大腸菌を用いた長期進化実験における毎日の移動、集団のアーカイブ、および適応度の測定

1. LTEE人口の毎日の転送 注:12のLTEE集団は、前日のフラスコからの培養物の1%を新鮮な培地に接種することによって毎日移されます。このプロセスのステップを図 1 にまとめます。REL606株から開始された6つのAra−集団はA−1からA−6と指定され、REL607株から開始された6つのAra+集団はA+1からA+6と命名される。無菌技術と、集団を移送するためのスケジュールと順序を厳守することで、汚染やその他の混乱のリスクを最小限に抑えることができます。 LTEE転送が行われる表面を、70%エタノールまたは10%漂白剤溶液で拭いて消毒します。ブンゼンバーナーに火をつけて局所的な上昇気流を作り、ガラス製品の炎上を可能にします。注意: 汚染を防ぐために実験用手袋を着用してください。裸火の周りの安全のために、可燃性ではないニトリルのような材料で作られた手袋のみを使用することが重要です。 オートクレーブで洗浄および滅菌された20 mLのホウケイ酸またはポリプロピレンビーカーで覆われた13個の50 mLホウケイ酸三角フラスコを準備します。フラスコに目に見える破片がないか確認し、完全にきれいでないものを交換します。 6つのフラスコに赤いマーカーを使用してA−1からA−6のラベルを付け、他の6つのフラスコに黒いマーカーを使用してA + 1からA + 6のラベルを付けます。最後に残ったフラスコに空白のラベルを付け、月/日の形式の日付と曜日を付けます。 滅菌済みの10 mL血清学的ピペットを使用して、13本のフラスコのそれぞれに9.9 mLのDM25培地を満たします。蓋として機能するビーカーを取り外した後、ビーカーを交換する前に、各フラスコの口に火をつけます。各フラスコを満たす間にピペットの先端を炎上させる。注意: DM25の作成手順はオンラインで入手できます30.プラスチック製の血清学的ピペットを使用する場合は、プラスチックが溶けないように、先端を炎上させるか、炎の中での時間を制限してください。 前日のLTEEフラスコを振とうインキュベーターから取り出します。 各フラスコを光にかざして調べ、濁度と色を評価し、フラスコの完全性を確認し、異物の存在を探します。注:肉眼では、すべてのAra-およびAra+培養物は、培地中のクエン酸塩の成長により、他の培養物よりも~10倍濁るA-3を除いて、ブランクと比較してわずかに濁っているように見えます。多くの外部の微生物汚染物質もクエン酸塩で増殖する可能性があるため、A-3以外の集団の濁度の増加は汚染を示している可能性があります。転送前の LTEE カルチャのイメージについては、「代表的な結果」セクションを参照してください。 オプション:ブランク1 mLと各培養液1 mLを1 cmのプラスチックキュベットにピペッティングし、装置をブランキングした後、分光光度計を使用して600 nm(OD600)で光学濃度を読み取ることにより、各LTEE培養液に予想される濁度があることを確認します。注:この追加の手順は、LTEEを初めて使用する研究者や、濁度を目で判断することに自信がない研究者や、疑わしい異常を文書化して調査する場合に役立ちます。OD600値が期待どおりである場合に増殖し続ける細胞集団を汚染するリスクを最小限に抑えるために、新しいフラスコへのその日の通常の転送(次の手順)を完了した後にのみ、前日のフラスコからOD600を測定するためのサンプルを採取します。LTEE カルチャの一般的な OD600 値については、「 代表的な結果 」セクションを参照してください。 滅菌フィルターチップ付きのP200マイクロピペッターを使用して、各LTEEフラスコから新鮮なDM25を含む対応するフラスコに100 μLの培養液を移します。A−1から始めて、A+1を転送します。その後、-母集団と+母集団を交互に続けます。どの培養物が移されたかを追跡するには、フラスコからピペッティングした後、フラスコを左に移動します。注:Ara−とAra+ の集団間の移動と交替の厳密な順序は、相互汚染と取り違えの防止と検出 に役立ちます。厳格な無菌技術を守ってください:各転写に新しいピペットチップを使用し、キャップを外した直後とリキャップする前にフラスコの口に火をつけ、各転写の間に70%エタノールで湿らせた糸くずの出ない紙ワイプでマイクロピペッターのバレルとエジェクターを拭き取ります。微量でも培養物を殺す可能性があるため、マイクロピペッターの消毒には漂白剤を使用しないでください。 新しく接種したフラスコを37°Cで24±1時間インキュベートし、直径1インチで120 rpmの軌道振とうを行います。 前日からの培養物を4°Cで保存する。 これらのバックアップ カルチャを 2 日間保持します。この時点で3日前に4°Cで保存された古い培養物を破棄します。注:前の2日間の培養物は、必要に応じて、問題や事故が発生した場合、または転送前に前日の培養物の汚染が発見された場合(たとえば、奇妙な着色や予期しない粒子状物質)に実験を再開するための2つの完全なバックアップセットを提供します。 転送ログノートブックに、転送を行った研究者の時間、日付、転送番号、名前またはイニシャル、培養に問題がないかどうか、およびその他の関連情報を入力します。(1)前日のブランクが汚染されている、(2)フラスコまたはその蓋にひびが入ったり壊れたりしている、(3)フラスコに異物が含まれている、(4)移送中にフラスコがひっくり返ったり落下したりした場合、または(5)これらのフラスコからの継続に疑問を投げかけるその他のイベントまたは観察がある場合、手順1.12-1.14に進みます。 前日のLTEE文化に問題、事故、または汚染の疑いがある場合は、それらから転送しないでください。代わりに、12個の培養物のセット全体を4°Cで保存して、後で検査してさらに特性評価します。 前日から移し替えたバックアップ培養液を入れたフラスコを取り出し、4°Cで保存した。 それらをベンチトップに置いて室温に温めます。各フラスコを静かに旋回させて、細胞を再懸濁します。 バックアップフラスコから新鮮な培地を含む新しいフラスコのセットに移し、手順1.6-1.11の説明に従って通常どおり実験を続行します。バックアップ カルチャが使用されたことを転送ログにメモし、前日と同じ転送番号を記録します。注:1つの母集団のフラスコにのみ問題が指摘されている場合でも、すべての集団で経過した世代数が同相に保たれるように、バックアップフラスコから12の集団すべてを転送します。4°Cで保管されたバックアップフラスコに汚染が認められた場合は、母集団サンプルの手順3.1〜3.2で説明されている手順を使用して、影響を受けるLTEE集団を凍結ストックから再開する必要があります。LTEE の転送番号は、復活後の DM25 で最初の培養が成長するまで増分しないでください。 2. LTEE 母集団のアーカイブ 注:LTEE集団のサンプルは、75回の転送ごとに凍結されます。個体群は、100倍の移入希釈後、毎日~6 2/3世代増加するため、この期間は~500世代に相当します。アーカイブ中、LTEE集団は、汚染をチェックするためにさまざまな種類の寒天培地にメッキされます。任意選択で、これらのプレートから代表的なクローンを選び出し、この時点でアーカイブすることができる。これらの手順を 図 1 にまとめます。 凍結予定の前日または数日前に、最小グルコース(MG)、最小アラビノース(MA)、テトラゾリウムアラビノース(TA)の3種類の寒天プレートを準備します。寒天の種類ごとに12枚のプレートに加えて、いくつかのエキストラを作ります。また、少なくとも250 mLの0.85%(w / v)滅菌生理食塩水と50 mLの80%(v / v)滅菌グリセロールを準備します。注:すべてのメディアとソリューションのレシピはオンラインで入手できます30.LTEE が通常のアーカイブ スケジュールの 500 の倍数である世代に達する前日は、最後のフリーズダウンから 74日目 に、問題が検出または疑われるときに 4 °C のバックアップ フラスコからの転送によって追加された日数を加えた日です。 オプション:LTEE集団からクローン分離株をアーカイブする場合は、追加の消耗品を準備します:各集団から3つのクローンを単離するには、72 MGプレート、80 mLの80%(v/v)グリセロール、および370 mLのDM1000が必要です。 計画された凍結の前日に毎日のLTEE転送のステップ1.2を実行するときは、12個のフラスコの追加セットを準備します。追加のフラスコの6つxA−1からxA−6に赤いマーカーを使用してラベルを付け、他の6つのxA + 1からxA + 6に黒いマーカーを使用してラベルを付けます。注:「x」は、追加のフラスコセットがアーカイブに使用されることを示し、LTEEの毎日の転送を並行して継続するために使用される他のフラスコセットと区別します。 毎日のLTEE転送のステップ1.4を実行する場合は、アーカイブに使用する追加のフラスコに、25 mLの血清学的ピペットを使用して14.85 mLのDM25を満たします。 手順 1.5-1.11 の説明に従って、通常の LTEE 転送を完了します。次に、ステップ1.8の手順を繰り返しますが、今回は前日のLTEE培養液のそれぞれから150 μLを、アーカイブに使用する14.85 mLの新鮮なDM25の追加のフラスコに移します。注意: この手順およびそれ以降のすべての手順では、これらのガイドラインに従って汚染や取り違えを避けてください。母集団A−1から始めて、次にA + 1を転送し、次に−母集団と+母集団を交互に続けます。集団を切り替えるときは、70%エタノールで湿らせた糸くずの出ないペーパーワイプでマイクロピペッターのバレルとエジェクターを拭き取ります。フラスコと試験管をトレイまたはラックからピペッティングした後、またはそれらとの間でピペッティングした後、フラスコと試験管を移動して、どの移送が完了したかを追跡します。 ステップ1.9で説明したように、12本のフラスコのセットを37°Cで24±1時間、直径120 rpmの軌道振とうしながら、直径1インチのオービタル振とうしながらインキュベートします。 凍結当日にLTEE転送が実行される少なくとも1時間前に、LTEE集団をメッキするための物資を準備します。12 個の MG、12 個の MA、および 12 個の TA 寒天プレートを選択します。それぞれを目視検査して、明らかな汚染がないことを確認します。 12のLTEE集団(A−1からA + 6)のそれぞれについて、各タイプのプレートの1つにラベルを付けます。注意: プレートにラベルを付けるときは、シャーレの底の側面に書き込みます。これは、寒天の下からコロニーを調べたり写真を撮ったりするときにコロニーを覆い隠さないために重要です。これらは混同される可能性があるため、蓋に書かないでください。 寒天プレートを37°Cのインキュベーターに20分以上入れて温めてから、ステップ2.10で使用します。 9.9mLの生理食塩水を含む24本の試験管を準備します。それぞれ2本のチューブの12セットにそれらを配置します。 プレートと同じ方法で12本の試験管の2セットのそれぞれにラベルを付け、LTEE母集団識別子の下に「1」または「2」を追加して、その母集団の希釈に使用する順序を指定します。 通常どおりLTEEの毎日の転送を継続するフラスコを使用して、手順1.1〜1.11を実行します。ステップ1.5の間に、アーカイブ用の余分な培養物を含む12個のフラスコも振とうインキュベーターから取り出します。 12個の追加のフラスコのそれぞれから培養液100μLをピペットでピペットし、そのLTEE集団について対の生理食塩水を第1試験管にアーカイブする。これらの100倍希釈液でチューブを完全にボルテックスします。次いで、それぞれ100μLを生理食塩水の対応する第2のチューブにピペットで入れる。最終的な10,000倍の培養希釈液を徹底的に渦流します。 10,000倍の培養希釈液を含む各チューブから80 μLをピペットで、その集団の標識されたTA、MG、およびMAプレートにピペットで送ります。好ましいものとして、滅菌散布棒または滅菌散布ビーズのいずれかを使用して、寒天表面全体に液体を均一に広げます。12種類の母集団すべてが3種類の培地すべてにメッキされるまで繰り返します。 必要に応じて、寒天に液体が見えなくなるまでプレートを乾燥させます。プレートを逆さまにして(寒天側を上にして)37°Cに設定した重力対流インキュベーターに入れます。注意: プレートを逆さまにインキュベートすると、寒天が乾燥するのを防ぎ、結露が寒天表面に滴り落ちるのを防ぎます。インキュベーション中に寒天表面上の液体中の細胞が移動すると、コロニーが汚れ、コロニー数が不正確になる可能性があります。 3 mLの滅菌80%(v/v)グリセロールを、アーカイブ用に指定された12個の予備フラスコのそれぞれに加えます。渦巻き、穏やかにボルテックスして完全に混ぜます。 各フラスコから、サンプルの一意の識別子、サンプルが属するLTEE集団、凍結された世代、混合(母集団)サンプルであること、および日付でラベル付けされた滅菌クライオバイアルに混合物を分配します。6 mLを1つの大きなバイアルに、1.25 mLを6つの小さなバイアルのそれぞれにピペットで入れます。注:大きなバイアルは作業ストックです。1つの小さなバイアルは、作業在庫が使い果たされたり汚染されたりした場合のバックアップです。他の5つの小さなバイアルは、他のラボに送ることができるコピーです。 充填したバイアルを-80°Cで凍結します。 24時間および48時間のインキュベーション後のTA、MG、およびMAプレート上のコロニーの成長と形態を調べて文書化します。注:REL606およびREL607の祖先と、76,000世代で播種された12のLTEE集団のそれぞれによって形成されたコロニーの画像と説明については、「 代表的な結果 」セクションを参照してください。 オプション: クローン分離株をアーカイブする場合は、以下のステップを実行します。MGプレートからLTEE集団ごとに3つのクローン分離株(コロニー)を選び、それぞれを新しいMGプレートに別々にストリークし、これらのプレートを37°Cで16〜24時間インキュベートします。注:異なる形態のコロニーが存在する場合、LTEEの標準的な方法は、最初に最も一般的なタイプを選択し、次に少数派タイプからさらにコロニーを選択することにより、最大の多様性をサンプリングすることです。細胞を広げる前にシャーレの底の下側にドットをマークし、成長後に各マークに最も近い分離コロニーを選択することにより、ランダムサンプリング戦略を使用することもできます。 翌日、新しいMGプレート上の各プレートから代表的なコロニーをストリークし、これらのプレートを37°Cで16〜24時間インキュベートします。 翌日、各MGプレートから1つの単離されたコロニーを10mLの新鮮なDM1000を含むフラスコに接種する。また、追加のフラスコに10 mLのDM1000を充填し、培地汚染をテストするための未接種ブランクとして機能します。 フラスコを37°Cで16〜24時間インキュベートし、直径1インチで120 rpmの軌道振とうを行います。 インキュベーション後、2 mLの滅菌80%(v/v)グリセロールを各フラスコに加え、旋回させて混合します。 各フラスコから1.25 mLのアリコートを、各クローンの一意の識別子、LTEE集団、起源の世代、クローンサンプルであること、および日付でラベル付けされた小さな滅菌バイアルに分配します。 充填したバイアルを-80°Cで凍結します。 3.競争力のあるフィットネスアッセイ 注:LTEEでは、生殖適応度は、異なる細菌が毎日の移植と同じ条件下で1つ以上の24時間の培養サイクルにわたって達成する倍増の相対数の観点から定量化されます。具体的には、ある競合他社と別の競合他社の相対的な適応度は、共文化で直接競争するときの実現倍増率の比率です。ペアの各競合他社は、LTEEの凍結された「化石記録」の一部として以前にアーカイブされた完全な集団またはクローン分離株である可能性があります。あるいは、一方または両方の競合相手は、それらの効果をテストするために特定の突然変異を追加または削除するように遺伝子組み換えされたクローンであってもよい。2つの競合相手は、この遺伝子マーカーがこのアッセイ中にそれらを区別するために使用されるため、反対のAra+/Ara- 状態を持っている必要があります。競合アッセイの全体的なワークフローを 図2に示します。共培養フェーズの期間を1日から3日(またはそれ以上)に延長して、ほぼ均等に一致する競合他社間の差をテストする際の適応度推定の精度を向上させることができます。このプロトコルの他の重要な考慮事項と可能な変更については、 Disussion を参照してください。 図2:競合アッセイのフローチャート。 1日コンペティションアッセイの完全な手順を示します。3日間の手順は、1日目と2日目の代替経路を、1日の競技の1日目と同じ方法で3日目にメッキするまで続きます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 備品を準備する使用する競合のLTEE株および/または集団の数、および競合のペアごとに実行される反復競合アッセイの数を決定します。次の手順で説明するように、必要な消耗品を準備します。注:すべてのメディアとソリューションのレシピはオンラインで入手できます30.競技実験のすべての日に必要なフラスコと試験管は、事前に、または使用する日に必要に応じて充填することができます。フラスコと試験管が事前に満たされている場合は、蒸発を最小限に抑えるために、暗所で室温で保管してください。TAプレートは、培養希釈液を広げることができるように、注がれた後に十分に乾燥できるように、使用する少なくとも2日前に準備する必要があります。ピペッティングミス、汚染されたプレート、またはその他の小さな事故が発生した場合に実験を続行できるように、常にいくつかの追加のフラスコ、試験管、およびTAプレートを準備してください。 復活の日(-2日目)には、20 mLビーカーで覆われた滅菌50 mL三角フラスコに、競合他社として使用する大腸菌の 菌 株または集団ごとに9.9 mLのDM1000またはリソジェニーブロス(LB)のいずれかを入れます。もう1つのフラスコに9.9 mLの同じ培地を満たし、未接種のブランクとして機能します。 プレコンディショニング日(-1日目)には、1本の試験管に競技者ごとに9.9 mLの0.85%(w / v)滅菌生理食塩水を、2つのフラスコに2つの競合他社間の反復アッセイごとに9.9 mLのDM25を充填し、もう1つのフラスコに9.9 mLのDM25をブランク用に充填します。 競技開始日(0日目)には、1つのフラスコに9.9 mLのDM25を満たし、1つの試験管に9.9 mLの0.85%(w / v)滅菌生理食塩水を満たし、競技アッセイ複製ごとに1つのTAプレートを準備します。もう1つのフラスコに9.9mLのDM25を入れてブランクとして使用します。 代替案:最初の大会を過ぎた数日間の競技の日ごとに、競技ごとに9.9 mLのDM25を1つのフラスコに充填し、ブランク用に9.9 mLのDM25をもう1つのフラスコに充填します。 競技の最終日(例: 1日目または3日目)には、2本の試験管に9.9 mLの0.85%(w / v)滅菌生理食塩水を満たし、競技の複製ごとに1つのTAプレートを準備します。 -2日目:DM1000またはLBで競技者を個別に復活させる競合他社ごとに、DM1000またはLBのいずれかの9.9 mLで満たされたフラスコにラベルを付けます。 同じ培地のバッチから9.9 mLで満たされた追加のフラスコにラベルを付けて、汚染をテストするための未接種ブランクとして機能します。注:凍結ストックはLBまたはDM1000で復活し、凍結保存された細胞のより均一で予測可能な回収を実現します。凍結保護剤として使用されるグリセロールは 大腸菌によって代謝される可能性があり、サンプルがDM25で復活した場合、予想よりも高い細胞密度につながります。LBおよびDM1000は、この合併症が無視できるほど高い細胞密度への増殖をサポートします。 競合株の凍結ストックを含むクライオバイアルを-80°Cの冷凍庫から取り出します。バイアルを使用している間、バイアルをアイスバケットで冷やしてください。 各凍結ストックが解凍した後、それを徹底的にボルテックスして大腸 菌 細胞を再懸濁します。クローンを復活させる場合は、新鮮な培地を含むフラスコに12 μLの凍結ストックを接種します。集団を復活させる場合は、フラスコに120μLの凍結ストックを接種します。注:120 μL容量の凍結ストックが集団に使用されるため、復活する細胞の数は、LTEE集団の1%が新しいフラスコに移されたときの毎日のボトルネックとほぼ同じになります。凍結ストックを複数回解凍およびボルテックスすると、細胞にストレスがかかり、時間の経過とともにストックの生存率が低下する可能性があります。特定のLTEE集団またはクローンを競技会で複数回使用する場合は、ストックの複数のコピーを再成長させて凍結し、1つのコピーが何度も解凍および再凍結されないようにすることをお勧めします。 リバイバルフラスコとブランクを37°Cで一晩(16〜24時間)インキュベートし、直径1インチで120 rpmの軌道振とうします。 -1日目:DM25で競技者を個別に事前調整する競合他社ごとに、9.9 mLの生理食塩水で満たされた試験管にラベルを付けます。2組の競合他社間の反復競合アッセイごとに、9.9 mLのDM25で満たされた2つの50 mLフラスコに、それぞれ複製番号と競合他社の1人の名前を記載したラベルを付けます。ブランクとして機能するように、9.9 mLのDM25で満たされた1つの追加のフラスコにラベルを付けます。 復活した競合他社の文化を含むフラスコをインキュベーターから取り出します。濁度を目で調べて、成長したこと、明らかな汚染がないことを確認します。 各フラスコからその競技者の生理食塩水の試験管に100μLをピペットで入れます。注:このステップは培養物を100倍に希釈しますが、これはLBおよびDM1000の方がLTEEで使用されるDM25環境よりもはるかに高い細胞密度であるために必要です( 代表的な結果を参照)。 希釈培養物から100 μLを新鮮なDM25を入れたフラスコにピペッティングする直前に、各希釈チューブを完全にボルテックスします。これらのプレコンディショニングフラスコのうち2つを、各反復アッセイに2つ、各競合他社に1つずつ接種します。 プレコンディショニングフラスコとブランクを37°Cで24±1時間インキュベートし、直径1インチにわたって120 rpmの軌道振とうを行います。 0日目:最初のカウントのために競技者とプレートを混合して競争を開始します競合アッセイの複製ごとに、9.9 mLのDM25で満たされた1つのフラスコと、9.9 mLの生理食塩水で満たされた1つの試験管にラベルを付けます。フラスコとチューブに、競合他社の各ペアと競合アッセイの複製数を一意に識別する方法でラベルを付けます。ブランクとして機能するように、9.9 mLのDM25で満たされた1つの追加のフラスコにラベルを付けます。 プレコンディショニングフラスコをインキュベーターから取り出します。濁度を目で調べて、成長したこと、明らかな汚染がないことを確認します。 50 μLのAra− 競技用フラスコを、新鮮なDM25で満たされた最初の反復競技用フラスコに移します。すぐに、50 μLのAra+ 競合他社を同じ競技用フラスコに移し、穏やかに旋回させて混合します。 競合他社のすべてのペアのすべての反復について、ステップ3.4.3を繰り返します。注:競合フラスコには、DM25で増殖した 大腸菌 培養物が全体で100倍に希釈されており、LTEEでは毎日の移動後に経験するのと同じ条件の細胞です。転送とミキシングの実行順序は重要です。両方の競合他社を各フラスコにすぐに次々に追加して、どちらも新鮮な培地で成長し始めないようにします。たとえば、すべての競技用フラスコにAra− 培養物を追加せずに、戻ってすべてのAra+ 株を追加します。 新たに接種した各競技用フラスコから100 μLのピペットを、その競合アッセイ用に標識された生理食塩水の試験管に、これらの各チューブに合わせた事前調整されたDM25培養物の全体の10,000倍希釈が含まれるように複製します。 競技用フラスコとブランクを振とうインキュベーターに入れます。競技用フラスコを37°Cで24±1時間インキュベートし、直径1インチで120 rpmの軌道振とうを行います。 同日、競技用フラスコをインキュベーターに入れた直後に、ステップ3.4.5の各試験管を完全にボルテックスし、ステップ2.10で説明したように、これらの10,000倍希釈液80 μLをTAプレート上に広げました。各プレートの底面の側面に、混合された菌株のペア、反復数、および「Day 0」をラベル付けして、各競合他社の初期表現を決定するために使用されることを示します。 TAプレートを重力対流インキュベーター内で逆さまにインキュベートし、Ara−とAra+の両方の競合物のコロニーが見えて区別できるようになるまで、37°Cでインキュベートします。一般に、これは16〜24時間以内に発生しますが、一部の進化した株ではさらに時間がかかる場合があります。各プレート上のAra−(赤)およびAra+(白)コロニーの数を数え、結果を記録します。注:TAプレート上のAra- コロニーとAra+ コロニーの色の違いは、プレートを4°Cで保存しても時間の経過とともに明確でなくなるため、インキュベーターから取り出したらできるだけ早くカウントする必要があります。Ara− およびAra+ 細胞によって形成されたコロニーの典型的な外観を示すTAプレートの画像が 代表的な結果に含まれています。このセクションには、一般的な「エッジケース」コロニーの画像(たとえば、異なるコロニータイプの重複または成長)があり、それらを数える方法について説明します。競合他社のいずれかによってTAプレート上に形成されたコロニーの増殖速度と形態が以前に特徴付けられていない場合は、競合他社がまだ互いに分離している0日目に、生理食塩水で10,000倍希釈した80 μLを広げます。次に、37°Cで16〜24時間以上インキュベートした後、これらのコントロールプレート上のコロニーを調べます。 代替案:1日目と2日目:3日間の競技を続ける競合アッセイの複製ごとに、9.9 mLのDM25で満たされた1つのフラスコに標識を付けます。競合他社の各ペア、反復数、および競合アッセイの日を一意に識別する方法でフラスコにラベルを付けます。ブランクとして機能するように、9.9 mLのDM25で満たされた1つの追加のフラスコにラベルを付けます。 前日からの競技用フラスコをインキュベーターから取り出します。濁度を目視で調べて、予想される成長を確認し、汚染を検出します。 各競技用フラスコから100 μLを、競技当日の新鮮な培地の対応するフラスコに移します。 新しい競技用フラスコとブランクを振とうインキュベーターに入れます。直径1インチにわたって120 rpmの軌道振とうしながら、37°Cで24±1時間インキュベートします。 続行する前に、コンテストの3.5.1日目に手順3.5.1〜3.5.4を繰り返します。 1日目または3日目:競技を終え、最終カウントのためにプレートを立てる競技用フラスコごとに、9.9 mLの生理食塩水で満たされた2本の試験管を用意します。競合他社の各ペア、反復数、およびそれらが1回目または2回目の希釈用であるかどうかを一意に識別する方法でラベルを付けます。 競技用フラスコをインキュベーターから取り出します。濁度を目で調べて、それらが成長し、明らかな汚染がないことを検出します。 各競技用フラスコから100μLをその複製のための生理食塩水の最初のチューブにピペットで入れる。得られたチューブには、DM25培養物の100倍希釈液が含まれています。 ボルテックス各100倍希釈チューブを十分に混合し、その複製のために生理食塩水の2番目のチューブに100μLをピペットで入れた。得られたチューブには、DM25培養物の10,000倍希釈液が含まれています。 10,000倍希釈液を含む各試験管を完全にボルテックスし、ステップ2.10で説明したようにTAプレート上に80μLを広げます。各プレートの底面の側面に、混合された菌株のペア、反復数、および1日の競技の場合は「1日目」、3日間の競技の場合は「3日目」のラベルを付けて、各競技者の最終的な表現を決定するために使用されます。 TAプレートを37°Cでインキュベートし、ステップ3.4.8の説明に従って、成長後のAra−およびAra+ コロニーをカウントします。注:すべての転写およびめっきステップを通じて、各競合アッセイの反復数を追跡します。異なる反復アッセイ間でどの最終カウントと初期カウントが対応するかを混乱させると、同じ2つの競合他社がそれぞれに混在している場合でも、適合度の推定値が正しくなくなります。 計算とプロットの適合度Excelを使用して相対適合度を計算およびプロットする場合は、XLSスプレッドシート(補足ファイル1)をダウンロードします。Rを使用している場合は、fitnessRパッケージ31 をインストールし、カンマ区切り値(CSV)テンプレート(補足ファイル2)をダウンロードするか、ビネットの指示に従ってこのファイルの新しいコピーを生成します。 ダウンロードしたファイルの指定された細胞またはカラムで実施された競合アッセイの「転写希釈」100を入力します。競技者が共存培養された毎日の成長サイクルの総数を「転送数」として入力します(たとえば、3日間の競技の場合は3)。 指定されたセルまたは列に、参照株を「競合者1」、試験株または母集団を「競合菌2」として、競合者の各ペアの名前を入力します。 コンペティションアッセイの複製ごとに、それぞれの初期コロニー数と最終コロニー数をダウンロードしたファイルの指定された列に入力します。 Excelスプレッドシートを使用している場合、この推定値の平均相対適合度値と95%信頼限界が表示されるようになりました。競合他社のさまざまな組み合わせの結果を別のシートにコピーし、結果を要約したグラフを作成します。R を使用してデータを分析する場合は、fitnessR パッケージのビネットの指示に従ってこれらの計算を実行し、計算値を含む CSV ファイルを出力して、結果をプロットします。