Transferts quotidiens, archivage des populations et mesure de la valeur adaptative dans l’expérience d’évolution à long terme avec Escherichia coli

1. Transferts quotidiens des populations LTEE REMARQUE : Les douze populations de LTEE sont transférées quotidiennement en inoculant du milieu frais 1 % des cultures provenant des flacons de la veille. Les étapes de ce processus sont résumées à la figure 1. Les six populations d’Ara− issues de la souche REL606 sont désignées A−1 à A−6, et les six populations d’Ara+ issues de la souche REL607 sont désignées A+1 à A+6. Le strict respect de la technique aseptique ainsi que d’un calendrier et d’un ordre de transfert des populations minimise les risques de contamination et d’autres perturbations. Désinfectez la surface sur laquelle les transferts LTEE seront effectués en l’essuyant avec de l’éthanol à 70 % ou une solution d’eau de Javel à 10 %. Allumez un brûleur Bunsen pour créer un courant ascendant local et permettre l’enflammement de la verrerie.REMARQUE : Portez des gants de laboratoire pour prévenir la contamination. Pour la sécurité autour d’une flamme nue, il est essentiel de n’utiliser que des gants faits d’un matériau comme le nitrile qui n’est pas inflammable. Préparer treize flacons d’erlenmeyer borosilicaté de 50 ml coiffés de béchers en borosilicate ou en polypropylène de 20 ml qui ont été lavés et stérilisés à l’autoclavage. Vérifiez que les flacons ne contiennent pas de débris visibles et remplacez ceux qui ne sont pas parfaitement propres. Étiquetez six flacons A−1 à A−6 à l’aide d’un marqueur rouge et les six autres flacons A+1 à A+6 à l’aide d’un marqueur noir. Étiqueter la dernière fiole restante, qui sera vierge, avec la date au format mois/jour et le jour de la semaine. Remplir chacune des 13 fioles avec 9,9 mL de milieu DM25 à l’aide d’une pipette sérologique stérile de 10 mL. Flammer l’embouchure de chaque fiole après avoir retiré le bécher servant de couvercle et avant de replacer le bécher. Allumer la pointe de la pipette entre le remplissage de chaque fiole.REMARQUE: Les instructions pour faire DM25 sont disponibles en ligne30. Si vous utilisez une pipette sérologique en plastique, évitez de flamber son embout ou limitez le temps passé dans la flamme pour éviter de faire fondre le plastique. Retirez les flacons LTEE de la veille de l’incubateur à secousses. Examiner chaque fiole en la tenant à la lumière pour évaluer sa turbidité et sa couleur, vérifier l’intégrité de la fiole et rechercher la présence de corps étrangers.NOTE: À l’œil nu, toutes les cultures Ara− et Ara+ auront l’air légèrement troubles par rapport au blanc, à l’exception de A−3, qui sera ~10 fois plus trouble que les autres en raison de la croissance sur citrate dans le milieu. De nombreux contaminants microbiens extérieurs peuvent également se développer sur le citrate, de sorte qu’une turbidité accrue dans les populations autres que A−3 indique probablement une contamination. Voir la section Résultats représentatifs pour des images des cultures LTEE avant un transfert. FACULTATIF : Confirmer que chaque culture LTEE présente la turbidité prévue en pipetant 1 mL de l’ébauche et 1 mL de chaque culture dans des cuvettes en plastique de 1 cm et en prenant des lectures de densité optique à 600 nm (OD600) à l’aide d’un spectrophotomètre après avoir occulté l’instrument.REMARQUE : Cette étape supplémentaire peut être utile pour les chercheurs qui débutent dans le travail avec le LTEE et qui ne sont pas certains de juger de la turbidité à l’œil, ainsi que pour documenter et enquêter sur les anomalies soupçonnées. Prélever des échantillons pour mesurer l’OD600 des flacons de la veille seulement après avoir terminé les transferts normaux de la journée dans de nouveaux flacons (étapes suivantes) afin de minimiser le risque de contamination des populations cellulaires qui continueront à se propager si les valeurs OD600 sont conformes aux prévisions. Voir la section Résultats représentatifs pour connaître les valeurs OD600 typiques pour les cultures LTEE. À l’aide d’un micropipeteur P200 muni d’un embout filtrant stérile, transférer 100 μL de culture de chaque fiole LTEE dans la fiole correspondante contenant du DM25 frais. Commencez par A−1, puis transférez A+1. Après cela, continuez à alterner entre les populations − et +. Pour savoir quelles cultures ont été transférées, déplacez les flacons vers la gauche après avoir pipeté depuis ou vers elles.REMARQUE : L’ordre strict des transferts et de l’alternance entre les populations Ara− et Ara+ aide à prévenir et à détecter la contamination croisée et les mélanges. Observez une technique d’asepsie stricte : utilisez une pointe de pipette fraîche pour chaque transfert, enflammez la bouche des flacons immédiatement après le débouchage et avant le rebouchuchon, et essuyez le canon et l’éjecteur du micropipettor avec une lingette en papier non pelucheuse imbibée d’éthanol à 70% entre chaque transfert. L’eau de Javel ne doit jamais être utilisée pour désinfecter les micropipettes, car même des traces peuvent tuer les cultures. Incuber les flacons nouvellement inoculés à 37 °C pendant 24 ± 1 h avec une agitation orbitale de 120 tr/min sur un diamètre de 1 pouce. Conservez les cultures de la veille à 4 °C. Conservez ces cultures de sauvegarde pendant deux jours. Jetez les cultures plus anciennes qui ont été conservées à 4 °C trois jours auparavant à ce moment-là.NOTE: Les cultures des deux jours précédents fournissent deux ensembles complets de sauvegardes permettant de recommencer l’expérience, si nécessaire, en cas de problème ou d’accident, ou si une contamination des cultures de la veille est découverte avant le transfert (par exemple, coloration étrange ou particules inattendues). Inscrivez l’heure, la date, le numéro de transfert, le nom ou les initiales du chercheur qui a effectué les transferts, si les cultures étaient acceptables ou non, et toute autre information pertinente dans le carnet de notes du registre des transferts. Passez aux étapes 1.12-1.14 si l’une des situations suivantes se produit: (1) l’ébauche de la veille est contaminée, (2) une fiole ou son couvercle est fissuré ou cassé, (3) une fiole contient des matières étrangères, (4) une fiole est renversée ou lâchée pendant les transferts, ou (5) il y a tout autre événement ou observation qui rend la poursuite de ces flacons discutable. S’il y a des problèmes, des accidents ou des soupçons de contamination avec les cultures LTEE de la veille, ne les transférez pas. Au lieu de cela, conservez l’ensemble des douze cultures à 4 ° C pour un examen ultérieur et une caractérisation plus approfondie. Récupérez les flacons contenant les cultures de sauvegarde qui ont été transférés de la veille et stockés à 4 °C. Placez-les sur la paillasse pour les réchauffer à température ambiante. Remuer doucement chaque fiole pour remettre les cellules en suspension. Transférer des flacons de secours vers le nouveau jeu de flacons contenant du milieu frais et poursuivre l’expérience normalement comme décrit aux étapes 1.6-1.11. Notez dans le journal de transfert que les cultures de sauvegarde ont été utilisées et enregistrez le même numéro de transfert que la veille.REMARQUE : Même si un problème est constaté dans le flacon d’une seule population, transférer les douze populations à partir des flacons de secours afin que le nombre de générations écoulées dans toutes les populations reste en phase. Si une contamination est constatée dans les flacons de secours entreposés à 4 °C, les populations LTEE touchées doivent être redémarrées à partir des stocks congelés en utilisant la procédure décrite aux étapes 3.1 à 3.2 pour les échantillons de population. Le nombre de transferts pour le LTEE ne devrait pas être incrémenté avant la croissance des premières cultures en DM25 après la renaissance. 2. Archivage des populations LTEE REMARQUE : Les échantillons des populations LTEE sont congelés tous les 75 transferts. Les populations augmentent ~6 2/3 générations chaque jour après la dilution par transfert de 100 fois, donc cette période correspond à ~500 générations. Lors de l’archivage, les populations LTEE sont également plaquées sur différents types de supports gélose pour vérifier la contamination. En option, des clones représentatifs peuvent être choisis à partir de ces plaques et archivés à ce stade. Ces étapes sont résumées à la figure 1. La veille de la congélation prévue ou quelques jours avant, préparez trois types de plaques de gélose : Glucose minimal (MG), Arabinose minimal (MA) et Tétrazolium Arabinose (TA). Faites douze assiettes de chaque type d’agar, plus quelques extras. Préparez également au moins 250 mL de solution saline stérile à 0,85 % (p/v) et 50 mL de glycérol stérile à 80 % (v/v).REMARQUE: Des recettes pour tous les supports et solutions sont disponibles en ligne30. Le jour avant que le LTEE atteigne une génération qui est un multiple de 500 pour le calendrier d’archivage régulier est le 74e jour depuis le dernier gel plus tous les jours qui ont été ajoutés en raison de transferts des flacons de secours à 4 °C lorsque des problèmes ont été détectés ou suspectés. FACULTATIF : Si vous archivez des isolats clonaux des populations LTEE, préparez des fournitures supplémentaires : l’isolement de trois clones de chaque population nécessite 72 plaques de MG, 80 mL de glycérol à 80 % (v/v) et 370 mL de DM1000. Préparez un jeu supplémentaire de douze flacons lors de l’exécution de l’étape 1.2 des transferts LTEE quotidiens la veille du gel prévu. Étiquetez six des flacons supplémentaires xA−1 à xA−6 à l’aide d’un marqueur rouge, et les six autres xA+1 à xA+6 à l’aide d’un marqueur noir.REMARQUE: Le « x » indique que le jeu supplémentaire de flacons sera utilisé pour l’archivage et les différencie de l’autre jeu de flacons qui sera utilisé pour continuer les transferts quotidiens du LTEE en parallèle. Remplissez chacun des flacons supplémentaires qui seront utilisés pour l’archivage avec 14,85 ml de DM25 à l’aide d’une pipette sérologique de 25 ml lors de l’exécution de l’étape 1.4 des transferts LTEE quotidiens. Effectuez le transfert LTEE normal comme décrit aux étapes 1.5 à 1.11. Répétez ensuite les instructions de l’étape 1.8, mais cette fois, transférez 150 μL de chacune des cultures LTEE de la veille vers les flacons supplémentaires de 14,85 ml de DM25 frais qui seront utilisés pour l’archivage.REMARQUE : Dans cette étape et dans toutes les étapes suivantes, évitez la contamination et les confusions en suivant ces directives. Commencez par la population A−1, puis transférez A+1, puis continuez à alterner les populations − et +. Essuyez le canon et l’éjecteur de la micropipette avec une lingette en papier non pelucheuse imbibée d’éthanol à 70 % lors du changement de population. Déplacer les flacons et les tubes à essai dans leurs plateaux ou racks après avoir pipeté depuis ou vers eux pour garder une trace des transferts qui ont été effectués. Incuber l’ensemble de douze flacons pour archivage à 37 °C pendant 24 ± 1 h avec une orbitale de 120 tr/min en secouant sur un diamètre de 1 pouce à côté des douze cultures LTEE et de l’ébauche comme décrit à l’étape 1.9. Préparer les fournitures pour le placage des populations LTEE au moins une heure avant que les transferts LTEE ne soient effectués le jour du gel.Sélectionnez douze plaques de gélose MG, douze MA et douze TA. Inspectez visuellement chacun d’eux pour vous assurer qu’il n’a pas de contamination évidente. Étiqueter une de chaque type de plaque pour chacune des douze populations LTEE (A−1 à A+6).REMARQUE: Lorsque vous étiquetez les assiettes, écrivez sur les côtés du fond de la boîte de Pétri. Ceci est important pour ne pas obscurcir les colonies lorsque l’on veut les examiner ou les photographier sous l’agar-agar. N’écrivez pas sur les couvercles, car ils peuvent être mélangés. Placer les plaques de gélose dans un incubateur à 37 °C pendant au moins 20 minutes pour les réchauffer avant de les utiliser à l’étape 2.10. Préparer 24 tubes à essai contenant 9,9 mL de solution saline. Disposez-les en douze jeux de deux tubes chacun. Étiqueter chacun des deux ensembles de douze tubes à essai de la même manière que les plaques, en ajoutant un « 1 » ou un « 2 » sous l’identificateur de population LTEE pour indiquer l’ordre dans lequel ils seront utilisés pour effectuer les dilutions de cette population. Effectuez les étapes 1.1-1.11 à l’aide des flacons qui poursuivront les transferts quotidiens du LTEE comme d’habitude. Au cours de l’étape 1.5, retirez également les douze flacons contenant les cultures supplémentaires pour l’archivage de l’incubateur à agiter. Pipeter 100 μL de la culture de chacun des douze flacons supplémentaires pour l’archivage dans le premier tube à essai de solution saline de la paire pour cette population LTEE. Vortex les tubes avec ces dilutions 100 fois à fond. Ensuite, pipeter 100 μL de chacun d’eux au deuxième tube de solution saline correspondant. Vortex les 10 000 dernières dilutions de culture à fond. Pipeter 80 μL de chacun des tubes contenant une dilution de culture de 10 000 fois sur les plaques marquées TA, MG et MA pour cette population. Étaler le liquide uniformément sur la surface de la gélose à l’aide d’une tige d’étalement stérile ou de billes d’étalement stériles, selon votre préférence. Répéter jusqu’à ce que les douze populations aient été plaquées sur les trois types de milieux. Si nécessaire, laisser sécher les assiettes jusqu’à ce qu’aucun liquide ne soit visible sur l’agar-agar. Placer les plaques à l’envers (avec la gélose vers le haut) dans un incubateur à convection par gravité réglé à 37 °C.REMARQUE: L’incubation des plaques à l’envers empêche la gélose de sécher et empêche la condensation de s’égoutter sur la surface de la gélose. Le mouvement des cellules dans le liquide sur la surface de la gélose pendant l’incubation peut frottir les colonies et donner un nombre incorrect de colonies. Ajouter 3 mL de glycérol stérile à 80 % (v/v) à chacune des douze fioles supplémentaires destinées à l’archivage. Bien mélanger en tourbillonnant et en tourbillonnant doucement. Distribuer le mélange de chaque fiole à des cryoflacons stériles qui ont été étiquetés avec un identificateur unique pour l’échantillon, la population LTEE à laquelle l’échantillon appartient, la génération à laquelle il a été congelé, qu’il s’agit d’un échantillon mixte (population) et la date. Pipeter 6 mL dans un grand flacon et 1,25 mL dans chacun des six petits flacons.NOTE: Le grand flacon est le stock de travail. Un petit flacon est une sauvegarde au cas où le stock de travail serait épuisé ou contaminé. Les cinq autres petits flacons sont des copies qui peuvent être envoyées à d’autres laboratoires. Congeler les flacons remplis à −80 °C. Examiner et documenter la croissance et la morphologie des colonies sur les plaques TA, MG et MA après 24 h et 48 h d’incubation.NOTE: Voir la section Résultats représentatifs pour les images et les descriptions des colonies formées par les ancêtres REL606 et REL607 et chacune des douze populations LTEE lorsqu’elles ont été plaquées à 76 000 générations. FACULTATIF : Effectuez les étapes suivantes lors de l’archivage des isolats clonaux.Prélever trois isolats clonaux (colonies) pour chaque population LTEE dans les plaques MG, les strier séparément sur une nouvelle plaque MG et incuber ces plaques pendant 16-24 h à 37 °C.NOTE: Si des colonies avec des morphologies différentes sont présentes, la pratique courante dans le LTEE est d’échantillonner pour une diversité maximale en choisissant d’abord le type le plus commun, puis en sélectionnant d’autres colonies parmi les types minoritaires. On peut également utiliser une stratégie d’échantillonnage aléatoire en marquant des points sur la face inférieure du fond de la boîte de Pétri avant d’étaler les cellules, puis en choisissant la colonie isolée la plus proche de chaque marque après la croissance. Le lendemain, étaler une colonie représentative de chaque plaque sur une nouvelle plaque MG et incuber ces plaques pendant 16-24 h à 37 °C. Le lendemain, inoculer une colonie isolée de chaque plaque de MG dans une fiole contenant 10 mL de DM1000 frais. De plus, remplir une fiole supplémentaire avec 10 ml de DM1000 pour servir d’ébauche non inoculée pour tester la contamination du milieu. Incuber les flacons à 37 °C pendant 16-24 h avec une agitation orbitale de 120 rpm sur un diamètre de 1 pouce. Après l’incubation, ajouter 2 mL de glycérol stérile à 80 % (v/v) dans chaque fiole et agiter pour mélanger. Distribuer 1,25 mL d’aliquotes de chaque fiole dans de petits flacons stériles étiquetés avec un identificateur unique pour chaque clone, sa population LTEE et sa génération d’origine, qu’il s’agit d’un échantillon clonal et la date. Congeler les flacons remplis à −80 °C. 3. Tests de condition physique compétitifs REMARQUE : Dans le LTEE, la capacité de reproduction est quantifiée en fonction du nombre relatif de doublements que différentes bactéries réalisent au cours d’un ou de plusieurs cycles de culture de 24 h dans les mêmes conditions que les transferts quotidiens. Plus précisément, l’adéquation relative d’un concurrent à un autre est le ratio de leurs taux de doublement réalisés lorsqu’ils s’affrontent dans une co-culture. Chaque concurrent d’une paire peut être une population complète ou un isolat clonal qui a été précédemment archivé dans le cadre du « registre fossile » congelé du LTEE. Alternativement, l’un ou les deux concurrents peuvent être un clone qui a été génétiquement modifié pour ajouter ou supprimer des mutations spécifiques afin de tester leurs effets. Les deux concurrents doivent avoir des états opposés Ara+/Ara− car ce marqueur génétique est utilisé pour les différencier lors de ce test. Le flux de travail global d’un essai de compétition est illustré à la figure 2. La durée de la phase de co-culture peut être prolongée d’un à trois jours (ou plus) pour améliorer la précision des estimations de la condition physique lors de l’essai des différences entre les concurrents qui sont presque égales. Voir la Disussion pour d’autres considérations critiques et des modifications possibles de ce protocole. Figure 2 : Organigramme de l’essai de compétition. La procédure complète pour un essai de compétition d’une journée est montrée. La procédure de trois jours se poursuit avec la voie alternative le jour 1 et le jour 2 jusqu’au placage le jour 3 de la même manière que celle illustrée pour le jour 1 de la compétition d’un jour. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Préparer les fournituresDécidez combien de souches et/ou de populations LTEE concurrentes seront utilisées et combien de tests de compétition répétés seront effectués pour chaque paire de concurrents. Préparez les fournitures nécessaires comme décrit dans les étapes suivantes.REMARQUE: Des recettes pour tous les supports et solutions sont disponibles en ligne30. Les flacons et les tubes à essai requis pour tous les jours d’une expérience de compétition peuvent être remplis à l’avance ou au besoin les jours où ils seront utilisés. Si les flacons et les tubes à essai sont remplis à l’avance, entreposez-les à température ambiante dans l’obscurité pour minimiser l’évaporation. Les plaques d’AT doivent être préparées au moins deux jours avant leur utilisation afin qu’elles puissent sécher suffisamment après avoir été coulées pour permettre la propagation des dilutions de culture. Préparez toujours quelques flacons, tubes à essai et plaques d’assistance supplémentaires afin qu’une expérience puisse se poursuivre s’il y a des erreurs de pipetage, des plaques contaminées ou d’autres incidents mineurs. Pour le jour de la reprise (jour −2), remplir une fiole d’erlenmeyer stérile de 50 ml recouverte d’un bécher de 20 ml avec 9,9 ml de bouillon DM1000 ou lysogène (LB) par souche ou population d’E. coli qui sera utilisée comme concurrent. Remplir une autre fiole avec 9,9 mL du même milieu pour servir d’ébauche non inoculée. Pour le jour de préconditionnement (jour −1), remplir un tube à essai avec 9,9 mL de solution saline stérile à 0,85 % (p/v) par concurrent, deux flacons avec 9,9 mL de DM25 par essai répété entre une paire de concurrents, et un autre flacon avec 9,9 mL de DM25 pour un essai à blanc. Pour le jour où la compétition commence (jour 0), remplir une fiole avec 9,9 mL de DM25, remplir un tube à essai avec 9,9 mL de solution saline stérile à 0,85 % (p/v) et préparer une plaque d’AT par répétition d’essai de compétition. Remplir une fiole de plus avec 9,9 ml de DM25 pour servir d’ébauche. ALTERNATIVE : Pour chaque jour d’une compétition de plusieurs jours au-delà du premier, remplir une fiole de 9,9 mL de DM25 par répétition de compétition et remplir une autre fiole avec 9,9 mL de DM25 pour un blanc. Pour le dernier jour de la compétition (p. ex ., Jour 1 ou Jour 3), remplir deux tubes à essai avec 9,9 mL de solution saline stérile à 0,85 % (p/v) et préparer une plaque d’AT par répétition de compétition. Jour −2: Relancer les concurrents séparément en DM1000 ou LBPour chacun des concurrents, étiqueter une fiole remplie de 9,9 mL de DM1000 ou de LB. Étiqueter une fiole supplémentaire remplie de 9,9 mL provenant du même lot de milieu pour servir d’ébauche non inoculée pour tester la contamination.NOTE: Les stocks congelés sont relancés en LB ou DM1000 pour une récupération plus uniforme et prévisible des cellules cryoconservées. Le glycérol utilisé comme cryoprotecteur peut être métabolisé par E. coli, ce qui entraînera des densités cellulaires plus élevées que prévu si les échantillons sont réactivés dans DM25. LB et DM1000 soutiennent la croissance à des densités cellulaires si élevées que cette complication devient négligeable. Sortez du congélateur les cryoflacons contenant les stocks congelés des souches concurrentes à −80 °C. Gardez les flacons au frais dans un seau à glace pendant leur utilisation. Une fois que chaque bouillon congelé a décongelé, le vortex à fond pour remettre en suspension les cellules d’E. coli. En cas de réactivation d’un clone, inoculer 12 μL de bouillon congelé dans la fiole contenant le milieu frais. En cas de réactivation d’une population, inoculer la fiole avec 120 μL de bouillon congelé.NOTA : Le volume de 120 μL du stock congelé est utilisé pour les populations de sorte que le nombre de cellules qui sont ranimées est approximativement le même que le goulot d’étranglement quotidien lorsque 1 % de la population LTEE est transférée dans une nouvelle fiole. La décongélation et le vortex répétés des stocks congelés peuvent stresser les cellules et réduire la viabilité des stocks au fil du temps. Si une population LTEE ou un clone donné doit être utilisé dans des compétitions plusieurs fois, il est recommandé de repousser et de congeler plusieurs copies du stock afin qu’aucun d’entre eux ne soit décongelé et recongelé plusieurs fois. Incuber les flacons de relance et l’ébauche à 37 °C pendant la nuit (16-24 h) avec une agitation orbitale de 120 tr/min sur un diamètre de 1 pouce. Jour −1 : Préconditionner les concurrents séparément en DM25Pour chaque concurrent, étiqueter un tube à essai rempli de 9,9 ml de solution saline. Pour chaque essai de compétition de répétition entre deux concurrents, étiqueter deux flacons de 50 ml remplis de 9,9 ml de DM25, chacun portant le numéro de réplication et le nom de l’un des concurrents. Étiqueter une fiole supplémentaire remplie de 9,9 ml de DM25 pour servir de flan. Sortez de l’incubateur les flacons contenant les cultures des concurrents ressuscités. Examinez leur turbidité à l’œil nu pour confirmer qu’ils se sont développés et qu’il n’y a pas de contamination évidente. Pipeter 100 μL de chaque fiole dans le tube à essai de solution saline pour ce concurrent.REMARQUE: Cette étape dilue la culture 100 fois, ce qui est nécessaire car la densité des cellules est beaucoup plus élevée en LB et DM1000 que dans l’environnement DM25 utilisé dans le LTEE (voir Résultats représentatifs). Bien vorter chaque tube de dilution juste avant de pipeter 100 μL de la culture diluée dans une fiole contenant du DM25 frais. Inoculer deux de ces flacons de préconditionnement pour chaque essai de répétition, un pour chacun des concurrents. Incuber les flacons de préconditionnement et l’ébauche à 37 °C pendant 24 ± 1 h avec une agitation orbitale de 120 tr/min sur un diamètre de 1 pouce. Jour 0: Commencez la compétition en mélangeant les concurrents et l’assiette pour les dénombrements initiauxPour chaque essai de compétition, étiqueter une fiole remplie de 9,9 mL de DM25 et une éprouvette remplie de 9,9 mL de solution saline. Étiquetez les flacons et les tubes de manière à identifier de manière unique chaque paire de concurrents et le numéro de réplique du test de compétition. Étiqueter une fiole supplémentaire remplie de 9,9 ml de DM25 pour servir de flan. Sortez les flacons de préconditionnement de l’incubateur. Examinez leur turbidité à l’œil nu pour confirmer qu’ils se sont développés et qu’il n’y a pas de contamination évidente. Transvaser 50 μL du concurrent Ara− dans la première fiole de compétition répliquée remplie de DM25 frais. Immédiatement, transférer 50 μL du concurrent Ara+ dans le même ballon de compétition et mélanger en remuant doucement. Répétez l’étape 3.4.3 pour toutes les répliques de toutes les paires de concurrents.REMARQUE: Les flacons de compétition ont maintenant une dilution globale de 100 fois des cultures d’E. coli cultivées en DM25, les mêmes cellules de condition dans l’expérience LTEE après chaque transfert quotidien. L’ordre d’exécution des transferts et du mélange est important. Ajouter les deux concurrents à chaque fiole immédiatement l’un après l’autre afin qu’aucun des deux ne prenne une longueur d’avance dans le milieu frais. Par exemple, n’ajoutez pas les cultures Ara− à tous les flacons de compétition, puis revenez en arrière et ajoutez toutes les souches Ara+ . Introduire à la pipette 100 μL de chaque fiole de compétition nouvellement inoculée dans le tube à essai de solution saline étiqueté pour cet essai de compétition de manière à ce que chacun de ces tubes contienne une dilution globale de 10 000 fois des cultures DM25 préconditionnées qui ont été combinées. Placez les flacons de compétition et les ébauches dans l’incubateur à secousses. Incuber les flacons de compétition à 37 °C pendant 24 ± 1 h avec une agitation orbitale de 120 tr/min sur un diamètre de 1 pouce. Le même jour, immédiatement après avoir placé les flacons de compétition dans l’incubateur, faire tourbillonner soigneusement chaque tube à essai de l’étape 3.4.5 et étaler 80 μL de ces dilutions de 10 000 fois sur des plaques TA comme décrit à l’étape 2.10. Étiquetez le côté du fond de chaque plaque avec la paire de souches qui ont été mélangées, le numéro de répétition et le « Jour 0 » pour indiquer qu’il sera utilisé pour déterminer la représentation initiale de chaque concurrent. Incuber les plaques TA à l’envers dans un incubateur à convection gravitaire à 37 °C jusqu’à ce que les colonies des concurrents Ara− et Ara+ soient visibles et distinguables. Généralement, cela se produit dans les 16-24 heures, mais cela peut prendre plus de temps pour certaines souches évoluées. Comptez le nombre de colonies d’Ara− (rouge) et d’Ara+ (blanc) sur chaque plaque etnotez les résultats.NOTE: Les différences entre les couleurs des colonies Ara- et Ara+ sur les plaques TA deviennent moins nettes avec le temps, même lorsque les plaques sont stockées à 4 ° C, de sorte qu’elles doivent être comptées le plus rapidement possible une fois qu’elles sont retirées de l’incubateur. Des images de plaques TA montrant les apparences typiques des colonies formées par les cellules Ara− et Ara+ sont incluses dans les résultats représentatifs. Cette section contient également des images de colonies courantes de « cas limites » (p. ex., chevauchement ou excroissance de différents types de colonies) et explique comment les compter. Si les taux de croissance et les morphologies des colonies formées sur les plaques TA par l’un des concurrents n’ont pas été caractérisés auparavant, étaler 80 μL d’une dilution de 10 000 fois dans une solution saline à partir des fioles de préconditionnement le jour 0, lorsque les concurrents sont encore séparés les uns des autres. Ensuite, examiner les colonies sur ces plaques de contrôle après incubation à 37 °C pendant 16-24 h ou plus. ALTERNATIVE : Jours 1 et 2 : Poursuite de la compétition de trois joursPour chaque essai de compétition, étiqueter une fiole remplie de 9,9 mL de DM25. Étiquetez les flacons de manière à identifier de manière unique chaque paire de concurrents, le numéro de répétition et le jour du test de compétition. Étiqueter une fiole supplémentaire remplie de 9,9 ml de DM25 pour servir de flan. Sortez les flacons de compétition de la veille de l’incubateur. Examiner leur turbidité à l’œil nu pour vérifier la croissance prévue et détecter la contamination. Transvaser 100 μL de chaque fiole de compétition dans la fiole de milieu frais correspondante pour le lendemain de la compétition. Placez les nouveaux flacons de compétition et les flans dans l’incubateur à secousses. Incuber à 37 °C pendant 24 ± 1 h avec une agitation orbitale de 120 tr/min sur un diamètre de 1 pouce. Répétez les étapes 3.5.1-3.5.4 le jour 2 de la compétition avant de continuer. Jour 1 ou 3 : Terminer la compétition et plaquer pour le décompte finalPour chaque fiole de compétition, préparer deux tubes à essai remplis de 9,9 ml de solution saline. Étiquetez-les de manière à identifier de manière unique chaque paire de concurrents, le numéro de répétition et s’ils sont pour la première ou la deuxième dilution. Sortez les flacons de compétition de l’incubateur. Examinez leur turbidité à l’œil nu pour détecter qu’ils ont grandi et qu’il n’y avait pas de contamination évidente. Introduire à la pipette 100 μL de chaque fiole de compétition dans le premier tube de solution saline pour cette réplique. Les tubes résultants contiennent des dilutions 100 fois des cultures DM25. Vortex chaque tube de dilution de 100 fois pour bien le mélanger et pipeter 100 μL dans le deuxième tube de solution saline pour cette répétition. Les tubes résultants contiennent des dilutions 10 000 fois des cultures DM25. Vortex chaque tube à essai contenant une dilution de 10 000 fois à fond et étaler 80 μL de celui-ci sur une plaque TA comme décrit à l’étape 2.10. Étiquetez le côté du fond de chaque assiette avec la paire de souches qui ont été mélangées, le numéro de répétition et « Jour 1 » pour une compétition d’une journée ou « Jour 3 » pour une compétition de trois jours pour indiquer qu’il sera utilisé pour déterminer la représentation finale de chaque concurrent. Incuber les plaques TA à 37 °C et compter les colonies d’Ara− et d’Ara+ après la croissance, comme décrit à l’étape 3.4.8.REMARQUE: Gardez une trace du numéro de répétition de chaque essai de compétition tout au long de tous les transferts et étapes de placage. La confusion entre les nombres final et initial qui correspondent entre différents tests répétés – même lorsque les deux mêmes concurrents ont été mélangés dans chacun d’eux – entraînera des estimations incorrectes de la condition physique. Calcul et aptitude de la parcelleSi vous utilisez Excel pour calculer et tracer la valeur adaptative relative, téléchargez la feuille de calcul XLS (fichier supplémentaire 1). Si vous utilisez R, installez le package fitnessR31 et téléchargez le modèle de valeurs séparées par des virgules (CSV) (fichier supplémentaire 2) ou générez une nouvelle copie de ce fichier en suivant les instructions de sa vignette. Entrez une « dilution de transfert » de 100 pour les essais de compétition effectués dans la cellule ou la colonne désignée du fichier téléchargé. Inscrivez le nombre total de cycles de croissance quotidiens au cours desquels les concurrents ont été co-cultivés comme le « nombre de transferts » (p. ex., 3 pour une compétition de trois jours). Inscrivez les noms de chaque paire de concurrents dans les cellules ou colonnes désignées avec la souche de référence comme « concurrent1 » et la souche ou la population d’essai comme « concurrent2 ». Pour chaque essai de compétition, entrez le nombre initial et final de colonies respectives dans les colonnes désignées du fichier téléchargé. Si vous utilisez la feuille de calcul Excel, elle affichera désormais la valeur relative moyenne de la condition physique et les limites de confiance de 95 % sur cette estimation. Copiez les résultats pour différentes combinaisons de concurrents dans une autre feuille et créez un graphique qui résume les résultats. Si vous utilisez R pour analyser les données, suivez les instructions de la vignette du package fitnessR pour effectuer ces calculs, générer un fichier CSV avec les valeurs calculées et tracer les résultats.