מדידות בזמן אמת של פרמטרים של סידן והתכווצות בקרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים המושרים על ידי תאי גזע המושרים על ידי בני אדם

1. הכנת מדיה וריאגנטים של תרבית תאים הכן מדיה hiPSC-CM על ידי הוספת 1 מ”ל של תוספת B27 (50x) ל 49 מ”ל של RPMI1640. הכינו את מדיום הציפוי מחדש על ידי הוספה תחילה של 5 מ”ל של החלפת סרום נוקאאוט ל-45 מ”ל של מדיה hiPSC-CM. לאחר מכן, הוסף 22.5 μL של מעכב סלע Y-27632 (דילול 1:2,000; ריכוז במלאי: 10 mM) וערבב היטב. הכינו צלחות מצופות קרום מרתף כמתואר להלן:הפשירו בקבוקון של קרום מרתף למשך הלילה במקרר או על קופסת קרח. דללו את קרום המרתף עם כמות מתאימה של מדיום הנשר של דולבקו / F12 של האם (DMEM/F12). מכיוון שלכל אצווה של קרום מרתף יש ריכוז שונה, חשב את כמות DMEM/F12 הדרושה כדי להגיע לדילול של 1 מ”ג / 1 מ”ל. הפוך 0.5 או 1 מ”ל aliquots לאחסון ב -20 ° C.הערה: שלב 1.3.2 צריך להיעשות על קרח בתוך מכסה מנוע זרימה. הפשיר את aliquot 0.5 מ”ל של קרום מרתף לדלל אותו עם 6 מ”ל של DMEM/F12. מערבבים היטב. מצפים את הצלחת על ידי פיפטינג 250 μL של קרום מרתף מדולל / באר בצלחת 24 בארות. חישוב בהתבסס על שטח הפנים של כל באר עבור פורמטים שונים של לוחות, לדוגמה, 1 מ”ל / באר בלוח 6 בארות. לדגור את הצלחת במשך 1 שעה באינקובטור 37 מעלות צלזיוס. הכן Fura-2 AM aliquots על ידי המסת Fura-2 AM בדימתיל סולפוקסיד (DMSO), על פי מדריך היצרן להכין 1 mM aliquots. אחסן את aliquots ב -20 °C. 2. טיפוח hiPSC-CMs הפשירו בקבוקון של hiPSC-CMs באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. מעבירים את התוכן המופשר של הבקבוקון לצינור של 15 מ”ל. מוסיפים 10 מ”ל של מדיום הציפוי מחדש בצורה טיפתית לתאים. צנטריפוגה את התאים במשך 5 דקות ב 100 × גרם. מוציאים את הסופרנאטנט ומוסיפים 1 מ”ל של מדיום ציפוי מחדש. מזלפים בעדינות למעלה ולמטה כדי להשהות מחדש את הגלולה ולהסיר את כל גושי התא. השתמש בהמוציטומטר או מונה תאים אוטומטי כדי לספור את מספר התאים. הסר את קרום המרתף מהצלחת המודגרת והחלף אותו במדיום הציפוי מחדש. צלחות את התאים בצפיפות תאים מתאימה על צלחת 6/12/24/48/96 באר המצופה בקרום מרתף (למשל, 250,000 תאים / באר בצלחת של 24 בארות).הערה: עבור ניסויים ארעיים Ca2+ , צלחת את התאים על לוחות תחתית זכוכית. החלף את המדיום במדיום תרבית hiPSC-CM למחרת ולאחר מכן רענן את המדיום פעם ביומיים באמצעות 0.5 מ”ל/באר בצלחת של 24 בארות. בצע את מדידות ההתכווצות לאחר שה- hiPSC-CMs התאוששו מהפשרה וציפוי מחדש (3-5 ימים לאחר ציפוי מחדש בפרוטוקול זה).הערה: במקרה של ציפוי מחדש לא אחיד של תאים, ייתכן שקבוצת תאים אינה באה במגע עם שאר התאים המצופים מחדש ועשויה להציג דפוס פעימות לא סדיר או לא מסונכרן. כדי למנוע אסינכרוניה, מומלץ לקבל התפלגות שווה של תאים מונושכבה מסונכרנת היטב מחובר היטב של hiPSC-CMs בכל באר. 3. מדידות התכווצות הפעל את מערכת המדידה מבוססת האופטיקה, מקור האור של דיודה פולטת אור במיקרוסקופ (LED) והמחשב (ראה טבלת חומרים). פתח את התוכנית ופתח קובץ חדש. תחת קובץ בפינה הימנית העליונה של המסך, לחץ על חדש. לחץ על לאסוף, בחר ניסויים ולאחר מכן בחר “iPSC + סידן”. הפעל את התקן בקרת האקלים. הגדר את הטמפרטורה ל 37 ° C ואת רמת CO2 ל 5%. החלף את מדיום התרבית hiPSC-CM בתמיסת Tyrode (0.5 מ”ל/באר בצלחת של 24 בארות). החלף את מכסה הצלחת במכסה בקרת האקלים.הערה: אם יש צורך לבצע מדידות ארעיות של סידן, טען את התאים עם Fura-2 AM, כמתואר בסעיף 4. הניחו את הצלחת בתוך מערכת מדידה מבוססת אופטיקה ברגע שמכשיר בקרת האקלים מראה שהטמפרטורה היא 37 מעלות צלזיוס.הערה: התכווצות נמדדת בתנאי שדה בהיר. לחץ על פתח מאתר תאים מתחת לסרגל הכלים והמתן למסך חדש שיופיע. בפינה השמאלית העליונה של המסך, בחר את פורמט הצלחת ואת הבאר. בחר באר אחת, בחר אזור בתוך הבאר כדי לצפות בהתכווצות והרפייה מסונכרנות, לחץ על התחל, לחץ על הוסף מדידה. בחר את משך המדידות בהגדרות (10 שניות לכל אזור). בטל מיד מדידות כיווץ מסונכרנות ובחר אזור חדש.הערה: ניתן לראות את זמני ההתכווצות בזמן אמת על הצג. עבור התכווצויות מסונכרנות, ארעי רציף חלק הוא ציין, ואילו עבור התכווצויות מסונכרנות, פסגות קטנות נוספות נצפים. מדדו מספר אזורים בתוך הבאר בהתאם לגודל הבאר. לדוגמה, כדי לעקוב אחר מחקר זה, למדוד 10 אזורים לכל באר בצלחת 24 בארות. במקרה שיש צורך במדידות בסיסיות בלבד ואין תוכנית לבדוק תרכובת כלשהי, המשך משלב 3.13. לאחר מדידת האזורים בתוך באר, לחץ על השלם ופתח את מכשיר המדידה מבוסס האופטיקה כדי להוסיף את גורם העקה / התרכובת לבאר (למשל, 500 ננומטר ISO, מומס בטירוד). בחר את זמן הדגירה בהתאם לדריבית העניין (2 דקות עם ISO בפרוטוקול זה). לחצו על מדידה אוטומטית כדי לאפשר למכשיר המדידה מבוסס האופטיקה לבצע מדידות באותם אזורים שבהם בוצעו המדידות הבסיסיות, והתוצאה היא מדידות זוגיות בתוך הבאר. לחץ על השלם לאחר ביצוע כל המדידות בבאר. בחר את הבאר הבאה בפינה השמאלית העליונה של המסך. המשך מדידות עבור כל הבארות הנדרשות. לחץ על עצור לאחר שכל הבארות הדרושות נמדדו ושמור את הקובץ.הערה: בקרת האקלים משמשת לשמירה על CO2 יציב. זה מאפשר למדוד את ההשפעה של תרכובות / גורמי עקה על hiPSC-CMs במהירות גבוהה. 4. מדידות ארעיות של סידן הכינו תמיסת טירוד בטמפרטורה של 37°C. להמיס את aliquots Fura-2 AM בתמיסת Tyrode כך ריכוז סופי של 1 μM Fura-2 AM יתווסף לתאים.הערה: בעת השימוש ב- Fura-2 AM, ודא שהאורות במכסה המנוע כבויים כדי למזער את החשיפה לאור. שאפו את המדיום והחליפו אותו בתמיסת Tyrode המכילה Fura-2 AM. יש לדגור במשך 15 דקות בטמפרטורה של 37°C באינקובטור או במערכת מדידה מבוססת אופטיקה. הסר את תמיסת Tyrode המכילה Fura-2 AM, ולאחר מכן לשטוף 2x עם תמיסת Tyrode טרי. לבסוף, לדגור על התאים בתמיסת Tyrode במשך 5 דקות נוספות ב 37 ° C כדי לאפשר de-esterification של Fura-2 AM. הניחו את הלוחית בתוך מערכת המדידה מבוססת האופטיקה והתחילו את המדידות, כמתואר בסעיף 3.הערה: בשלב 4.6. על ידי התחלת המדידות בו זמנית עם מדידות ההתכווצות, נרשם מעבר סידן יחסי: עירור ב 340 ננומטר ו 385 ננומטר במקום 100 מיקרומטר; פליטה שנאספה ב 510 ± 40 ננומטר. בנוסף לעקבות ההתכווצות, יופיעו על המסך מעברי סידן יחסיים בזמן אמת. 5. ניתוח נתונים כדי לנתח את הנתונים, לחץ על CytoSolver בשולחן העבודה. לחץ על ייבוא ובחר את הקבצים לניתוח. לאחר שהתוכנית ביצעה את הניתוח, התבוננו בארעיים המקובלים (כחולים) והדחויים (אדומים) המופיעים על המסך (איור 1A).הערה: כאן, נעשה שימוש בקריטריוני הדחייה הבאים המוגדרים כברירת מחדל, המוגדרים על-ידי יחס אות לרעש (SNR) והתאמה טובה (R 2): R 2 > 0.9 ו-SNR > 4 עבור מעברי התכווצות, ו-R2 > 0.5 ו-SNR >-3 עבור מעברי סידן. קריטריוני דחייה אלה יכולים להיות מותאמים על ידי המשתמש בהתאם לאיכות המדידות, איכות התאים והתוצאה העיקרית עבור החוקר. לדוגמה, אם העניין של החוקר הוא בעיקר קינטיקה הרפיה, ניתן להוריד את הקריטריונים לזמן למשתני שיא. אם מתקבלים מעברי סידן חזקים מאוד, ייתכן שיהיה צורך להגדיל את ה- SNR כדי לא לכלול נתונים רועשים יותר. לחץ על ייצוא וסמן את הנתונים הארעיים הממוצעים. בדוק את הנתונים המנותחים המוצגים בגיליון אלקטרוני. כבה את המחשב ואת כל המכשירים האחרים.