Dagelijkse overdrachten, archivering van populaties en het meten van fitness in het langetermijnevolutie-experiment met Escherichia coli

1. Dagelijkse overdracht van LTEE-populaties OPMERKING: De twaalf LTEE-populaties worden dagelijks overgebracht door vers medium te enten met 1% van de culturen uit de kolven van de vorige dag. De stappen in dit proces zijn samengevat in figuur 1. De zes Ara− -populaties die zijn gestart met stam REL606 worden aangeduid als A−1 tot A−6, en de zes Ara+ -populaties die zijn gestart met stam REL607 worden aangeduid als A+1 tot A+6. Strikte naleving van de aseptische techniek en van een schema en volgorde voor het overbrengen van de populaties minimaliseert het risico op besmetting en andere verstoringen. Desinfecteer het oppervlak waarop de LTEE-overdrachten worden uitgevoerd door het af te vegen met 70% ethanol of een 10% bleekoplossing. Steek een Bunsen-brander aan om een lokale updraft te creëren en het vlammen van glaswerk mogelijk te maken.OPMERKING: Draag laboratoriumhandschoenen om besmetting te voorkomen. Voor de veiligheid rond een open vuur is het van cruciaal belang om alleen handschoenen te gebruiken die zijn gemaakt van een materiaal zoals nitril dat niet brandbaar is. Bereid dertien borosilicaatkolven van 50 ml met daarop 20 ml borosilicaat- of polypropyleenbekers die door autoclaveren zijn gewassen en gesteriliseerd. Controleer de kolven op zichtbaar vuil en vervang alle kolven die niet perfect schoon zijn. Etiketteer zes kolven A−1 tot en met A−6 met een rode stift en de overige zes kolven A+1 tot en met A+6 met een zwarte stift. Label de laatst overgebleven kolf, die leeg zal zijn, met de datum in maand/dagnotatie en de dag van de week. Vul elk van de 13 kolven met 9,9 ml DM25-medium met behulp van een steriele serologische pipet van 10 ml. Vlam de mond van elke kolf na het verwijderen van het bekerglas dat als deksel dient en voordat u het bekerglas vervangt. Vlam de punt van de pipet tussen het vullen van elke kolf.OPMERKING: Instructies voor het maken van DM25 zijn online beschikbaar30. Als u een plastic serologische pipet gebruikt, laat dan de punt van het vlammen achterwege of beperk de tijd in de vlam om te voorkomen dat het plastic smelt. Verwijder de LTEE-kolven van de vorige dag uit de broedmachine. Onderzoek elke kolf door deze tegen het licht te houden om de troebelheid en kleur ervan te beoordelen, controleer de integriteit van de kolf en zoek naar de aanwezigheid van vreemde stoffen.OPMERKING: Met het blote oog zullen alle Ara- en Ara+ culturen er enigszins troebel uitzien in vergelijking met de blanco, behalve A−3, die ~ 10 keer troebeler zal zijn dan de andere als gevolg van groei op citraat in het medium. Veel externe microbiële verontreinigingen kunnen ook op citraat groeien, dus verhoogde troebelheid in andere populaties dan A-3 duidt waarschijnlijk op besmetting. Zie de sectie Representatieve resultaten voor afbeeldingen van de LTEE-culturen vóór een overdracht. OPTIONEEL: Bevestig dat elke LTEE-cultuur de verwachte troebelheid heeft door 1 ml van de blanco en 1 ml van elke cultuur in plastic cuvetten van 1 cm te pipetteren en optische dichtheidsmetingen bij 600 nm (OD600) te doen met behulp van een spectrofotometer na het leegmaken van het instrument.OPMERKING: Deze extra stap kan nuttig zijn voor onderzoekers die nieuw zijn in het werken met de LTEE en niet zeker zijn over het beoordelen van de troebelheid met het oog, evenals voor het documenteren en onderzoeken van vermoedelijke anomalieën. Neem pas monsters voor het meten van OD600 uit de kolven van de vorige dag na het voltooien van de normale overbrengingen van de dag naar nieuwe kolven (de volgende stappen) om het risico op besmetting van de celpopulaties die verder zullen worden vermeerderd als de OD600-waarden zijn zoals verwacht, te minimaliseren. Zie de sectie Representatieve resultaten voor typische OD600-waarden voor LTEE-culturen. Breng met behulp van een P200-micropipettor met een steriele filterpunt 100 μL cultuur van elke LTEE-kolf over in de overeenkomstige kolf met verse DM25. Begin met A−1 en zet vervolgens A+1 over. Ga daarna verder met afwisselen tussen de -en + populaties. Om bij te houden welke culturen zijn overgebracht, verschuift u kolven naar links na het pipetteren van of naar hen.OPMERKING: De strikte volgorde van overdrachten en afwisseling tussen Ara- en Ara+ populaties helpt bij het voorkomen en detecteren van kruisbesmetting en verwisselingen. Neem een strikte aseptische techniek in acht: gebruik een verse pipetpunt voor elke overdracht, vlam de monden van kolven onmiddellijk na het losmaken en voordat u opnieuw wordt aangebracht, en veeg de loop en de uitwerper van de micropipettor af met een pluisvrij papieren doekje bevochtigd met 70% ethanol tussen elke overdracht. Bleekmiddel mag nooit worden gebruikt om micropipettors te desinfecteren, omdat zelfs sporenhoeveelheden de culturen kunnen doden. Incubeer de nieuw geënte kolven bij 37 °C gedurende 24 ± 1 uur met 120 rpm orbitaal schudden over een diameter van 1 inch. Bewaar de culturen van de vorige dag bij 4 °C. Bewaar deze back-upculturen gedurende twee dagen. Gooi oudere culturen weg die drie dagen eerder bij 4 °C zijn bewaard.OPMERKING: De culturen van de vorige twee dagen bieden twee complete sets back-ups waarmee het experiment opnieuw kan worden gestart, indien nodig, als er een probleem of ongeluk optreedt, of als besmetting van de culturen van de vorige dag wordt ontdekt voorafgaand aan de overdracht (bijvoorbeeld vreemde kleuring of onverwachte deeltjes). Voer de tijd, datum, overdrachtsnummer, naam of initialen in van de onderzoeker die de overdrachten heeft uitgevoerd, of de culturen al dan niet in orde waren en alle andere relevante informatie in het overdrachtslogboeknotitieboek. Ga verder met stap 1.12-1.14 als een van de volgende situaties zich voordoet: (1) de blanco van de vorige dag is verontreinigd, (2) een kolf of het deksel ervan is gebarsten of gebroken, (3) een kolf bevat vreemd materiaal, (4) een kolf wordt omgekieperd of gevallen tijdens het overbrengen, of (5) er is een andere gebeurtenis of waarneming die het voortzetten van deze kolven twijfelachtig maakt. Als er problemen, ongelukken of vermoedens van besmetting zijn met de LTEE-culturen van de vorige dag, draag ze dan niet over. Bewaar in plaats daarvan de hele set van twaalf culturen bij 4 °C voor later onderzoek en verdere karakterisering. Haal de kolven op met de back-upculturen die van de dag ervoor zijn overgebracht en bij 4 °C zijn bewaard. Leg ze op het bankje om op te warmen tot kamertemperatuur. Draai elke kolf voorzichtig rond om de cellen te resuspenderen. Breng over van de reservekolven naar het nieuwe stel kolven met vers medium en zet het experiment normaal voort zoals beschreven in de stappen 1.6-1.11. Noteer in het overdrachtslogboek dat de back-upculturen zijn gebruikt en noteer hetzelfde overdrachtsnummer als de dag ervoor.OPMERKING: Zelfs als er een probleem wordt geconstateerd in slechts één populatiekolf, breng dan alle twaalf populaties over van de reservekolven, zodat het aantal generaties dat in alle populaties is verstreken in fase blijft. Indien verontreiniging wordt geconstateerd in de bij 4 °C opgeslagen reservekolven, moeten de getroffen LTEE-populaties opnieuw worden opgestart uit bevroren voorraden volgens de procedure die is beschreven in de stappen 3.1-3.2 voor populatiemonsters. Het overdrachtsnummer voor de LTEE mag niet worden verhoogd tot de groei van de eerste culturen in DM25 na de heropleving. 2. Archivering van de LTEE-populaties OPMERKING: Monsters van de LTEE-populaties worden elke 75 overdrachten ingevroren. De populaties groeien ~ 6 2/3 generaties per dag na de 100-voudige overdrachtsverdunning, dus deze periode komt overeen met ~ 500 generaties. Tijdens het archiveren worden de LTEE-populaties ook op verschillende soorten agarmedia geplakt om te controleren op besmetting. Optioneel kunnen representatieve klonen uit deze platen worden geplukt en op dit moment worden gearchiveerd. Deze stappen zijn samengevat in figuur 1. Bereid op de dag voor de geplande bevriezing of een paar dagen ervoor drie soorten agarplaten voor: Minimal Glucose (MG), Minimal Arabinose (MA) en Tetrazolium Arabinose (TA). Maak twaalf borden van elk type agar, plus een paar extra’s. Bereid ook ten minste 250 ml van 0,85% (w / v) steriele zoutoplossing en 50 ml van 80% (v / v) steriele glycerol.OPMERKING: Recepten voor alle media en oplossingen zijn online beschikbaar30. De dag voordat de LTEE een generatie bereikt die een veelvoud is van 500 voor het reguliere archiveringsschema, is de74e dag sinds de laatste bevriezing plus eventuele dagen die zijn toegevoegd als gevolg van overdrachten van de 4 ° C back-upkolven wanneer problemen werden gedetecteerd of vermoed. OPTIONEEL: Als u klonale isolaten uit de LTEE-populaties archiveert, bereid dan extra benodigdheden voor: het isoleren van drie klonen uit elke populatie vereist 72 MG-platen, 80 ml 80% (v / v) glycerol en 370 ml DM1000. Bereid een extra set van twaalf kolven voor bij het uitvoeren van stap 1.2 van de dagelijkse LTEE-overdrachten op de dag vóór de geplande bevriezing. Label zes van de extra kolven xA−1 tot en met xA−6 met een rode stift en de andere zes xA+1 tot en met xA+6 met een zwarte stift.OPMERKING: De “x” geeft aan dat de extra set kolven zal worden gebruikt voor archivering en onderscheidt deze van de andere set kolven die zullen worden gebruikt om de dagelijkse overdracht van de LTEE parallel voort te zetten. Vul elk van de extra kolven die zullen worden gebruikt voor archivering met 14,85 ml DM25 met behulp van een serologische pipet van 25 ml bij het uitvoeren van stap 1.4 van de dagelijkse LTEE-overdrachten. Voltooi de normale LTEE-overdracht zoals beschreven in stap 1.5−1.11. Herhaal vervolgens de instructies voor stap 1.8, maar breng deze keer 150 μL over van elk van de LTEE-culturen van de vorige dag naar de extra kolven van 14,85 ml verse DM25 die zullen worden gebruikt voor archivering.OPMERKING: Vermijd in deze en alle volgende stappen besmetting en verwarring door deze richtlijnen te volgen. Begin met populatie A−1, breng dan A+1 over en ga dan verder met afwisselend − en + populaties. Veeg de loop en de uitwerper van de micropipettor af met een pluisvrij papieren doekje bevochtigd met 70% ethanol bij het wisselen van populaties. Verschuif kolven en reageerbuizen in hun trays of rekken na het pipetteren van of naar hen om bij te houden welke overdrachten zijn voltooid. Incubeer de set van twaalf kolven voor archivering bij 37 °C gedurende 24 ± 1 uur met 120 rpm orbitaal schudden over een diameter van 1 inch naast de twaalf LTEE-culturen en de blanco zoals beschreven in stap 1.9. Bereid voorraden voor voor het plateren van de LTEE-populaties ten minste één uur voordat de LTEE-overdrachten op de dag van de bevriezing moeten worden uitgevoerd.Selecteer twaalf MG, twaalf MA en twaalf TA agar platen. Inspecteer ze visueel om er zeker van te zijn dat ze geen duidelijke besmetting hebben. Label één van elk type plaat voor elk van de twaalf LTEE-populaties (A−1 tot en met A+6).OPMERKING: Schrijf bij het etiketteren van borden op de zijkanten van de bodem van de petrischaal. Dit is belangrijk om kolonies niet te verduisteren wanneer men ze van onder de agar wil onderzoeken of fotograferen. Schrijf niet op de deksels, omdat deze door elkaar kunnen worden gehaald. Plaats de agarplaten minstens 20 minuten in een incubator van 37 °C om ze op te warmen voordat u ze in stap 2.10 gebruikt. Bereid 24 reageerbuizen met 9,9 ml zoutoplossing. Schik ze in twaalf sets van elk twee buizen. Label elk van de twee sets van twaalf reageerbuizen op dezelfde manier als de platen, voeg een “1” of een “2” toe onder de LTEE-populatie-id om de volgorde aan te geven waarin ze zullen worden gebruikt voor het maken van verdunningen van die populatie. Voer stap 1.1-1.11 uit met behulp van de kolven die de dagelijkse overdracht van de LTEE zoals gewoonlijk voortzetten. Verwijder tijdens stap 1.5 ook de twaalf kolven met de extra culturen voor archivering uit de schudincubator. Pipetteer 100 μL van de cultuur uit elk van de twaalf extra kolven voor archivering in de eerste reageerbuis met zoutoplossing in het paar voor die LTEE-populatie. Draai de buizen met deze 100-voudige verdunningen grondig. Pipetteer vervolgens 100 μL van elk naar de overeenkomstige tweede buis zoutoplossing. Vortex de laatste 10.000-voudige cultuurverdunningen grondig. Pipetteer 80 μL uit elk van de buizen met een 10.000-voudige cultuurverdunning tot de gelabelde TA-, MG- en MA-platen voor die populatie. Verdeel de vloeistof gelijkmatig over het agaroppervlak met behulp van een steriele strooistaaf of steriele strooikralen, naar wens. Herhaal dit totdat alle twaalf populaties op alle drie de soorten media zijn geplaatst. Laat de platen indien nodig drogen totdat er geen vloeistof meer op de agar zichtbaar is. Plaats de platen ondersteboven (met de agarzijde naar boven) in een convectie-incubator voor zwaartekracht die is ingesteld op 37 °C.OPMERKING: Het ondersteboven incuberen van platen voorkomt dat de agar uitdroogt en voorkomt dat condensatie op het agaroppervlak druppelt. Beweging van cellen in vloeistof op het agaroppervlak tijdens incubatie kan kolonies uitsmeren en onjuiste kolonietellingen opleveren. Voeg 3 ml steriele 80% (v/v) glycerol toe aan elk van de twaalf extra kolven die bestemd zijn voor archivering. Meng grondig door te wervelen en zachtjes te vortexen. Verdeel het mengsel uit elke kolf over steriele cryovialen die zijn geëtiketteerd met een eenduidig identificatienummer voor het monster, de LTEE-populatie waartoe het monster behoort, de generatie waarin het is ingevroren, dat het een gemengd (populatie)monster is en de datum. Pipetteer 6 ml in één grote injectieflacon en 1,25 ml in elk van de zes kleine injectieflacons.OPMERKING: De grote injectieflacon is de werkvoorraad. Eén kleine injectieflacon is een back-up voor het geval de werkvoorraad uitgeput is of besmet raakt. De andere vijf kleine flesjes zijn kopieën die naar andere laboratoria kunnen worden verzonden. Vries de gevulde injectieflacons in bij −80 °C. Onderzoek en documenteer de groei en morfologieën van kolonies op de TA-, MG- en MA-platen na 24 uur en 48 uur incubatie.OPMERKING: Zie de sectie Representatieve resultaten voor afbeeldingen en beschrijvingen van kolonies gevormd door de REL606- en REL607-voorouders en elk van de twaalf LTEE-populaties toen ze werden geplateerd op 76.000 generaties. OPTIONEEL: Voer de volgende stappen uit bij het archiveren van klonale isolaten.Kies drie klonale isolaten (kolonies) voor elke LTEE-populatie uit de MG-platen, streep ze elk afzonderlijk op een nieuwe MG-plaat en incuber deze platen gedurende 16-24 uur bij 37 °C.OPMERKING: Als kolonies met verschillende morfologieën aanwezig zijn, is de standaardpraktijk in de LTEE om te bemonsteren voor maximale diversiteit door eerst het meest voorkomende type te kiezen en vervolgens verdere kolonies uit minderheidstypen te selecteren. Men kan ook een willekeurige bemonsteringsstrategie gebruiken door stippen aan de onderkant van de bodem van de petrischaal te markeren voordat cellen worden verspreid en vervolgens de geïsoleerde kolonie te kiezen die het dichtst bij elk merkteken na de groei ligt. Streep de volgende dag een representatieve kolonie van elke plaat op een nieuwe MG-plaat en incuber deze platen gedurende 16-24 uur bij 37 °C. De volgende dag ent u een geïsoleerde kolonie van elke MG-plaat in een kolf met 10 ml vers DM1000. Vul ook een extra kolf met 10 ml DM1000 om te dienen als een niet-geinoculeerde blanco om te testen op mediaverontreiniging. Incubeer de kolven bij 37 °C gedurende 16-24 uur met 120 rpm orbitaal schudden over een diameter van 1 inch. Voeg na incubatie 2 ml steriele 80% (v/v) glycerol toe aan elke kolf en wervel om te mengen. Verdeel 1,25 ml aliquots uit elke kolf in kleine, steriele injectieflacons met een unieke identificatie voor elke kloon, de LTEE-populatie en de generatie van herkomst, dat het een klonaal monster is en de datum. Vries de gevulde injectieflacons in bij −80 °C. 3. Competitieve fitnesstests OPMERKING: In de LTEE wordt reproductieve fitheid gekwantificeerd in termen van het relatieve aantal verdubbelingen dat verschillende bacteriën bereiken gedurende een of meer 24-uurs kweekcycli onder dezelfde omstandigheden als de dagelijkse overdrachten. In het bijzonder is de relatieve fitheid van de ene concurrent ten opzichte van de andere de verhouding van hun gerealiseerde verdubbelingspercentages wanneer ze het tegen elkaar opnemen in een co-cultuur. Elke deelnemer in een paar kan een volledige populatie zijn of een klonaal isolaat dat eerder werd gearchiveerd als onderdeel van het bevroren “fossielenbestand” van de LTEE. Als alternatief kunnen een of beide concurrenten een kloon zijn die genetisch is gemodificeerd om specifieke mutaties toe te voegen of te verwijderen om hun effecten te testen. De twee concurrenten moeten tegengestelde Ara+/Ara-toestanden hebben, omdat deze genetische marker wordt gebruikt om hen tijdens deze test te differentiëren. De algemene workflow voor een wedstrijdtest wordt weergegeven in figuur 2. De duur van de co-kweekfase kan worden verlengd van één tot drie (of meer) dagen om de precisie van fitnessschattingen te verbeteren bij het testen op verschillen tussen concurrenten die bijna gelijk zijn. Zie de Disussion voor andere kritische overwegingen en mogelijke wijzigingen van dit protocol. Figuur 2: Flow chart van de concurrentietest. De volledige procedure voor een eendaagse wedstrijdtest wordt getoond. De driedaagse procedure gaat door met het alternatieve traject op dag 1 en dag 2 tot de beplating op dag 3 op dezelfde manier als voor dag 1 van de eendaagse competitie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Benodigdheden voorbereidenBepaal hoeveel LTEE-stammen en/of -populaties van concurrenten zullen worden gebruikt en hoeveel replicerende competitietests voor elk paar concurrenten zullen worden uitgevoerd. Bereid de benodigde benodigdheden voor zoals beschreven in de volgende stappen.OPMERKING: Recepten voor alle media en oplossingen zijn online beschikbaar30. De kolven en reageerbuizen die nodig zijn voor alle dagen van een wedstrijdexperiment kunnen vooraf worden gevuld of indien nodig op de dagen dat ze zullen worden gebruikt. Als kolven en reageerbuizen van tevoren zijn gevuld, bewaar ze dan bij kamertemperatuur in het donker om verdamping te minimaliseren. TA-platen moeten ten minste twee dagen van tevoren worden voorbereid wanneer ze zullen worden gebruikt, zodat ze na het gieten voldoende kunnen drogen om cultuurverdunningen te kunnen verspreiden. Bereid altijd een paar extra kolven, reageerbuizen en TA-platen voor, zodat een experiment kan worden voortgezet als er pipetteerfouten, vervuilde platen of andere kleine ongelukken zijn. Vul voor de opwekkingsdag (dag −2) één steriele erlenmeyer van 50 ml afgedekt met een bekerglas van 20 ml met 9,9 ml DM1000 of lysogenesebouillon (LB) per stam of populatie van E. coli die als concurrent zal worden gebruikt. Vul nog een kolf met 9,9 ml van hetzelfde medium om te dienen als een niet-geënte blanco. Vul voor de voorconditioneringsdag (dag −1) één reageerbuis met 9,9 ml 0,85% (w/v) steriele zoutoplossing per concurrent, twee kolven met 9,9 ml DM25 per replicatietest tussen een paar concurrenten en nog een kolf met 9,9 ml DM25 voor een blanco. Voor de dag dat de wedstrijd begint (dag 0), vult u één kolf met 9,9 ml DM25, vult u één reageerbuis met 9,9 ml 0,85% (m/v) steriele zoutoplossing en bereidt u één TA-plaat voor per wedstrijdtestreplicatie. Vul nog een kolf met 9,9 ml DM25 om als blanco te dienen. ALTERNATIEF: Voor elke dag van een meerdaagse wedstrijd voorbij de eerste, vul één kolf met 9,9 ml DM25 per wedstrijdreplicatie en vul nog een kolf met 9,9 ml DM25 voor een blanco. Voor de laatste dag van de wedstrijd (bijv. Dag 1 of Dag 3), vult u twee reageerbuizen met 9,9 ml van 0,85% (m / v) steriele zoutoplossing en bereidt u één TA-plaat per wedstrijdreplicatie voor. Dag −2: Deelnemers afzonderlijk nieuw leven inblazen in DM1000 of LBEtiketteer voor elk van de deelnemers een kolf gevuld met 9,9 ml DM1000 of LB. Label een extra kolf gevuld met 9,9 ml van dezelfde partij medium om te dienen als een niet-geënte blanco om te testen op verontreiniging.OPMERKING: Bevroren voorraden worden nieuw leven ingeblazen in LB of DM1000 voor een meer uniform en voorspelbaar herstel van gecryopreserveerde cellen. De glycerol die als cryoprotectant wordt gebruikt, kan worden gemetaboliseerd door E. coli, wat zal leiden tot hogere celdichtheden dan verwacht als monsters worden gereanimeerd in DM25. LB en DM1000 ondersteunen de groei tot zulke hoge celdichtheden dat deze complicatie verwaarloosbaar wordt. Haal de cryovialen met de diepvriesvoorraden van de concurrerende stammen uit de vriezer van −80 °C. Bewaar de injectieflacons gekoeld in een ijsemmer terwijl u ze gebruikt. Nadat elke bevroren voorraad is ontdooid, vortex het grondig om de E. coli-cellen te resuspenderen. Als u een kloon nieuw leven inblaast, ent u de kolf met vers medium met 12 μL van de bevroren bouillon. Als u een populatie nieuw leven inblaast, ent u de kolf met 120 μL van de bevroren bouillon.OPMERKING: Het volume van 120 μL van de ingevroren voorraad wordt gebruikt voor populaties, zodat het aantal cellen dat nieuw leven wordt ingeblazen ongeveer hetzelfde is als het dagelijkse knelpunt wanneer 1% van de LTEE-populatie wordt overgebracht naar een nieuwe kolf. Het meerdere keren ontdooien en vortexen van bevroren voorraden kan cellen stress bezorgen en de levensvatbaarheid van voorraden in de loop van de tijd verminderen. Als een bepaalde LTEE-populatie of kloon meerdere keren in wedstrijden wordt gebruikt, is het een goede gewoonte om meerdere exemplaren van de voorraad opnieuw te laten groeien en in te vriezen, zodat er geen enkele wordt ontdooid en vele malen opnieuw wordt ingevroren. Incubeer de opwekkingskolven en de blanco bij 37 °C gedurende een nacht (16-24 uur) met 120 rpm orbitaal schudden over een diameter van 1 inch. Dag −1: Randvoorwaarden concurrenten afzonderlijk in DM25Label voor elke deelnemer een reageerbuis gevuld met 9,9 ml zoutoplossing. Label voor elke herhalingstest tussen een paar concurrenten twee kolven van 50 ml gevuld met 9,9 ml DM25, elk met het replicatienummer en de naam van een van de concurrenten. Label een extra kolf gevuld met 9,9 ml DM25 om als blanco te dienen. Haal de kolven met daarin de culturen van herleefde concurrenten uit de couveuse. Onderzoek hun troebelheid met het oog om te bevestigen dat ze zijn gegroeid en dat er geen duidelijke besmetting is. Pipetteer 100 μL uit elke kolf in de reageerbuis met zoutoplossing voor die concurrent.OPMERKING: Deze stap verdunt de cultuur 100-voudig, wat nodig is omdat de dichtheid van cellen veel hoger is in LB en DM1000 dan in de DM25-omgeving die wordt gebruikt in de LTEE (zie Representatieve resultaten). Draai elke verdunningsbuis grondig vlak voordat u 100 μL uit de verdunde cultuur in een kolf met verse DM25 pipetteert. Ent twee van deze voorconditioneringskolven voor elke replicaattest, één voor elk van de concurrenten. Incubeer de voorconditioneringskolven en de blanco bij 37 °C gedurende 24 ± 1 uur met 120 rpm orbitaal schudden over een diameter van 1 inch. Dag 0: Begin de competitie door concurrenten en plaat te mengen voor de eerste tellingenEtiketteer voor elke wedstrijdtest één kolf gevuld met 9,9 ml DM25 en één reageerbuis gevuld met 9,9 ml zoutoplossing. Label de kolven en buizen op een manier die elk paar concurrenten en het replicatienummer van de wedstrijdtest uniek identificeert. Label een extra kolf gevuld met 9,9 ml DM25 om als blanco te dienen. Haal de voorconditioneringskolven uit de couveuse. Onderzoek hun troebelheid met het oog om te bevestigen dat ze zijn gegroeid en dat er geen duidelijke besmetting is. Breng 50 μL van de Ara− -concurrent over in de eerste nagebouwde wedstrijdkolf gevuld met verse DM25. Breng onmiddellijk 50 μL van de Ara+ concurrent over in dezelfde concurrentiekolf en meng deze door zachtjes te draaien. Herhaal stap 3.4.3 voor alle replica’s van alle paren concurrenten.OPMERKING: De wedstrijdkolven hebben nu een totale 100-voudige verdunning van E. coli-culturen gekweekt in DM25, dezelfde toestandscellen in de LTEE-ervaring na elke dagelijkse overdracht. De volgorde van het uitvoeren van transfers en mixen is belangrijk. Voeg beide concurrenten onmiddellijk na elkaar aan elke kolf toe, zodat geen van beide een voorsprong krijgt die in het verse medium groeit. Voeg bijvoorbeeld niet de Ara-culturen toe aan alle wedstrijdkolven en ga dan terug en voeg alle Ara+ soorten toe. Pipetteer 100 μL uit elke nieuw geënte wedstrijdkolf in de reageerbuis van zoutoplossing die voor die wedstrijdtest is geëtiketteerd, zodat elk van deze buizen een totale 10.000-voudige verdunning van de geconditioneerde DM25-culturen bevat die werden gecombineerd. Plaats de wedstrijdkolven en blanco in de broedmachine. Incubeer de wedstrijdkolven bij 37 °C gedurende 24 ± 1 uur met 120 rpm orbitaal schudden over een diameter van 1 inch. Op dezelfde dag, onmiddellijk na het plaatsen van de wedstrijdkolven in de couveuse, vortex elke reageerbuis uit stap 3.4.5 grondig en verspreid 80 μL van deze 10.000-voudige verdunningen op TA-platen zoals beschreven in stap 2.10. Label de zijkant van de onderkant van elke plaat met het paar soorten dat werd gemengd, het replicatienummer en “Dag 0” om aan te geven dat het zal worden gebruikt om de initiële vertegenwoordiging van elke concurrent te bepalen. Incubeer de TA-platen ondersteboven in een zwaartekrachtconvectie-incubator bij 37 °C totdat kolonies van zowel de Ara−- als Ara+ concurrenten zichtbaar en te onderscheiden zijn. Over het algemeen gebeurt dit binnen 16-24 uur, maar het kan langer duren voor sommige geëvolueerde stammen. Tel de aantallen Ara− (rode) en Ara+ (witte) kolonies op elke plaat ennoteer de resultaten.OPMERKING: Verschillen tussen de kleuren van Ara- en Ara+ kolonies op TA-platen worden in de loop van de tijd minder duidelijk, zelfs wanneer platen bij 4 °C worden bewaard, dus ze moeten zo snel mogelijk worden geteld zodra ze uit de incubator zijn verwijderd. Afbeeldingen van TA-platen met de typische verschijningsvormen van kolonies gevormd door Ara- en Ara+ -cellen zijn opgenomen in de Representatieve Resultaten. Die sectie bevat ook afbeeldingen van gemeenschappelijke “edge case” -kolonies (bijvoorbeeld overlap of uitgroei van verschillende kolonietypen) en legt uit hoe ze moeten worden geteld. Als de groeisnelheden en morfologieën van kolonies gevormd op TA-platen door een van de concurrenten niet eerder zijn gekarakteriseerd, verspreid dan 80 μL van een 10.000-voudige verdunning in zoutoplossing vanuit de voorconditioneringskolven op dag 0, wanneer de concurrenten nog steeds van elkaar gescheiden zijn. Onderzoek vervolgens kolonies op deze controleplaten na incubatie bij 37 °C gedurende 16-24 uur of langer. ALTERNATIEF: Dag 1 en 2: Vervolg driedaagse competitieEtiketteer voor elke wedstrijdtest één kolf gevuld met 9,9 ml DM25. Label de kolven op een manier die elk paar concurrenten, het replicatienummer en de dag van de wedstrijdtest uniek identificeert. Label een extra kolf gevuld met 9,9 ml DM25 om als blanco te dienen. Haal de wedstrijdkolven van de vorige dag uit de couveuse. Onderzoek hun troebelheid met het oog om de verwachte groei te verifiëren en besmetting te detecteren. Breng 100 μL van elke wedstrijdkolf over in de overeenkomstige kolf met vers medium voor de volgende dag van het vergelijkend onderzoek. Plaats de nieuwe wedstrijdkolven en blanco in de schudincubator. Incubeer ze bij 37 °C gedurende 24 ± 1 uur met 120 rpm orbitaal schudden over een diameter van 1 inch. Herhaal stap 3.5.1-3.5.4 op dag 2 van de wedstrijd voordat u verdergaat. Dag 1 of 3: Finish wedstrijd en bord voor finale tellingenBereid voor elke wedstrijdkolf twee reageerbuizen voor gevuld met 9,9 ml zoutoplossing. Label ze op een manier die elk paar concurrenten uniek identificeert, het replicatienummer en of ze voor de eerste of tweede verdunning zijn. Haal de wedstrijdkolven uit de couveuse. Onderzoek hun troebelheid met het oog om te detecteren dat ze groeiden en dat er geen duidelijke besmetting was. Pipetteer 100 μL uit elke wedstrijdkolf in de eerste buis zoutoplossing voor die replicatie. De resulterende buizen bevatten 100-voudige verdunningen van de DM25-culturen. Vortex elke 100-voudige verdunningsbuis om het grondig te mengen en pipetteer 100 μL naar de tweede buis zoutoplossing voor die replicatie. De resulterende buizen bevatten 10.000-voudige verdunningen van de DM25-culturen. Vortex elke reageerbuis met een 10.000-voudige verdunning grondig en verspreid 80 μL ervan op een TA-plaat zoals beschreven in stap 2.10. Label de zijkant van de onderkant van elke plaat met het paar soorten dat is gemengd, het replicatienummer en “Dag 1” voor een eendaagse wedstrijd of “Dag 3” voor een driedaagse wedstrijd om aan te geven dat deze zal worden gebruikt om de uiteindelijke vertegenwoordiging van elke deelnemer te bepalen. Incubeer TA-platen bij 37 °C en tel de Ara−- en Ara+ -kolonies na groei zoals beschreven in stap 3.4.8.OPMERKING: Houd het replicatienummer van elke wedstrijdtest bij tijdens alle overdrachten en platingstappen. Verwarrend welke eind- en initiële tellingen overeenkomen tussen verschillende replicatietests – zelfs wanneer dezelfde twee concurrenten in elk ervan werden gemengd – zal resulteren in onjuiste fitnessschattingen. Berekening en plotgeschiktheidAls u Excel gebruikt voor het berekenen en plotten van de relatieve geschiktheid, downloadt u de XLS-spreadsheet (aanvullend bestand 1). Als u R gebruikt, installeert u het fitnessR-pakket31 en downloadt u de sjabloon voor door komma’s gescheiden waarden (CSV) (aanvullend bestand 2) of genereert u een nieuwe kopie van dit bestand volgens de aanwijzingen in het vignet. Voer een “overdrachtsverdunning” van 100 in voor de vergelijkende onderzoeken die worden uitgevoerd in de aangewezen cel of kolom in het gedownloade bestand. Voer het totale aantal dagelijkse groeicycli in waarin de deelnemers werden gecocultiveerd als het “aantal transfers” (bijvoorbeeld 3 voor een driedaagse competitie). Voer de namen van elk paar deelnemers in de aangewezen cellen of kolommen in met de referentiestam als “concurrent1” en de teststam of populatie als “concurrent2”. Voer voor elke wedstrijdtestreplicatie de respectievelijke initiële en laatste kolonietellingen in de aangewezen kolommen van het gedownloade bestand in. Als u de Excel-spreadsheet gebruikt, worden nu de gemiddelde relatieve fitnesswaarde en 95% betrouwbaarheidslimieten voor deze schatting weergegeven. Kopieer de resultaten voor verschillende combinaties van concurrenten naar een ander blad en maak een grafiek die de resultaten samenvat. Als u R gebruikt om de gegevens te analyseren, volgt u de aanwijzingen in het vignet voor het fitnessR-pakket om deze berekeningen uit te voeren, voert u een CSV-bestand uit met de berekende waarden en plot u de resultaten.