다. 퓨로마이신 선택에는 2μg/mL 퓨로마이신을 사용합니다. 7. 오가노이드의 면역형광 전체 마운트 염색 배지를 흡인하고 PBS-Tween 20(PBS-T)의 4% 파라포름알데히드(PFA)(표 3)를 세포 배양 접시의 오가노이드에 추가합니다. 실온에서 10분 동안 배양합니다. 위아래로 피펫팅하여 EME에서 오가노이드를 방출합니다. 오가노이드를 0.75mL 튜브에 수집합니다. 오가노이드는 몇 분 안에 중력에 의해 튜브 바닥에 가라앉습니다. 필요한 경우 100 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다. 이송 피펫을 사용하여 PFA를 제거하고 PBS-T에 오가노이드를 재현탁시킵니다. 오가노이드가 튜브 바닥에 가라앉도록 합니다. PBS-T를 제거하고 200μL의 블록 용액에 재현탁합니다(표 3). 실온에서 로커 또는 너트레이터에서 45분 동안 배양합니다. 오가노이드는 뭉쳐서 튜브 바닥에 가라앉을 수 있습니다. 주기적으로 튜브를 손가락으로 튕겨 용액 전체에 재현탁 및 분산시킵니다. 오가노이드가 튜브 바닥에 가라앉도록 합니다. 필요한 경우 100 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다. 블록 용액을 제거합니다. 100μL의 블록 용액에 희석된 1차 항체를 추가합니다. 실온에서 너트 믹서에서 24rpm에서 45분 동안 배양합니다. 항체 농도는 사용하는 항체에 따라 다릅니다.참고: 이 단계는 1차 항체에 따라 4°C에서 최대 하룻밤까지 연장할 수 있습니다. 오가노이드가 튜브 바닥에 가라앉도록 합니다. 필요한 경우 100 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다. 전사 피펫을 사용하여 PBS-T에서 5회 세척합니다. 24 rpm의 너트 믹서에서 5 분 동안 실온에서 배양합니다. 이 단계를 두 번 반복합니다. 1:200으로 희석한 2차 항체와 100μL의 블록 용액에 희석한 50μg/mL 4′,6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)을 추가합니다. 실온에서 너트 믹서에서 24rpm에서 30분 동안 배양합니다. 오가노이드가 튜브 바닥에 가라앉도록 합니다. 필요한 경우 100 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다. 2차 항체를 제거합니다. 전사 피펫을 사용하여 PBS-T에서 5회 세척합니다. 24 rpm의 너트 믹서에서 실온에서 5 분 동안 배양합니다. 세탁 단계를 두 번 반복합니다. 오가노이드를 세척하는 동안 VALAP 실란트(표 3)의 부분 표본(표 3)을 40-50°C에서 가열하여 액화합니다. 붓을 사용하여 현미경 슬라이드에 커버슬립 크기의 얇은 사각형 VALAP을 칠합니다. 22mm x 22mm No. 1.5 커버슬립을 사용합니다. 가위를 사용하여 P200 피펫 팁의 끝을 자릅니다. 오가노이드를 슬라이드의 VALAP 웰로 옮깁니다. 티슈 물티슈를 사용하여 PBS-T를 조심스럽게 닦아냅니다. 오가노이드가 마르지 않도록 하십시오. VALAP을 페이드 방지 장착 매체로 잘 채우십시오(표 3). ~22mm x 22mm 정사각형의 경우 100-150μL의 안티페이드가 필요합니다. 오가노이드는 군집할 수 있습니다. 필요한 경우 피펫 팁으로 안티페이드를 휘저어 오가노이드를 재분배합니다. 22mm x 22mm No. 1.5 커버슬립으로 장착하여 기포를 방지합니다. 가장자리에 VALAP의 얇은 층을 칠하여 커버슬립을 밀봉합니다.참고: 도립 현미경의 경우 오가노이드를 35mm 유리 바닥 접시에 장착할 수도 있습니다. 8. 쥐 장 오가노이드의 Forskolin-induced 팽윤 rIOM에서 통과한 후 3-5일 동안 오가노이드를 성장시킵니다. 동일한 영역을 쉽게 이미지화할 수 있도록 24웰 플레이트에서 오가노이드를 성장시키는 것이 좋습니다. forskolin (T0)의 추가의 앞에 심상을 붙잡으십시오. 포스콜린(표 3)을 오가노이드 배지에 직접 최종 농도 10μM까지 첨가합니다. 동일한 부피의 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 대조군에 추가합니다. 15-30 분마다 일정한 간격으로 대조군 및 forskolin 대우한 우물을 심상하십시오. 이미징을 하지 않을 때는 오가노이드를 인큐베이터에 보관하거나 인큐베이션과 함께 제어된 이미징 시스템을 사용하십시오. 최대 붓기는 120분까지 관찰되어야 합니다. 표준 프로토콜에 따라 획득된 이미지로부터 상대적 팽창을 계산한다29.