העברות יומיות, אחסון אוכלוסיות בארכיון ומדידת כושר בניסוי האבולוציה ארוך הטווח עם Escherichia coli

1. העברות יומיות של אוכלוסיות LTEE הערה: 12 אוכלוסיות LTEE מועברות מדי יום על ידי חיסון מדיום טרי עם 1% מהתרביות מהצלוחיות של היום הקודם. השלבים בתהליך זה מסוכמים באיור 1. שש אוכלוסיות Ara− שהתחילו מזן REL606 מסומנות A−1 עד A−6, ושש אוכלוסיות Ara+ שהתחילו מזן REL607 מסומנות A+1 עד A+6. הקפדה על טכניקה אספטית ועל לוח זמנים וסדר להעברת אוכלוסיות ממזערת את הסיכון לזיהום ושיבושים אחרים. יש לחטא את המשטח שעליו יועברו ה-LTEE על ידי ניגובו בתמיסת אתנול 70% או 10% אקונומיקה. הדליקו מבער בונזן כדי ליצור טיוטה מקומית ולאפשר להבעיר כלי זכוכית.הערה: יש ללבוש כפפות מעבדה למניעת זיהום. לבטיחות סביב להבה פתוחה, חשוב להשתמש רק בכפפות העשויות מחומר כמו ניטריל שאינו דליק. הכינו 13 צלוחיות בורוסיליקט ארלנמאייר של 50 מ”ל עם כוסות בורוסיליקט או פוליפרופילן של 20 מ”ל שנשטפו ועוקרו על ידי אוטוקלאבינג. בדוק את הצלוחיות עבור לכלוך גלוי ולהחליף כל אלה שאינם נקיים לחלוטין. סמן שש צלוחיות A−1 עד A−6 באמצעות סמן אדום ואת שש הצלוחיות האחרות A+1 עד A+6 באמצעות סמן שחור. סמן את הצלוחיות האחרונות שנותרו, שיהיו ריקות, עם התאריך בתבנית חודש/יום והיום בשבוע. מלאו כל אחת מ-13 הצלוחיות ב-9.9 מ”ל של מדיום DM25 באמצעות פיפטה סרולוגית סטרילית של 10 מ”ל. יש להבעיר את פיו של כל בקבוק לאחר הסרת הכד המשמש כמכסה ולפני החלפת הכד. מבעירים את קצה הפיפטה בין מילוי כל צלוחית.הערה: הוראות להכנת DM25 זמינות באינטרנט30. אם אתם משתמשים בפיפט סרולוגי מפלסטיק, וותרו על הבערת קצהו או הגבילו את הזמן בלהבה כדי למנוע המסת הפלסטיק. הסירו את צלוחיות ה-LTEE של היום הקודם מאינקובטור הרעידה. בחנו כל בקבוק על ידי הצמדתו לאור כדי להעריך את עכירותו וצבעו, בדקו את שלמות הבקבוק וחפשו נוכחות של חומר זר.הערה: לעין בלתי, כל תרבויות Ara− ו- Ara+ ייראו מעט עכורות בהשוואה לחסר, למעט A−3, שיהיה ~ פי 10 יותר עכור מהאחרות בגלל צמיחה על ציטראט בתווך. מזהמים מיקרוביאליים חיצוניים רבים מסוגלים גם הם לגדול על ציטראט, כך שעכירות מוגברת באוכלוסיות שאינן A-3 מצביעה ככל הנראה על זיהום. עיין בסעיף תוצאות מייצגות לקבלת תמונות של תרביות LTEE לפני העברה. אופציונלי: ודא שלכל תרבית LTEE יש את העכירות הצפויה על ידי צנרת של 1 מ”ל של הריק ו- 1 מ”ל של כל תרבית לתוך קוביות פלסטיק של 1 ס”מ וביצוע קריאות צפיפות אופטית ב- 600 ננומטר (OD600) באמצעות ספקטרופוטומטר לאחר ריקון המכשיר.הערה: צעד נוסף זה יכול להיות שימושי עבור חוקרים חדשים בעבודה עם LTEE ואינם בטוחים לגבי שיפוט העכירות על פי העין, כמו גם לתיעוד וחקירה של חריגות חשודות. קח דגימות למדידת OD600 מהצלוחיות של היום הקודם רק לאחר השלמת ההעברות הרגילות של היום לצלוחיות חדשות (השלבים הבאים) כדי למזער את הסיכון לזיהום אוכלוסיות התאים שימשיכו להתפשט אם ערכי OD600 הם כצפוי. עיין בסעיף תוצאות מייצגות לקבלת ערכי OD600 אופייניים עבור תרביות LTEE. באמצעות מיקרופיפטור P200 עם קצה מסנן סטרילי, העבירו 100 מיקרוליטר של תרבית מכל בקבוק LTEE לבקבוק המתאים המכיל DM25 טרי. התחל עם A−1, ולאחר מכן העבר A+1. לאחר מכן, המשך לסירוגין בין אוכלוסיות -ו-+. כדי לעקוב אחר התרבויות שהועברו, הזיזו את הצלוחיות שמאלה לאחר הפיפטינג מהן או אליהן.הערה: הסדר הקפדני של העברות וחילופים בין אוכלוסיות Ara− ו- Ara+ מסייע במניעה ואיתור של זיהום צולב ותערובות. שימו לב לטכניקה אספטית קפדנית: השתמשו בקצה פיפטה טרי לכל העברה, הבעירו את פיות הצלוחיות מיד לאחר פתיחת המכסה ולפני הסיכום, ונגבו את החבית והמפלט של המיקרופיפטור עם מגבון נייר ללא סיבים רטוב באתנול 70% בין כל העברה. לעולם אין להשתמש באקונומיקה לחיטוי מיקרופיפטורים, מכיוון שאפילו כמויות זעירות יכולות להרוג את התרביות. דגרו על הצלוחיות החדשות שחוסנו בטמפרטורה של 37°C למשך 24 ± שעה אחת עם רעידות מסלוליות של 120 סל”ד בקוטר של 1 אינץ’. אחסן את התרביות מהיום הקודם ב 4 °C (75 °F). שמור תרביות גיבוי אלה למשך יומיים. השליכו תרביות ישנות יותר שנשמרו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס שלושה ימים קודם לכן בשלב זה.הערה: התרביות של היומיים הקודמים מספקות שני סטים שלמים של גיבויים שבעזרתם ניתן להפעיל מחדש את הניסוי, במידת הצורך, אם מתרחשת בעיה או תאונה, או אם מתגלה זיהום של התרביות של היום הקודם לפני ההעברה (למשל, צבע מוזר או חלקיקים בלתי צפויים). הזן את השעה, התאריך, מספר ההעברה, השם או ראשי התיבות של החוקר שביצע את ההעברות, האם התרבויות היו תקינות או לא, וכל מידע רלוונטי אחר במחברת יומן ההעברות. עבור לשלבים 1.12-1.14 אם אחד מהמצבים הבאים מתרחש: (1) הריק מהיום הקודם מזוהם, (2) בקבוק או המכסה שלו סדוק או שבור, (3) בקבוק מכיל חומר זר, (4) בקבוק מתהפך או נופל במהלך העברות, או (5) יש כל אירוע או תצפית אחרים שהופכים את המשך הצלוחיות האלה למוטל בספק. אם יש בעיות, תאונות או חשדות לזיהום בתרביות LTEE של היום הקודם, אין להעביר מהן. במקום זאת, אחסנו את כל קבוצת שתים עשרה התרביות בטמפרטורה של 4°C לבחינה מאוחרת יותר ואפיון נוסף. אחזר את הצלוחיות המכילות את תרביות הגיבוי שהועברו מיום קודם ואוחסנו ב -4 מעלות צלזיוס. הניחו אותם על הספסל כדי להתחמם לטמפרטורת החדר. מערבלים בעדינות כל בקבוק כדי להשעות מחדש את התאים. העבר מצלוחיות הגיבוי לקבוצה החדשה של צלוחיות המכילות תווך טרי והמשך את הניסוי כרגיל כמתואר בשלבים 1.6-1.11. רשום ביומן ההעברות שנעשה שימוש בתרביות הגיבוי ורשום את אותו מספר העברה כמו ביום הקודם.הערה: גם אם מתגלה בעיה בצלוחיות של אוכלוסייה אחת בלבד, העבר את כל שתים עשרה האוכלוסיות מצלוחיות הגיבוי כך שמספר הדורות שחלפו בכל האוכלוסיות יישאר בשלב. אם זיהום מצוין בצלוחיות הגיבוי המאוחסנות ב -4 מעלות צלזיוס, יש להפעיל מחדש את אוכלוסיות ה- LTEE המושפעות ממלאי קפוא באמצעות ההליך המתואר בשלבים 3.1-3.2 עבור דגימות אוכלוסייה. אין להגדיל את מספר ההעברה עבור LTEE עד לצמיחת התרביות הראשונות ב- DM25 לאחר התחייה. 2. ארכוב אוכלוסיות LTEE הערה: דגימות של אוכלוסיות LTEE מוקפאות כל 75 העברות. האוכלוסיות גדלות ~ 6 2/3 דורות בכל יום לאחר דילול ההעברה פי 100, כך שתקופה זו מתאימה ל~500 דורות. במהלך הארכיון, אוכלוסיות LTEE מצופות גם על סוגים שונים של מדיה אגר כדי לבדוק זיהום. לחלופין, ניתן לבחור שיבוטים מייצגים מצלחות אלה ולאחסן אותם בארכיון בשלב זה. שלבים אלה מסוכמים באיור 1. יום לפני ההקפאה המתוכננת או כמה ימים לפני, הכינו שלושה סוגים של צלחות אגר: גלוקוז מינימלי (MG), ארבינוז מינימלי (MA) וטטרזוליום ארבינוז (TA). הכינו שתים עשרה צלחות מכל סוג אגר, ועוד כמה תוספות. כמו כן, הכינו לפחות 250 מ”ל של 0.85% (w/v) מלוחים סטריליים ו-50 מ”ל של 80% (v/v) גליצרול סטרילי.הערה: מתכונים לכל המדיה והפתרונות זמינים באינטרנט30. היום לפני שה-LTEE מגיע לדור שהוא מכפלה של 500 עבור לוח הזמנים הרגיל לאחסון בארכיון הוא היוםה-74 מאז ההקפאה האחרונה בתוספת כל הימים שנוספו עקב העברות מצלוחיות הגיבוי של 4 מעלות צלזיוס כאשר התגלו בעיות או חשדו בהן. אופציונלי: אם אחסון בארכיון של שיבוט מבודד מאוכלוסיות LTEE, הכינו אספקה נוספת: בידוד שלושה שיבוטים מכל אוכלוסייה דורש 72 מ”ג צלחות, 80 מ”ל של 80% (v/v) גליצרול ו-370 מ”ל DM1000. הכינו סט נוסף של שתים עשרה צלוחיות בעת ביצוע שלב 1.2 של העברות LTEE יומיות ביום שלפני ההקפאה המתוכננת. סמן שש מהצלוחיות הנוספות xA−1 עד xA−6 באמצעות סמן אדום, ואת שש האחרות xA+1 עד xA+6 באמצעות סמן שחור.הערה: ה- “x” מציין שקבוצת הצלוחיות הנוספת תשמש לאחסון בארכיון ומבדיל אותן מקבוצת הצלוחיות האחרות שישמשו להמשך ההעברות היומיות של ה- LTEE במקביל. מלא כל אחת מהצלוחיות הנוספות שישמשו לאחסון בארכיון עם 14.85 מ”ל DM25 באמצעות פיפטה סרולוגית של 25 מ”ל בעת ביצוע שלב 1.4 של העברות LTEE יומיות. השלם את העברת LTEE הרגילה כמתואר בשלבים 1.5-1.11. לאחר מכן, חזור על ההוראות לשלב 1.8, אך הפעם העבר 150 μL מכל אחת מתרביות LTEE של היום הקודם לצלוחיות נוספות של 14.85 מ”ל של DM25 טרי שישמשו לארכיון.הערה: בצעד זה ובכל השלבים הבאים, הימנע מזיהום ותערובות על-ידי ביצוע הנחיות אלה. התחל עם אוכלוסייה A−1, לאחר מכן העבר A+1, ולאחר מכן המשך לסירוגין – ו + אוכלוסיות. נגבו את החבית ואת המפלט של המיקרופיפטור עם מגבון נייר ללא סיבים טבול באתנול 70% בעת החלפת אוכלוסיות. העבר צלוחיות ומבחנות במגשים או במדפים שלהם לאחר הפיפט מהם או אליהם כדי לעקוב אחר ההעברות שהושלמו. לדגור על סט של שתים עשרה צלוחיות לאחסון ב 37 ° C במשך 24 ± 1 שעה עם 120 סל”ד מסלול רועד על קוטר 1 אינץ ‘לצד שתים עשרה תרביות LTEE ואת הריק כמתואר בשלב 1.9. הכינו אספקה לציפוי אוכלוסיות ה-LTEE לפחות שעה לפני ביצוע העברות ה-LTEE ביום ההקפאה.בחר שתים עשרה מ”ג, שתים עשרה MA ושתים עשרה צלחות אגר ת”א. בדוק חזותית כל אחד מהם כדי להיות בטוח שאין לו זיהום ברור. סמן צלחת אחת מכל סוג עבור כל אחת משתים-עשרה אוכלוסיות LTEE (A−1 עד A+6).הערה: בעת סימון צלחות, כתוב על הצדדים של תחתית צלחת הפטרי. זה חשוב כדי לא לטשטש מושבות כאשר רוצים לבחון או לצלם אותן מתחת לאגר. אל תכתוב על העפעפיים, מכיוון שניתן לערבב אותם. הניחו את צלחות האגר באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות לפחות כדי לחמם אותן לפני השימוש בהן בשלב 2.10. הכינו 24 מבחנות המכילות 9.9 מ”ל מי מלח. סדרו אותם בשנים-עשר סטים של שני צינורות כל אחד. תייגו כל אחת משתי הקבוצות של שתים-עשרה מבחנות באותו אופן כמו הלוחות, והוסיפו “1” או “2” מתחת למזהה האוכלוסייה של LTEE כדי לציין את הסדר שבו הן ישמשו לביצוע דילולים של אותה אוכלוסייה. בצע את שלבים 1.1-1.11 באמצעות הצלוחיות שימשיכו את ההעברות היומיות של LTEE כרגיל. במהלך שלב 1.5, הסר גם את שתים עשרה הצלוחיות המכילות את התרביות הנוספות לארכיון מאינקובטור הרעידה. פיפטה 100 μL של התרבית מכל אחת משנים עשר הצלוחיות הנוספות לאחסון במבחנה הראשונה של מי מלח בזוג עבור אוכלוסיית LTEE זו. מערבלים את הצינורות עם דילולים אלה פי 100 ביסודיות. לאחר מכן, פיפטה 100 μL מכל אחד לצינור השני המתאים של מלוחים. מערבלים את דילול התרביות הסופי פי 10,000 ביסודיות. פיפטה 80 μL מכל אחד מהצינורות המכילים דילול תרבית פי 10,000 ללוחות TA, MG ו- MA המסומנים עבור אוכלוסייה זו. פזרו את הנוזל באופן אחיד על פני משטח האגר באמצעות מוט פיזור סטרילי או חרוזי פיזור סטריליים, לפי העדפה. חזור על הפעולה עד שכל שתים-עשרה האוכלוסיות יהיו מצופות על כל שלושת סוגי המדיה. במידת הצורך, הניחו לצלחות להתייבש עד שלא נראה נוזל על האגר. מניחים את הלוחות הפוכים (עם צד האגר למעלה) באינקובטור הסעת כבידה המוגדר ל 37 מעלות צלזיוס.הערה: דגירה הפוכה של צלחות שומרת על האגר מפני התייבשות ומונעת מעיבוי לטפטף על משטח האגר. תנועה של תאים בנוזל על פני האגר במהלך הדגירה עלולה למרוח מושבות ולהניב ספירת מושבות שגויה. הוסף 3 מ”ל של גליצרול סטרילי 80% (v/v) לכל אחת מ-12 הצלוחיות הנוספות המיועדות לאחסון בארכיון. מערבבים היטב על ידי ערבול ומערבולות עדינות. יש לפזר את התערובת מכל בקבוק לקריביאלים סטריליים שסומנו במזהה ייחודי לדגימה, לאוכלוסיית ה-LTEE שאליה שייכת הדגימה, לדור שבו הוקפאה, לעובדה שמדובר בדגימה מעורבת (אוכלוסייה) ולתאריך. פיפטה 6 מ”ל לתוך בקבוקון אחד גדול ו 1.25 מ”ל לתוך כל אחד משישה בקבוקונים קטנים.הערה: הבקבוקון הגדול הוא המלאי העובד. בקבוקון קטן אחד הוא גיבוי למקרה שהמלאי התקין אזל או הזדהם. חמשת הבקבוקונים הקטנים האחרים הם עותקים שניתן לשלוח למעבדות אחרות. מקפיאים את הבקבוקונים המלאים ב -80 מעלות צלזיוס. לבחון ולתעד את הצמיחה והמורפולוגיה של מושבות על לוחות TA, MG ו-MA לאחר 24 שעות ו-48 שעות של דגירה.הערה: עיין בסעיף תוצאות מייצגות לקבלת תמונות ותיאורים של מושבות שנוצרו על ידי אבותיהם הקדמונים של REL606 ו- REL607 וכל אחת משתים-עשרה אוכלוסיות LTEE כאשר הן היו מצופות ב- 76,000 דורות. אופציונלי: בצע את השלבים הבאים בעת אחסון מבודדי שיבוט בארכיון.בחר שלושה מבודדים שבטיים (מושבות) עבור כל אוכלוסיית LTEE מתוך לוחות MG, פסים כל אחד בנפרד על צלחת MG חדשה, ודגור על לוחות אלה במשך 16-24 שעות ב 37 ° C.הערה: אם קיימות מושבות עם מורפולוגיות שונות, הנוהג המקובל ב- LTEE הוא לדגום מגוון מרבי על ידי בחירת הסוג הנפוץ ביותר, ולאחר מכן בחירת מושבות נוספות מסוגי מיעוטים. ניתן גם להשתמש באסטרטגיית דגימה אקראית על ידי סימון נקודות בחלק התחתון של תחתית צלחת הפטרי לפני פיזור התאים ולאחר מכן בחירת המושבה המבודדת הקרובה ביותר לכל סימן לאחר הצמיחה. למחרת, פזרו מושבה מייצגת מכל צלחת על צלחת MG חדשה ודגרו על צלחות אלה במשך 16-24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. למחרת, חסן מושבה מבודדת אחת מכל צלחת MG לתוך בקבוק המכיל 10 מ”ל של DM1000 טרי. כמו כן, מלא בקבוק אחד נוסף עם 10 מ”ל של DM1000 כדי לשמש ריק לא מחוסן כדי לבדוק זיהום מדיה. לדגור על הצלוחיות ב 37 ° C במשך 16-24 שעות עם 120 סל”ד מסלול רועד מעל קוטר 1 אינץ ‘. לאחר הדגירה, יש להוסיף 2 מ”ל גליצרול סטרילי 80% (v/v) לכל בקבוק ולערבב. פזרו 1.25 מ”ל אליציטוטים מכל בקבוק לבקבוקונים קטנים וסטריליים המסומנים במזהה ייחודי לכל שיבוט, אוכלוסיית ה-LTEE שלו ודור המוצא שלו, שהוא דגימת שיבוט והתאריך. מקפיאים את הבקבוקונים המלאים ב -80 מעלות צלזיוס. 3. מבחני כושר תחרותיים הערה: ב- LTEE, כושר הרבייה מכומת במונחים של המספר היחסי של הכפלות שחיידקים שונים משיגים במהלך מחזור תרבית אחד או יותר של 24 שעות באותם תנאים כמו ההעברות היומיות. באופן ספציפי, הכושר היחסי של מתחרה אחד למשנהו הוא היחס בין שיעורי ההכפלה הממומשים שלהם כאשר הם מתחרים ראש בראש בתרבות משותפת. כל מתחרה בזוג עשוי להיות אוכלוסייה מלאה או מבודד שבט שאורכב בעבר כחלק מ”תיעוד המאובנים” הקפוא של LTEE. לחלופין, אחד המתחרים או שניהם עשויים להיות שיבוט שעבר הנדסה גנטית כדי להוסיף או להסיר מוטציות ספציפיות כדי לבדוק את השפעתן. שני המתחרים חייבים להיות במצבים מנוגדים של Ara+/Ara− מכיוון שסמן גנטי זה משמש כדי להבדיל ביניהם במהלך בדיקה זו. זרימת העבודה הכוללת עבור בדיקת תחרות מוצגת באיור 2. ניתן להאריך את משך שלב הטיפוח המשותף מיום אחד לשלושה (או יותר) כדי לשפר את הדיוק של הערכות הכושר בעת בדיקת הבדלים בין מתחרים התואמים כמעט באופן שווה. ראה Disussion עבור שיקולים קריטיים אחרים ושינויים אפשריים של פרוטוקול זה. איור 2: תרשים זרימה של מבחני תחרות. ההליך המלא לבדיקת תחרות בת יום אחד מוצג. ההליך בן שלושת הימים ממשיך עם המסלול החלופי ביום 1 וביום 2 עד לציפוי ביום 3 באותו אופן שבו הוא מתואר ביום 1 של התחרות החד-יומית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. הכנת חומרים מתכליםהחלט בכמה זני LTEE מתחרים ו/או אוכלוסיות ישמשו וכמה מבחני תחרות משוכפלים יבוצעו עבור כל זוג מתחרים. הכן את הציוד הדרוש כמתואר בשלבים הבאים.הערה: מתכונים לכל המדיה והפתרונות זמינים באינטרנט30. את הצלוחיות והמבחנות הנדרשות לכל ימי הניסוי בתחרות ניתן למלא מראש או לפי הצורך בימים בהם נעשה בהם שימוש. אם ממלאים צלוחיות ומבחנות מראש, אחסנו אותן בטמפרטורת החדר בחושך כדי למזער את האידוי. יש להכין את צלחות ת”א לפחות יומיים לפני מועד השימוש בהן כדי שיוכלו להתייבש מספיק לאחר המזיגה כדי לאפשר פיזור דילול תרבית. הכינו תמיד כמה צלוחיות נוספות, מבחנות וצלחות TA כדי שהניסוי יוכל להמשיך אם יש טעויות צנרת, צלחות מזוהמות או תקלות קלות אחרות. ליום התחייה (יום -2), מלאו בקבוק Erlenmeyer סטרילי אחד של 50 מ”ל מכוסה בכוס 20 מ”ל עם 9.9 מ”ל של DM1000 או מרק ליזוגני (LB) לכל זן או אוכלוסייה של E. coli שישמשו כמתחרה. ממלאים בקבוק אחד נוסף עם 9.9 מ”ל של אותו מדיום כדי לשמש ריק לא מחוסן. עבור יום טרום ההתניה (יום −1), מלא מבחנה אחת עם 9.9 מ”ל של 0.85% (w/v) מלוחים סטריליים לכל מתחרה, שתי צלוחיות עם 9.9 מ”ל DM25 לכל בדיקה משוכפלת בין זוג מתחרים, ועוד בקבוק אחד עם 9.9 מ”ל DM25 עבור ריק. עבור יום תחילת התחרות (יום 0), מלא בקבוק אחד עם 9.9 מ”ל של DM25, מלא מבחנה אחת עם 9.9 מ”ל של 0.85% (w/v) מלוחים סטריליים, והכן צלחת TA אחת לכל שכפול מבחן התחרות. מלא בקבוק אחד נוסף עם 9.9 מ”ל של DM25 לשמש ריק. חלופה: עבור כל יום של תחרות רב-יומית מעבר לראשון, מלא בקבוק אחד עם 9.9 מ”ל DM25 לכל תחרות משוכפל ומלא בקבוק אחד נוסף עם 9.9 מ”ל DM25 עבור ריק. ביום האחרון של התחרות (למשל, יום 1 או יום 3), מלאו שתי מבחנות במי מלח סטריליים במינון 9.9 מ”ל של 0.85% (w/v) מלוחים סטריליים והכינו צלחת TA אחת לכל שכפול תחרות. יום −2: החיו מתחרים בנפרד ב-DM1000 או LBעבור כל אחד מהמתחרים, תייג בקבוק מלא ב- 9.9 מ”ל של DM1000 או LB. תייג בקבוק נוסף מלא ב- 9.9 מ”ל מאותה אצווה של מדיום כדי לשמש ריק לא מחוסן לבדיקת זיהום.הערה: מלאי קפוא קם לתחייה ב-LB או DM1000 להתאוששות אחידה וצפויה יותר של תאים שמורים בהקפאה. הגליצרול המשמש כמגן קריוגני יכול להיות מטבוליזם על ידי E. coli, מה שיוביל לצפיפויות תאים גבוהות מהצפוי אם הדגימות יקומו לתחייה ב- DM25. LB ו- DM1000 תומכים בצמיחה לצפיפויות תאים כה גבוהות עד כי סיבוך זה הופך זניח. הוציאו את הקריובלים המכילים את המלאי הקפוא של הזנים המתחרים מהמקפיא בטמפרטורה של 80°C. שמרו את הבקבוקונים צוננים בדלי קרח בזמן השימוש בהם. לאחר שכל מלאי קפוא הפשיר, מערבלים אותו ביסודיות כדי להשעות מחדש את תאי E. coli. אם מחיים שיבוט, לחסן את הבקבוק המכיל מדיום טרי עם 12 μL של מלאי קפוא. אם מחיים אוכלוסייה, לחסן את הבקבוק עם 120 μL של מלאי קפוא.הערה: נפח 120 μL של המלאי הקפוא משמש לאוכלוסיות, כך שמספר התאים שקמים לתחייה זהה בערך לצוואר הבקבוק היומי כאשר 1% מאוכלוסיית LTEE מועבר לצלוחית חדשה. הפשרה וערבול של מלאי קפוא מספר פעמים עלולים לגרום ללחץ על התאים ולהפחית את הכדאיות של המלאי לאורך זמן. אם אוכלוסיית LTEE נתונה או שיבוט עומדים לשמש בתחרויות מספר פעמים, זה נוהג טוב לגדל מחדש ולהקפיא עותקים מרובים של המלאי, כך שאף אחד מהם לא מופשר ומוקפא מחדש פעמים רבות. לדגור את צלוחיות התחייה ואת הריק ב 37 ° C בלילה (16-24 שעות) עם 120 סל”ד מסלול רועד מעל 1 אינץ ‘קוטר. יום −1: תנאים מוקדמים למתחרים בנפרד ב-DM25עבור כל מתחרה, תווית מבחנה מלאה 9.9 מ”ל של מלוחים. עבור כל מבחן תחרות משוכפל בין זוג מתחרים, תייגו שתי צלוחיות 50 מ”ל מלאות ב- 9.9 מ”ל DM25, כל אחת עם מספר השכפול ושם אחד המתחרים. יש לסמן בקבוק אחד נוסף מלא ב-9.9 מ”ל DM25 כדי לשמש ריק. הוציאו מהחממה את הצלוחיות המכילות את תרביות המתחרים שקמו לתחייה. בדקו את העכירות שלהם בעין כדי לוודא שהם גדלו ושאין זיהום ברור. פיפטה 100 μL מכל בקבוק לתוך מבחנה של מלוחים עבור אותו מתחרה.הערה: שלב זה מדלל את התרבית פי 100, דבר הכרחי מכיוון שצפיפות התאים גבוהה בהרבה ב- LB וב- DM1000 מאשר בסביבת DM25 המשמשת ב- LTEE (ראה תוצאות מייצגות). מערבלים כל צינור דילול ביסודיות ממש לפני הפיפט 100 μL מהתרבית המדוללת לתוך בקבוק עם DM25 טרי. חסנו שתיים מהצלוחיות הללו עבור כל ניסוי משוכפל, אחת עבור כל אחד מהמתחרים. לדגור על צלוחיות המיזוג המוקדם והריק ב 37 ° C במשך 24 ± 1 שעה עם 120 סל”ד אורביטלי רועד על קוטר 1 אינץ ‘. יום 0: התחל את התחרות על ידי ערבוב מתחרים וצלחת לספירה ראשוניתעבור כל שכפול של בדיקת תחרות, יש לסמן בקבוק אחד מלא ב-9.9 מ”ל DM25 ומבחנה אחת מלאה במי מלח במינון 9.9 מ”ל. תייגו את הצלוחיות והצינורות באופן שמזהה באופן ייחודי כל זוג מתחרים ואת המספר המשוכפל של מבחן המתחרים. יש לסמן בקבוק אחד נוסף מלא ב-9.9 מ”ל DM25 כדי לשמש ריק. הוציאו את צלוחיות המיזוג המוקדמות מהאינקובטור. בדקו את העכירות שלהם בעין כדי לוודא שהם גדלו ושאין זיהום ברור. העבירו 50 μL של המתחרה Ara− לבקבוק התחרות המשוכפל הראשון מלא DM25 טרי. מיד, להעביר 50 μL של המתחרה Ara+ לתוך אותו בקבוק התחרות ולערבב אותו על ידי ערבול עדין. חזור על שלב 3.4.3 עבור כל העותקים המשוכפלים של כל זוגות המתחרים.הערה: לצלוחיות התחרות יש כעת דילול כולל של פי 100 של תרביות E. coli הגדלות ב- DM25, אותם תאי מצב בחוויית LTEE לאחר כל העברה יומית. סדר ביצוע ההעברות והערבוב חשוב. הוסף את שני המתחרים לכל בקבוק מיד אחד אחרי השני, כך שאף אחד מהם לא מקבל יתרון להתחיל לצמוח במדיום הטרי. לדוגמה, אל תוסיפו את תרביות Ara− לכל צלוחיות התחרות ואז חזרו והוסיפו את כל זני Ara+ . פיפטה 100 μL מכל בקבוק תחרות חדש שחוסנו לתוך מבחנה של מי מלח המסומנים עבור אותה בדיקת תחרות משוכפלים כך שכל אחת מהמבחנות הללו מכילה דילול כולל של פי 10,000 של תרביות DM25 המותנות מראש ששולבו. מניחים את צלוחיות התחרות וריקנות לתוך האינקובטור הרועד. לדגור על צלוחיות התחרות ב 37 ° C במשך 24 ± 1 שעה עם 120 סל”ד מסלול רועד מעל קוטר 1 אינץ ‘. באותו היום, מיד לאחר הכנסת צלוחיות התחרות לאינקובטור, מערבלים כל מבחנה משלב 3.4.5 ביסודיות ומפזרים 80 מיקרוליטר מהדילולים הללו פי 10,000 על לוחות ת”א כמתואר בשלב 2.10. תייגו את הצד התחתון של כל צלחת עם זוג הזנים שהיו מעורבבים, מספר המשוכפל ו”יום 0″ כדי לציין שהוא ישמש לקביעת הייצוג הראשוני של כל מתחרה. דוגרים על לוחות TA הפוכים באינקובטור קונבקציה כבידתית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד שניתן להבחין בין מושבות של המתחרים Ara− ו- Ara+ . בדרך כלל, זה קורה בתוך 16-24 שעות, אבל זה עשוי לקחת זמן רב יותר עבור כמה זנים מפותחים. ספור את מספרי מושבות Ara− (אדום) ו- Ara+ (לבן) על כל לוח ורשום את התוצאות.הערה: ההבדלים בין הצבעים של מושבות Ara- ו- Ara+ על לוחות TA הופכים פחות ברורים עם הזמן, גם כאשר לוחות מאוחסנים ב 4 ° C, ולכן יש לספור אותם מהר ככל האפשר לאחר הוצאתם מהאינקובטור. תמונות של לוחות TA המציגות את המראה האופייני של מושבות שנוצרו על ידי תאי Ara− ו- Ara+ כלולות בתוצאות המייצגות. בחלק זה יש גם תמונות של מושבות “מקרה קצה” נפוצות (למשל, חפיפה או צמיחה של סוגי מושבות שונים), ומסביר כיצד לספור אותן. אם קצבי הצמיחה והמורפולוגיה של מושבות שנוצרו על לוחות ת”א על ידי מי מהמתחרים לא אופיינו קודם לכן, פיזר 80 מיקרוליטר של דילול פי 10,000 במי מלח מצלוחיות המיזוג ביום 0, כאשר המתחרים עדיין נפרדים זה מזה. לאחר מכן, בדוק מושבות על לוחות בקרה אלה לאחר הדגירה ב 37 ° C במשך 16-24 שעות או יותר. חלופה: ימים 1 ו-2: המשך תחרות בת שלושה ימיםעבור כל שכפול של בדיקת תחרות, יש לסמן בקבוק אחד מלא ב-9.9 מ”ל DM25. תייגו את הצלוחיות באופן שמזהה באופן ייחודי כל זוג מתחרים, את המספר המשוכפל ואת יום מבחן התחרות. יש לסמן בקבוק אחד נוסף מלא ב-9.9 מ”ל DM25 כדי לשמש ריק. הוציאו את צלוחיות התחרות מהיום הקודם אל מחוץ לחממה. בדוק את העכירות שלהם בעין כדי לאמת את הצמיחה הצפויה ולזהות זיהום. מעבירים 100 μL מכל בקבוק תחרות לבקבוק המתאים של מדיום טרי ליום המחרת של התחרות. הניחו את צלוחיות התחרות החדשות וריקנו אותן לתוך החממה המטלטלת. לדגור אותם ב 37 ° C במשך 24 ± 1 שעה עם 120 סל”ד מסלול רועד על קוטר 1 אינץ ‘. חזור על שלבים 3.5.1-3.5.4 ביום השני של התחרות לפני שתמשיך. יום 1 או 3: סיום התחרות והצלחת לספירה סופיתעבור כל בקבוק תחרות, להכין שתי מבחנות מלא 9.9 מ”ל של מלוחים. תייגו אותם באופן שמזהה באופן ייחודי כל זוג מתחרים, את מספר השכפול והאם הם מיועדים לדילול הראשון או השני. הוציאו את צלוחיות התחרות מהחממה. בדקו את העכירות שלהם בעין כדי לגלות שהם גדלו ולא היה זיהום ברור. פיפטה 100 μL מכל בקבוק תחרות לתוך הצינור הראשון של מלוחים עבור אותו משוכפל. הצינורות המתקבלים מכילים דילול פי 100 של תרביות DM25. מערבלים כל צינור דילול פי 100 כדי לערבב אותו ביסודיות ופיפטה 100 μL לצינור השני של מי מלח עבור שכפול זה. הצינורות המתקבלים מכילים דילול פי 10,000 של תרביות DM25. מערבלים כל מבחנה המכילה דילול של פי 10,000 ביסודיות ומפזרים 80 מיקרוליטר ממנה על צלחת TA כמתואר בשלב 2.10. תייגו את הצד התחתון של כל צלחת עם זוג הזנים שהיו מעורבים, המספר המשוכפל, ו”יום 1″ לתחרות של יום אחד או “יום 3” לתחרות של שלושה ימים כדי לציין שהוא ישמש לקביעת הייצוג הסופי של כל מתחרה. יש לדגור על לוחות TA בטמפרטורה של 37°C ולספור את מושבות Ara− ו-Ara+ לאחר הצמיחה כמתואר בשלב 3.4.8.הערה: עקוב אחר המספר המשוכפל של כל מבחן תחרות לאורך כל שלבי ההעברות והציפויים. בלבול בין הספירה הסופית לספירה הראשונית בין מבחני שכפול שונים – גם כאשר אותם שני מתחרים היו מעורבים בכל אחד מהם – יוביל להערכות כושר שגויות. חישוב וכשירות העלילהאם אתה משתמש ב- Excel לחישוב והתוויית כושר יחסי, הורד את הגיליון האלקטרוני XLS (קובץ משלים 1). אם אתה משתמש ב- R, התקן את חבילת fitnessR31 והורד את תבנית הערכים המופרדים באמצעות פסיקים (CSV) (קובץ משלים 2) או צור עותק חדש של קובץ זה בהתאם להוראות בקובץ שלו. הזן “דילול העברה” של 100 עבור מבחני התחרות שנערכו בתא או בעמודה המיועדים בקובץ שהורדת. הזן את המספר הכולל של מחזורי הצמיחה היומיים שבמהלכם המתחרים היו מתורבתים משותפים כ”מספר ההעברות” (למשל, 3 עבור תחרות של שלושה ימים). הזן את השמות של כל זוג מתחרים בתאים או בעמודות ייעודיים עם זן הייחוס כ- “competitor1” והזן או אוכלוסיית הבדיקה כ- “competitor2”. עבור כל שכפול של בדיקת תחרות, הזן את ספירת המושבה הראשונית והאחרונה בהתאמה בעמודות הייעודיות של הקובץ שהורדת. אם אתה משתמש בגיליון האלקטרוני של Excel, הוא יציג כעת את ערך הכושר היחסי הממוצע ואת מגבלות הביטחון של 95% בהערכה זו. העתק את התוצאות עבור שילובים שונים של מתחרים לגיליון אחר וצור תרשים המסכם את התוצאות. אם אתה משתמש ב- R כדי לנתח את הנתונים, בצע את ההוראות ב- vignette עבור חבילת fitnessR כדי לבצע חישובים אלה, להפיק קובץ CSV עם הערכים המחושבים ולהתוות את התוצאות.