JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerde kalsiyum ve kontraktilite parametrelerinin gerçek zamanlı ölçümleri

Published: May 26, 2023
doi:
10.3791/65326
, , , , , ,
1Division of Physiology, Amsterdam UMC,Vrije University, 2Heart Failure & Arrhythmias,Amsterdam Cardiovascular Sciences, 3CytoCypher BV, 4Division of Clinical Pharmacology,Vanderbilt School of Medicine

Summary

Burada, optik tabanlı bir platform kullanarak insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerde kontraktilite ve kalsiyum ölçümleri yapmak için yerleşik bir yöntem açıklanmaktadır. Bu platform, araştırmacıların mutasyonların etkisini ve çeşitli uyaranlara verilen tepkiyi hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde incelemelerini sağlar.

Abstract

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM’ler), kardiyomiyosit fonksiyonundaki mutasyon aracılı değişiklikleri incelemek ve stresörlerin ve ilaç müdahalelerinin etkilerini tanımlamak için güçlü bir araçtır. Bu çalışmada, bu optik tabanlı sistemin, hiPSC-CM’lerin fonksiyonel parametrelerini 2D olarak değerlendirmek için güçlü bir araç olduğu gösterilmiştir. Bu platformu kullanarak, farklı plaka düzenlerinde iyi korunmuş bir sıcaklık ortamında eşleştirilmiş ölçümler yapmak mümkündür. Üstelik bu sistem, araştırmacılara anlık veri analizi imkanı sağlıyor.

Bu makale, modifiye edilmemiş hiPSC-CM’lerin kontraktilitesini ölçmek için bir yöntemi açıklamaktadır. Büzülme kinetiği, 250 Hz örnekleme frekansında gevşeme sırasında alınan bir referans çerçevesine göre piksel korelasyon değişikliklerine dayalı olarak 37 °C’de ölçülür. Ek olarak, hücreye Fura-2 gibi kalsiyuma duyarlı bir florofor yüklenerek hücre içi kalsiyum geçişlerinin eşzamanlı ölçümleri elde edilebilir. Bir hiperswitch kullanılarak, kasılma ölçümlerinin alanına karşılık gelen 50 μm çapında bir aydınlatma noktasında oransal kalsiyum ölçümleri gerçekleştirilebilir.

Introduction

Kalp yetmezliği dünya çapında önde gelen ölüm nedenidir. 2019’da kardiyovasküler hastalık dünya çapında 18,6 milyon ölüme neden oldu ve bu da son on yılda %17,1’lik bir artışı yansıtıyor1. Araştırmacıların kalp yetmezliğini önlemek ve tedavi etmek için ilaç hedeflerini belirleme çabalarına rağmen, hasta sonuçları hala kötüdür2. Hayvan modellerinin patofizyolojisindeki insanlara göre farklılık, kalp yetmezliği tedavisinin optimizasyonu için sınırlı başarının altında yatan faktörlerden biri olabilir3. Hastalığı modellemek ve yeni ilaç bileşiklerinin toksisitesini ve etkinliğini test etmek için ek insan benzeri modeller garanti edilir.

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM’ler), stresörler, iskemi, değişmiş metabolizma veya patojenik gen varyantları tarafından indüklenen hücresel patomekanizmaları ve ilaç müdahalelerinin etkinliğini ve toksisitesini tanımlamak için güçlü bir araçtır4. HiPSC-CM’lerin fonksiyonel özellikleri üzerindeki etkileri tanımlamak için, hücresel kasılmaların sistolik ve diyastolik özelliklerini tarafsız ve tekrarlanabilir bir şekilde ölçen yüksek hızlı bir sistem garanti edilir. Bu çalışmanın genel amacı, optik tabanlı bir sistemin, hiPSC-CM’lerin fonksiyonel parametrelerinin gerçek zamanlı analizlerini gerçekleştirmek için güçlü bir araç olduğunu göstermektir.

Şu anda, hiPSC-CM’lerin kontraktilitesini değerlendirmek için birden fazla platform vardır. Bununla birlikte, mevcut sistemler ya yavaş bir okuma sunar ya da gerekli sayıda hücre zor olabilir. Etiketsiz video ölçüm sistemleri5,6, çok fazla depolama alanı gerektiren ve video alımı sırasında doğrudan geri bildirimden yoksun olan videoların post-hoc analizine dayanır. Ek olarak, yeterli zamansal ve uzamsal çözünürlüğün elde edilmesi zordur ve yetersiz örneklemeye neden olabilir. Floresan raportörlerle kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) / Cas9 ile düzenlenmiş hiPSC-CM’ler7 gibi kardiyomiyosit özelliklerini belirlemeye yönelik diğer yöntemler, hücrelerin gen stabilitesine müdahale edebilir ve özel laboratuvar uzmanlığı gerektirebilir.

Yukarıda belirtilen sınırlamaların üstesinden gelmek için, bu çalışmada benzersiz bir optik tabanlı ölçüm sistemi geliştirilmiş ve tanıtılmıştır. Bu platform, modifiye edilmemiş hiPSC-CM’leri plaka boyutunda herhangi bir sınırlama olmaksızın, gerekli herhangi bir plaka formatında yeniden kaplayarak kontraktilite ölçümlerini mümkün kılar. Ayrıca, gerçek zamanlı ölçümler, hiPSC-CM’lerin fonksiyonel parametrelerinin doğrudan gözlemlenmesine ve analizine olanak tanır ve böylece protokolleri anında ayarlamak ve optimize etmek için deneysel bir ayar sağlar. Ayrıca, her ölçümün konumu saklanır, bu da aynı numune üzerinde eşleştirilmiş ölçümleri mümkün kılar ve böylece deneylerin gücünü artırır.

Optik tabanlı sistemi göstermek için, bir kontrol hiPSC-CM hattında kontraktilite ölçümleri yapıldı. Bu kontrol hiPSC hattı, normal karyotip8’e sahip sağlıklı bir erkek donörün dermal fibroblastından üretildi. Büzülme kinetiği, 250 Hz örnekleme frekansında gevşeme sırasında alınan bir referans çerçevesine göre piksel korelasyon değişikliklerine dayalı olarak 37 °C’de ölçüldü. Kasılmanın kesin başlangıcı her zaman kesin olarak belirlenemediğinden, tepe yüksekliğinin %20’sine ulaşılan zaman noktası (%20’si) zirveye kadar geçen sürenin ölçümleri için başlangıç noktası olarak alınmıştır. Bunu yaparak, bir örneklem içinde bu parametre için daha az değişkenlik bulundu. Benzer şekilde, sinyalin taban çizgisine döndüğü kesin anı değerlendirmek zor olduğundan, zirveden taban çizgisine dönüşün %80’ine ulaşmak için geçen süre (taban çizgisine %80’e kadar geçen süre) gevşeme süresini tanımlamak için kullanılmıştır.

Genel kasılma ölçümleri, istirahat atım frekanslarını,% 20 pikten pik kasılmaya kadar geçen süreyi (TP. Con) ve pik kasılmadan taban çizgisinin% 80’ine kadar geçen süre (TB. Con80) (Şekil 1B). Bir stres etkeninin etkisini test etmek için, hücreler izoprenaline (ISO) ile inkübe edildi. Ek olarak, kasılma ölçümleri ile tesadüfen, hücrelere 250 Hz’lik bir örnekleme frekansında Fura-2-asetoksimetil ester (Fura-2) yüklenerek Ca2+ geçici akımları ölçüldü. Ca 2+ ölçüm verileri, Ca2+ geçici (TP.Ca) içinde %20 tepeden tepeye kadar geçen süre ve taban çizgisinin (TB.Ca 80) tepeden %80’ine kadar geçen süre olarak gösterilir (Şekil 1C). Her alan için ortalama kasılma ve kalsiyum kinetik parametreleri elde etmek için hızlı, otomatik bir veri analiz aracı kullanıldı.

Protocol

1. Hücre kültürü ortamının ve reaktiflerinin hazırlanması 49 mL RPMI1640’ye 1 mL B27 takviyesi (50x) ekleyerek hiPSC-CM ortamını hazırlayın. Önce 45 mL hiPSC-CM ortamına 5 mL knockout serum replasmanı ekleyerek yeniden kaplama ortamını hazırlayın. Daha sonra 22.5 μL Y-27632 ROCK inhibitörü (1:2.000 seyreltme; stok konsantrasyonu: 10 mM) ekleyin ve iyice karıştırın. Bodrum membran kaplı plakaları aşağıda açıklandığı gibi hazırlayın:Bir şişe bazal membranı gece boyunca buzdolabında veya bir buz kutusunda çözdürün. Bazal membranı uygun miktarda Dulbecco’nun modifiye edilmiş Eagle’s medium/Ham’s F12 (DMEM/F12) ile seyreltin. Her bazal membran partisi farklı bir konsantrasyona sahip olduğundan, 1 mg/1 mL seyreltmeye ulaşmak için gereken DMEM/F12 miktarını hesaplayın. -20 °C’de saklamak için 0,5 veya 1 mL alikotlar yapın.NOT: Adım 1.3.2’nin bir akış başlığı içindeki buz üzerinde yapılması gerekir. 0.5 mL bazal membran alikotunu çözün ve 6 mL DMEM / F12 ile seyreltin. İyice karıştırın. 24 oyuklu bir plakaya 250 μL seyreltilmiş bazal membran/kuyu pipetleyerek plakayı kaplayın. Farklı plaka formatları için her bir oyuğun yüzey alanına göre hesaplayın, örneğin, 6 oyuklu bir plakada 1 mL/kuyu. Plakayı 37 °C’lik bir inkübatörde 1 saat inkübe edin. 2 mM alikot hazırlamak için üreticinin kılavuzuna göre Fura-2’yi dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözerek Fura-1 alikotlarını hazırlayın. Alikotları -20 °C’de saklayın. 2. hiPSC-CM’lerin kültürlenmesi Bir şişe hiPSC-CM’yi 37 °C’lik bir su banyosunda çözdürün. Şişenin çözülmüş içeriğini 15 mL’lik bir tüpe aktarın. Hücrelere damla damla 10 mL yeniden kaplama ortamı ekleyin. Hücreleri 100 × g’da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve 1 mL yeniden kaplama ortamı ekleyin. Peleti yeniden süspanse etmek ve hücre kümelerini çıkarmak için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Hücre sayısını saymak için bir hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanın. Bodrum membranını inkübe edilmiş plakadan çıkarın ve yeniden kaplama ortamı ile değiştirin. Hücreleri, bazal membranla kaplanmış 6/12/24/48/96 oyuklu bir plaka üzerine uygun hücre yoğunluğuna sahip bir plaka (örneğin, 24 oyuklu bir plakada 250.000 hücre/kuyu) ile kaplayın.NOT: Ca2+ geçici deneyler için, hücreleri cam tabanlı plakalara yerleştirin. Ertesi gün ortamı hiPSC-CM kültür ortamı ile değiştirin ve ardından ortamı 24 oyuklu bir plakada 0,5 mL / kuyu kullanarak her gün yenileyin. HiPSC-CM’ler çözülme ve yeniden kaplamadan sonra iyileştikten sonra (bu protokolde yeniden kaplamadan 3-5 gün sonra) kontraktilite ölçümlerini gerçekleştirin.NOT: Eşit olmayan hücre yeniden kaplaması durumunda, bir grup hücrenin yeniden kaplanan hücrelerin geri kalanıyla temas halinde olmaması ve düzensiz veya senkronize olmayan bir vuruş modeli göstermesi mümkündür. Asenkronizmi önlemek için, hücrelerin eşit dağılımına ve her kuyucukta senkronize edilmiş iyi bağlanmış bir hiPSC-CM tek katmanına sahip olunması tavsiye edilir. 3. Kasılma ölçümleri Optik tabanlı ölçüm sistemini, mikroskop ışık yayan diyot (LED) ışık kaynağını ve bilgisayarı açın (bkz. Programı açın ve yeni bir dosya açın. Ekranın sol üst kısmındaki Dosya altında, Yeni’yi tıklatın. Topla’ya tıklayın, Deneyler’i seçin ve ardından “iPSC + Kalsiyum”u seçin. Klima kontrol cihazını açın. Sıcaklığı 37 °C’ye ve CO2 seviyesini %5’e ayarlayın. HiPSC-CM kültür ortamını Tyrode çözeltisi (24 oyuklu bir plakada 0,5 mL / kuyucuk) ile değiştirin. Plaka kapağını klima kontrol kapağıyla değiştirin.NOT: Kalsiyum geçici ölçümlerinin yapılması gerekiyorsa, hücrelere bölüm 2’te açıklandığı gibi Fura-4 yükleyin. Klima kontrol cihazı sıcaklığın 37 °C olduğunu gösterdiğinde plakayı optik tabanlı ölçüm sisteminin içine yerleştirin.NOT: Büzülme, parlak alan koşulları kullanılarak ölçülür. Araç çubuğunun altındaki Hücre bulucuyu aç’a tıklayın ve yeni bir ekranın açılmasını bekleyin. Ekranın sağ üst köşesinde, plaka formatını ve kuyuyu seçin. Bir kuyu seçin, senkronize kasılma ve gevşemeyi gözlemlemek için kuyu içinde bir alan seçin, Başlat’a basın, Ölçüm ekle’ye tıklayın. Ayarlarda ölçümlerin süresini seçin (alan başına 10 sn). Eşzamansız kasılma ölçümlerini hemen atın ve yeni bir alan seçin.NOT: Gerçek zamanlı kasılma geçici akımları monitörde görülebilir. Senkronize kasılmalar için düzgün bir sürekli geçici olay gözlenirken, asenkron kasılmalar için küçük ekstra pikler gözlenir. Kuyu boyutuna bağlı olarak kuyu içindeki birden fazla alanı ölçün. Örneğin, bu çalışmayı takip etmek için, 24 oyuklu bir plakada kuyucuk başına 10 alanı ölçün. Yalnızca temel ölçümlerin gerekli olması ve herhangi bir bileşiği test etme planının olmaması durumunda, 3.13 adımından devam edin. Bir kuyu içindeki alanlar ölçüldükten sonra, stresör/bileşiği kuyuya eklemek için tam düğmesine basın ve optik tabanlı ölçüm cihazını açın (örneğin, 500 nM ISO, Tyrode içinde çözülmüş). İlgilenilen bileşiğin inkübasyon süresini seçin (bu protokolde ISO ile 2 dakika). Optik tabanlı ölçüm cihazının, temel ölçümlerin gerçekleştirildiği alanlarda ölçüm yapmasına izin vermek için otomatik ölçüme tıklayın, bu da kuyu içinde eşleştirilmiş ölçümlerle sonuçlanır. Kuyudaki tüm ölçümler yapıldıktan sonra tamamla’ya basın. Ekranın sağ üst köşesinden bir sonraki kuyuyu seçin. Gerekli tüm kuyular için ölçümlere devam edin. Gerekli tüm kuyular ölçüldükten sonra durdur’a tıklayın ve dosyayı kaydedin.NOT: Klima kontrolü, sabit CO2’yi korumak için kullanılır. Bu, bileşiklerin/stresörlerin hiPSC-CM’ler üzerindeki etkisinin yüksek hızlı bir şekilde ölçülmesine olanak tanır. 4. Kalsiyum geçici ölçümleri 37 °C Tyrode çözeltisi hazırlayın. Fura-2 alikotlarını Tiroz çözeltisi içinde çözün, böylece hücrelere 1 μM Fura-2’lik bir nihai konsantrasyon eklenecektir.NOT: Fura-2’yi kullanırken, ışığa maruz kalmayı en aza indirmek için akış başlığındaki ışıkların kapalı olduğundan emin olun. Ortamı aspire edin ve Fura-2 içeren Tyrode solüsyonu ile değiştirin. Bir inkübatörde veya optik tabanlı ölçüm sisteminde 37 ° C’de 15 dakika inkübe edin. Fura-2 içeren Tyrode solüsyonunu çıkarın ve ardından 2x’i taze Tyrode solüsyonu ile yıkayın. Son olarak, Fura-2’nin esterden arındırılmasına izin vermek için hücreleri Tyrode çözeltisinde 37 ° C’de 5 dakika daha inkübe edin. Plakayı optik tabanlı ölçüm sisteminin içine yerleştirin ve bölüm 3’te açıklandığı gibi ölçümleri başlatın.NOT: Adım 4.6’da. Ölçümler kasılma ölçümleri ile aynı anda başlatılarak, oransal bir kalsiyum geçişi kaydedilir: 100 μm’lik bir noktada 340 nm ve 385 nm’de uyarma; 510 ± 40 nm’de toplanan emisyon. Kontraktilite izlerine ek olarak, ekranda gerçek zamanlı oransal kalsiyum geçişleri görünecektir. 5. Veri analizi Verileri analiz etmek için masaüstünde CytoSolver’a tıklayın. İçe aktar’a tıklayın ve analiz edilecek dosya(lar)ı seçin. Program analizi gerçekleştirdikten sonra, ekranda görünen kabul edilen (mavi) ve reddedilen (kırmızı) geçişleri gözlemleyin (Şekil 1A).NOT: Burada, sinyal-gürültü oranı (SNR) ve uyum iyiliği (R 2) ile tanımlanan aşağıdaki varsayılan reddetme kriterleri kullanılmıştır: Kasılma geçici olayları için R 2 > 0.9 ve SNR > 4 ve kalsiyum geçişleri için R2 > 0.5 ve SNR > 3. Bu reddetme kriterleri, ölçümlerin kalitesine, hücrelerin kalitesine ve araştırmacı için birincil sonuca bağlı olarak kullanıcı tarafından ayarlanabilir. Örneğin, araştırmacının ilgisi esas olarak gevşeme kinetiği ise, kriterler zirveye kadar geçen süre değişkenleri için düşürülebilir. Çok güçlü kalsiyum geçişleri elde edilirse, daha gürültülü verileri hariç tutmak için SNR’nin artırılması gerekebilir. Dışa aktar’a tıklayın ve ortalama geçici veriler için işaretleyin. Bir elektronik tabloda sunulan analiz edilen verileri inceleyin. Bilgisayarı ve diğer tüm aletleri kapatın.

Representative Results

Bu protokolü takiben, kontraktilite, Ca2+ geçici akımları ve hiPSC-CM’lerde bir bileşiğe yanıt ölçümleri yapıldı. Bu optik tabanlı ölçüm sistemi kullanılarak, hiPSC-CM’ler gerekli plakalar üzerine kolayca yeniden kaplanabilir ve kontraktilite ölçümleri gerçekleştirilebilir. Kasılma, 100 μm x 100 μm’lik bir ilgi bölgesinde (ROI) saniyede 250 karede, bir referans kareye göre piksel korelasyonu hesaplanarak ölçülür. Referans çerçevesi, diyastol sonunda sistem tarafından otomatik olarak algılanır. Kasılma ölçümleri ile eş zamanlı olarak, bir oransal kalsiyum geçişi kaydedilir. Bu çalışmada, üç biyolojik kopya olarak üç farklı farklılaşma turu kullanılmıştır. Her bir farklılaşma partisi için, üç kuyu teknik kopya olarak ölçüldü. Bu çalışma 24 kuyulu plakalar kullanılarak gerçekleştirilmiş ve her kuyu içindeki 10 alan ölçülmüştür. Ölçümlerden sonra, verileri hemen analiz etmek için CytoSolver programı kullanıldı. Aşağıdaki parametreler rapor edildi: dinlenme atma frekansı, TP. Con ve TB. Kontrol hiPSC-CM’lerinCon 80’i (Şekil 2A-C). Bahsedilen her parametre için verilerin değişkenliğini görselleştirmek için, her bir kuyu içindeki ölçümler ve her bir farklılaşma turu için üç kuyunun ortalama değerleri üst parseller10 olarak sunulur. Her bir farklılaşma turu için ve üç tur arasındaki verilerin değişkenliğini daha iyi değerlendirmek için, her parametre için varyans katsayısı (Şekil 2D) hesaplanmıştır. Şekil 2D’de gösterildiği gibi, bir biyolojik kopyaya karşılık gelen teknik kopyaların değerleri, bu yöntemin sağlamlığını gösteren birbirine çok yakın bir aralıkta (yani düşük varyans katsayısı) yer almaktadır. Bu uygulama, ilaç etkilerini test etmek için çok uygundur. Burada, seçici olmayan bir β-adrenerjik reseptör agonisti olan 500 nM ISO’nun kontrol hiPSC-CM’lerinin kontraktilitesi üzerindeki etkisi test edildi. Bu bileşiğin kalp atış hızını arttırdığı ve pozitif bir lusitropik etki gösterdiği bilinmektedir. Şekil 3A’da gösterildiği gibi, ISO tüm kuyucuklarda atma frekansını önemli ölçüde artırdı. ISO ayrıca, TP’deki bir düşüşte belirgin olan kinetiği de artırdı. Con ve TB. Con80 (Şekil 3B,C). Genel olarak, ISO ile inkübasyon üzerine, tüm kuyucuklarda dayak frekansı önemli ölçüde artmış, kasılma ve gevşeme süresinde bir azalma olmuştur, bu da bu bileşiğe beklenen yanıtın bu platform tarafından kaydedildiğini göstermiştir. Kontraktilite ölçümlerine paralel olarak kalsiyum ölçümleri de yapıldı. Kasılma verileriyle aynı şekilde (Şekil 2), hiPSC-CM’lerin kalsiyum ölçüm verileri Şekil 4’te gösterilmektedir. TB.Ca80 , izole sıçan veya fare kardiyomiyositlerinden önemli ölçüde daha yavaştır, bu da kısmen türler ve kalp atış hızı farklılıkları11 ile ve ayrıca sarkoplazmik retikulum içindeki daha düşük kalsiyum dinamikleri ve birincil hücrelere kıyasla kalsiyum işleme proteinlerinin daha düşük ekspresyonu nedeniyle hiPSC-CM’lerde olgunlaşmamış kalsiyum kullanımıile açıklanmaktadır 12. Kasılma verilerine benzer şekilde, kalsiyum ölçümleri için varyans katsayısı hesaplanmıştır ve teknik ve biyolojik kopyalar içinde düşük değişkenlik göstermektedir (Şekil 4C). Şekil 1: Verileri analiz etmek için deneyden sonra CytoSolver geçici analiz aracının hemen kullanımı. (A) Bir kuyu içinde ölçülen bir alanın kabul edilen geçici akımlarına (tümü mavi renkte) bir örnek. Panel A1, kasılma geçişlerini göstermektedir. Panel A2, kalsiyum geçişlerini temsil eder. (B) Bir tur diferansiyasyonun üç kuyusundaki ölçümlerden elde edilen ortalama kasılma geçicisi. Her bir tek veya ortalama geçici olaydan, farklı zaman noktalarından zirveye kadar olan veriler (TP. Con) ve taban çizgisine kadar geçen süre (TB. Con) geçici kasılma çıkarılabilir. Daralmanın kesin başlangıcı her zaman kesin olarak belirlenemediğinden, zirveye ulaşma süresinin ölçümleri için başlangıç noktası olarak ‘lik zirveye kadar geçen süre alınır. Benzer şekilde, sinyalin taban çizgisine döndüğü tam anı değerlendirmek zordur. Bu nedenle, gevşeme süresini tanımlamak için ‘e kadar geçen süre kullanılır. İşte, TP. Con (zirveye kadar geçen süre – zirveye ulaşma süresi% 20) ve TB. Con80 (taban çizgisine kadar geçen süre – zirveye kadar geçen süre) kullanılır. (C) Bir tur farklılaşmanın üç kuyusundaki ölçümlerden elde edilen ortalama kalsiyum geçici verileri. Her bir tek veya ortalama kalsiyum geçişinden, kalsiyum geçişlerinin zirvesine (TP.Ca) ve başlangıç noktasına (TB.Ca) kadar geçen farklı zaman noktalarından veriler çıkarılabilir. Zirveye kadar geçen süre ölçümleri için başlangıç noktası ‘ye kadar olan süre ve taban çizgisine kadar geçen süre için bitiş noktası ‘e kadar olan zamandır. Bu çalışmada TP.Ca (zirveye kadar geçen süre – zirveye kadar geçen süre ) ve TB.Ca 80 (başlangıç süresi – zirveye kadar geçen süre) kullanılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: Üç farklı farklılaşma turunda gerçekleştirilen temel kasılma ölçümleri. Her farklılaşma turu için üç biyolojik kopya ve üç kuyu (yani, üç teknik kopya). Her bir farklılaşma turu için üç ana sembol, her bir kuyucuk içindeki ölçülen alanların (soluk renklerdeki arka plan sembolleri) ortalama değerini temsil eder. Veriler ortalama ± SEM olarak gösterilir. Dinlenme atma frekansı ile ilgili veriler Hertz cinsinden ve TP için temsil edilir. Con ve TB. Con80, veriler saniye cinsindendir. (A) Dinlenme vuruş frekansı. (B) Zirveye kadar geçen süre (TP. Con). (C) Başlangıç süresi% 80 (TB. Con80). (D) Her bir turda ve her üç farklılaşma turunda elde edilen veriler arasındaki değişimi değerlendirmek için, her bir kuyucuğun ortalama değerleri kullanılarak varyans katsayısı yüzdesi hesaplanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: Başlangıçta (-) ve üç diferansiyasyon turundan üç kuyucukta ISO (+) ile inkübasyondan sonra kontraktilite ölçümleri. (A) Dinlenme vuruş frekansı (-) ve 500 nM ISO (+) ile inkübasyondan sonra atma frekansı. (B) Zirveye kadar geçen süre (TP. Con) başlangıçta ve ISO ile inkübasyondan sonra ölçümler. (C) Başlangıç süresi% 80 (TB. Con80) başlangıçta ve ISO ile inkübasyondan sonra ölçümler. ISO’nun kontraktilite parametreleri üzerindeki etkisini değerlendirmek için, Bonferroni düzeltmeli iki yönlü bir Anova gerçekleştirildi. Veriler ortalama ± SEM olarak gösterilir. Dinlenme vuruş frekansı ile ilgili veriler Hertz cinsinden ve TP için temsil edilir. Con ve TB. Con80, veriler saniye cinsinden temsil edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: Üç tur farklılaşmadan üç kuyucuk üzerinde gerçekleştirilen temel kalsiyum geçici ölçümleri. (A) Kalsiyum geçişlerinin ‘inin (TB.Ca80) zirveye ulaşma süresi (TP.Ca) ve (B) başlangıç süresi. Veriler ortalama ± SEM olarak gösterilir. TP.Ca veTB.Ca 80 veri saniye cinsinden temsil edilir. (C) Her bir turda ve her üç farklılaşma turunda elde edilen veriler arasındaki değişimi değerlendirmek için, her bir kuyucuğun ortalama değeri kullanılarak varyans katsayısı yüzdesi hesaplanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Bu çalışmada, hiPSC-CM’ler üzerinde kontraktilite ve kalsiyum geçici ölçümleri yapmak ve stresörlerin/ilaçların bu hücreler üzerindeki etkisini incelemek için bir yöntem tanımlanmıştır. Kontraktilite ölçümleri, oransal kalsiyum ölçümleri ve ISO’ya yanıt, biyolojik kopyalar olarak üç farklı farklılaşma turunda gerçekleştirildi. Her biyolojik kopya için, teknik kopyalar olarak üç kuyuda ölçümler yapıldı. Ölçümlerin bu şekilde yapılmasının nedeni, numunenin ve platformun biyolojik değişkenliğinin ve teknik değişkenliğinin değerlendirilebilmesini sağlamaktı. Uygun sayıda biyolojik ve teknik kopyayı göz önünde bulundurmanın yanı sıra, hiPSC-CM kültür koşulu, sürekli ve sağlam sonuçlar elde etmek için önemli bir rol oynayabilir. Ölçümler sırasında hiPSC-CM’lerin yaşı, ortamın bileşimi, yeniden kaplama koşulları ve bileşik inkübasyon süresi gibi kriterlerle tutarlı olmak önemlidir. Bu çalışmada, bir kuyuda 10 sn boyunca 11 alanı iki kez ölçmek ortalama 568 ± 24 sn sürmüştür. Bu, 79 ± 11 s’lik bir ISO inkübasyon süresini içerir. Bu, kuyu başına kabaca 10 dakikaya iner ve bu da araştırmacıların ~ 4 saatte tam bir 24 kuyulu plakayı ölçmelerini sağlamalıdır. İklim kontrolü, sabit CO2’yi korumak için kullanılır. Bu, bileşiklerin/stresörlerin hiPSC-CM’ler üzerindeki etkisinin yüksek hızlı bir şekilde ölçülmesine olanak tanır.

iPSC-CM’lerin kasılma fonksiyonunu ölçmek için, optogenetik13 veya etiketsiz video tabanlı mikroskopi 5,6’ya dayanan birkaç mevcut sistem vardır. Optogenetik sistemler oldukça karmaşıktır ve elektrofiziksel ve/veya kontraktilite verilerini elde etmek için özel teknikler gerektirir. Diğer sistemler, çok fazla depolama alanı gerektiren ve video alımı sırasında doğrudan geri bildirimden yoksun olan videoların post-hoc analizine dayanır. Ek olarak, yeterli zamansal ve uzamsal çözünürlüğün elde edilmesi zordur ve bu da yetersiz örneklemeye neden olabilir. Benzer şekilde, floresan raportörler7 ile CRISPR/CAS-9 ile düzenlenmiş hiPSC-CM’ler, kardiyomiyosit davranışı üzerinde istenmeyen etkilere neden olabilir. Büzülme-gevşeme ölçümleri için floresan boyaların kullanılması da zarif bir yaklaşımdır, ancak aynı numune üzerinde daha uzun bir süre boyunca deney yapılmasını sınırlar14.

Bununla birlikte, bu optik tabanlı ölçüm platformu, herhangi bir floresan boya veya invaziv yöntem kullanmadan kasılma-gevşeme sürelerini ölçmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, piksel korelasyonu uzamsal bilgi sağlamadığından, bu yöntem kasılmanın gücünü ölçmek için kullanılamaz, bunun yerine yalnızca kasılma ve gevşeme hızındaki değişiklikleri güvenilir bir şekilde tespit edebilir. Tanıtılan ölçüm sistemi sıcaklık kontrollüdür ve saniyede >200 kare çözünürlükte gerçek zamanlı olarak kalsiyum ve kasılma verilerini alabilir. Ek olarak, her ölçümün konumu saklanır, bu da eşleştirilmiş ölçümleri mümkün kılar ve böylece deneylerin gücünü artırır. Ayrıca bu platform, araştırmacılara deneyden hemen sonra veri depolama ve analiz etme olanağı sağlar. Genel olarak, bu optik tabanlı ölçüm sistemi, hücresel patomekanizmaları incelemek için umut verici bir yöntem olduğunu, bileşiklerin hiPSC-CM’lerin işlevselliği üzerindeki etkisini değerlendirebildiğini ve ilaç taramasında klinik öncesi süreçte yardımcı olabileceğini göstermektedir.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu araştırma kısmen Eurostars hibesi Estars2 113937 CARDIOMYO (EM & DK) ve NWO-VICI hibe 91818602 (JV) tarafından finanse edilmiştir.

Materials

µ-Plate 24 Well Black ID 14 mm ibidi 82421
B-27 Supplement (50x) Thermo Fisher 17504044
CytoSolver transient analysis tool CytoCypher A fast automatic data analysis tool
DMEM/F-12 Thermo Fisher 11320033
Fura-2, AM Thermo Fisher F1221
Isoprenaline hydrochloride Merck 15627
KnockOut™ Serum Replacement Thermo Fisher 10828010
Matrigel Merck CLS3542C Basement membrane
MultiCell CytoCypher with Nikon 20x Super Fluor objective and 730 nm LED light source and Ionwizard software CytoCypher Optics-based measurement system
ROCK inhibitor Y-27632 Tocris 1254
RPMI 1640 Thermo Fisher 11875119
Tyrode Self-made solution with final concentration of the following components: NaCl 134 mM, KCl 5 mM, Hepes 12 mM, MgSO4 1.2 mM, NaH2PO4 H2O 1.2 mM, Glucose 11 mM, Sodium Pyrovate 5 mM, 1 mM CaCl2
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tsao, C. W., et al. Heart disease and stroke statistics-2022 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 145 (8), e153 (2022).
  2. Ghionzoli, N., et al. Current and emerging drug targets in heart failure treatment. Heart Failure Reviews. 27 (4), 1119-1136 (2022).
  3. Criscione, J., et al. Heart-on-a-chip platforms and biosensor integration for disease modeling and phenotypic drug screening. Biosensors and Bioelectronics. 220, 114840 (2023).
  4. vander Velden, J., et al. Animal models and animal-free innovations for cardiovascular research: current status and routes to be explored. Consensus document of the ESC Working Group on Myocardial Function and the ESC Working Group on Cellular Biology of the Heart. Cardiovascular Research. 118 (15), 3016-3051 (2022).
  5. Maddah, M., et al. A non-invasive platform for functional characterization of stem-cell-derived cardiomyocytes with applications in cardiotoxicity testing. Stem Cell Reports. 4 (4), 621-631 (2015).
  6. Sala, L., et al. MUSCLEMOTION: A versatile open software tool to quantify cardiomyocyte and cardiac muscle contraction in vitro and in vivo. Circulation Research. 122 (3), e5-e16 (2018).
  7. Sharma, A., et al. CRISPR/Cas9-mediated fluorescent tagging of endogenous proteins in human pluripotent stem cells. Current Protocols in Human Genetics. 96 (1), 1-20 (2018).
  8. Wang, L., et al. Hypertrophic cardiomyopathy-linked mutation in troponin T causes myofibrillar disarray and pro-arrhythmic action potential changes in human iPSC cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 114, 320-327 (2018).
  9. Luo, X., et al. IP3R-mediated compensatory mechanism for calcium handling in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes with cardiac ryanodine receptor deficiency. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 772 (2020).
  10. Lord, S. J., Velle, K. B., Mullins, R. D., Fritz-Laylin, L. K. SuperPlots: communicating reproducibility and variability in cell biology. The Journal of Cellular Biology. 219 (6), e202001064 (2020).
  11. Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacology and Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).
  12. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
  13. Klimas, A., Ortiz, G., Boggess, S. C., Miller, E. W., Entcheva, E. Multimodal on-axis platform for all-optical electrophysiology with near-infrared probes in human stem-cell-derived cardiomyocytes. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 154, 62-70 (2020).
  14. van Meer, B. J., et al. Simultaneous measurement of excitation-contraction coupling parameters identifies mechanisms underlying contractile responses of hiPSC-derived cardiomyocytes. Nature Communications. 10 (1), 4325 (2019).

Tags

Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived CardiomyocytesHiPSC-CMsContractilityCalcium HandlingReal-time MeasurementsPixel CorrelationCalcium-sensitive FluorophoreFura-22D PlatformPreclinical Drug Screening

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Dinani, R., Manders, E., Helmes, M., Wang, L., Knollmann, B. C., Kuster, D. W. D., van der Velden, J. Real-Time Measurements of Calcium and Contractility Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (195), e65326, doi:10.3791/65326 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image