JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Real-time metingen van calcium- en contractiliteitsparameters in door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten

Published: May 26, 2023
doi:
10.3791/65326
, , , , , ,
1Division of Physiology, Amsterdam UMC,Vrije University, 2Heart Failure & Arrhythmias,Amsterdam Cardiovascular Sciences, 3CytoCypher BV, 4Division of Clinical Pharmacology,Vanderbilt School of Medicine

Summary

Hier wordt een gevestigde methode beschreven om contractiliteits- en calciummetingen uit te voeren in door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten met behulp van een op optica gebaseerd platform. Dit platform stelt onderzoekers in staat om het effect van mutaties en de reactie op verschillende stimuli op een snelle en reproduceerbare manier te bestuderen.

Abstract

Door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CMs) vormen een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van mutatie-gemedieerde veranderingen in cardiomyocytenfunctie en het definiëren van de effecten van stressoren en medicamenteuze interventies. In deze studie wordt aangetoond dat dit op optica gebaseerde systeem een krachtig hulpmiddel is om de functionele parameters van hiPSC-CMs in 2D te beoordelen. Door gebruik te maken van dit platform is het mogelijk om gepaarde metingen uit te voeren in een goed bewaarde temperatuuromgeving op verschillende plaatlay-outs. Bovendien biedt dit systeem onderzoekers directe data-analyse.

Dit artikel beschrijft een methode voor het meten van de contractiliteit van ongewijzigde hiPSC-CMs. De contractiekinetiek wordt gemeten bij 37 °C op basis van pixelcorrelatieveranderingen ten opzichte van een referentiekader genomen bij ontspanning bij een bemonsteringsfrequentie van 250 Hz. Bovendien kunnen gelijktijdige metingen van intracellulaire calciumtransiënten worden verkregen door de cel te laden met een calciumgevoelige fluorofoor, zoals Fura-2. Met behulp van een hyperschakelaar kunnen ratiometrische calciummetingen worden uitgevoerd op een verlichtingspunt met een diameter van 50 μm, overeenkomend met het gebied van de contractiliteitsmetingen.

Introduction

Hartfalen is wereldwijd de belangrijkste doodsoorzaak. In 2019 veroorzaakten hart- en vaatziekten wereldwijd 18,6 miljoen sterfgevallen, wat een stijging van 17,1% weerspiegelt in het afgelopen decennium1. Ondanks de inspanningen van onderzoekers om medicijndoelen te identificeren om hartfalen te voorkomen en te genezen, zijn de resultaten voor patiënten nog steeds slecht2. Het verschil in de pathofysiologie van diermodellen ten opzichte van mensen zou een van de onderliggende factoren kunnen zijn in het beperkte succes voor de optimalisatie van hartfalentherapie3. Aanvullende mensachtige modellen zijn gerechtvaardigd om ziekten te modelleren en de toxiciteit en effectiviteit van nieuwe geneesmiddelverbindingen te testen.

Door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CMs) vormen een krachtig hulpmiddel om cellulaire pathomechanismen geïnduceerd door stressoren, ischemie, veranderd metabolisme of pathogene genvarianten te definiëren, en de effectiviteit en toxiciteit van geneesmiddelinterventies4. Om effecten op de functionele eigenschappen van hiPSC-CMs te definiëren, is een hogesnelheidssysteem dat de systolische en diastolische eigenschappen van cellulaire contracties op een onbevooroordeelde en reproduceerbare manier meet, gerechtvaardigd. Dit algemene doel van de huidige studie is om aan te tonen dat een op optica gebaseerd systeem een krachtig hulpmiddel is om real-time analyses uit te voeren van de functionele parameters van hiPSC-CMs.

Momenteel zijn er meerdere platforms om de contractiliteit van hiPSC-CMs te evalueren. De huidige systemen bieden echter een langzame uitlezing of het vereiste aantal cellen kan een uitdaging zijn. Labelvrije videomeetsystemen5,6 vertrouwen op post-hoc analyse van video’s, die veel opslagruimte vereist en directe feedback tijdens video-acquisitie mist. Bovendien is voldoende temporele en ruimtelijke resolutie moeilijk te bereiken en kan dit leiden tot onderbemonstering. Andere methoden om cardiomyocyteneigenschappen te bepalen, zoals geclusterde regelmatig interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9-edited hiPSC-CMs7 met fluorescerende reporters, kunnen de genstabiliteit van de cellen verstoren en gespecialiseerde laboratoriumexpertise vereisen.

Om de hierboven genoemde beperkingen te overwinnen, werd een uniek op optica gebaseerd meetsysteem ontwikkeld en geïntroduceerd in deze studie. Dit platform maakt contractiliteitsmetingen op ongewijzigde hiPSC-CMs mogelijk door ze eenvoudig opnieuw te plateren op elk gewenst plaatformaat, zonder enige beperking in plaatgrootte. Bovendien maken real-time metingen directe observatie en analyses van de functionele parameters van hiPSC-CMs mogelijk, en bieden daardoor een experimentele omgeving om protocollen onmiddellijk aan te passen en te optimaliseren. Bovendien wordt de locatie van elke meting opgeslagen, waardoor gepaarde metingen op hetzelfde monster mogelijk zijn, waardoor de kracht van de experimenten wordt verhoogd.

Om het op optica gebaseerde systeem te demonstreren, werden contractiliteitsmetingen uitgevoerd op een controle hiPSC-CM-lijn. Deze controle hiPSC-lijn werd gegenereerd uit de dermale fibroblast van een gezonde mannelijke donor met een normaal karyotype8. De tractiekinetiek werd gemeten bij 37 °C, op basis van pixelcorrelatieveranderingen ten opzichte van een referentiekader genomen tijdens ontspanning bij een bemonsteringsfrequentie van 250 Hz. Omdat het exacte begin van de krimp niet altijd eenduidig kan worden bepaald, werd het tijdstip waarop 20% van de piekhoogte werd bereikt (tijd tot piek 20%) als uitgangspunt genomen voor metingen van de tijd tot de piek. Hierdoor werd minder variabiliteit gevonden voor deze parameter binnen één steekproef. Evenzo, omdat het exacte moment waarop het signaal terugkeert naar de basislijn moeilijk te beoordelen is, werd de tijd die nodig was om 80% van de terugkeer naar de basislijn vanaf de piek te bereiken (tijd tot basislijn 80%) gebruikt om de ontspanningstijd te beschrijven.

Algemene contractiliteitsmetingen omvatten rustfrequenties, de tijd van 20% piek- tot piekcontractie (TP. Con), en de tijd vanaf piekcontractie tot 80% van de basislijn (TB. Con80) (figuur 1B). Om het effect van een stressor te testen, werden cellen geïncubeerd met isoprenaline (ISO). Bovendien werden, toevallig bij contractiliteitsmetingen, Ca 2+ transiënten gemeten door de cellen te laden met Fura-2-acetoxymethylester (Fura-2 AM) met een bemonsteringsfrequentie van 250 Hz. Ratiometrische Ca2+ metingen9 met behulp van een hyperschakelaar werden uitgevoerd op een verlichtingsgebied met een diameter van 50 μm, overeenkomend met het gebied van de contractiliteitsmetingen. Ca2+ meetgegevens worden weergegeven als tijd van 20% piek tot piek in de Ca2+ transiënt (TP.Ca) en de tijd van piek tot 80% van de basislijn (TB.Ca80) (Figuur 1C). Een snelle, automatische data-analysetool werd gebruikt om gemiddelde contractiele en calciumkinetische parameters voor elk gebied te produceren.

Protocol

1. Bereiding van celkweekmedia en reagentia Bereid hiPSC-CM media door 1 ml B27-supplement (50x) toe te voegen aan 49 ml RPMI1640. Bereid het replatingmedium voor door eerst 5 ml knock-outserumvervanging toe te voegen aan 45 ml hiPSC-CM-media. Voeg vervolgens 22,5 μL Y-27632 ROCK-remmer (1:2.000 verdunning; voorraadconcentratie: 10 mM) toe en meng grondig. Bereid keldermembraangecoate platen voor zoals hieronder beschreven:Ontdooi een injectieflacon met keldermembraan een nacht in de koelkast of op een ijskast. Verdun het keldermembraan met een geschikte hoeveelheid Dulbecco’s gemodificeerde Eagle’s medium/Ham’s F12 (DMEM/F12). Aangezien elke partij keldermembraan een andere concentratie heeft, berekent u de hoeveelheid DMEM/F12 die nodig is om een verdunning van 1 mg/1 ml te bereiken. Maak 0,5 of 1 ml aliquots voor opslag bij -20 °C.OPMERKING: Stap 1.3.2 moet worden uitgevoerd op ijs in een stroomkap. Ontdooi de 0,5 ml aliquot van het keldermembraan en verdun het met 6 ml DMEM/F12. Meng. Bedek de plaat door 250 μL verdund keldermembraan/put in een 24-putplaat te pipetteren. Bereken op basis van de oppervlakte van elke put voor verschillende plaatformaten, bijvoorbeeld 1 ml / put in een plaat met 6 putten. Incubeer de plaat gedurende 1 uur in een incubator van 37 °C. Bereid Fura-2 AM aliquots voor door Fura-2 AM op te lossen in dimethylsulfoxide (DMSO), volgens de handleiding van de fabrikant om 1 mM aliquots te bereiden. Bewaar de aliquots bij -20 °C. 2. Het kweken van hiPSC-CMs Ontdooi een injectieflacon met hiPSC-CMs in een waterbad van 37 °C. Breng de ontdooide inhoud van de injectieflacon over in een buis van 15 ml. Voeg 10 ml van het replatingmedium druppelsgewijs toe aan de cellen. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 100 × g. Verwijder het supernatant en voeg 1 ml replatingmedium toe. Pipetteer voorzichtig op en neer om de pellet te resuspenderen en eventuele celklonten te verwijderen. Gebruik een hemocytometer of een geautomatiseerde celteller om het aantal cellen te tellen. Verwijder het keldermembraan van de geïncubeerde plaat en vervang het door het herplatingsmedium. Plaats de cellen met een geschikte celdichtheid op een 6/12/24/48/96-putplaat bedekt met keldermembraan (bijv. 250.000 cellen / put in een 24-putplaat).OPMERKING: Voor Ca2+ transiënte experimenten, plaat de cellen op glasbodemplaten. Vervang het medium de volgende dag door hiPSC-CM kweekmedium en ververs het medium vervolgens om de dag met 0,5 ml/put in een plaat met 24 putten. Voer de contractiliteitsmetingen uit zodra de hiPSC-CMs zijn hersteld van het ontdooien en opnieuw plateren (3-5 dagen na het opnieuw plateren in dit protocol).OPMERKING: In het geval van ongelijke celreplating is het mogelijk dat een groep cellen niet in contact staat met de rest van de opnieuw geplateerde cellen en een onregelmatig of niet-gesynchroniseerd kloppatroon vertoont. Om asynchronie te voorkomen, wordt geadviseerd om een gelijkmatige verdeling van cellen en een gesynchroniseerde goed verbonden monolaag van hiPSC-CMs in elke put te hebben. 3. Contractiliteitsmetingen Schakel het op optica gebaseerde meetsysteem, de LED-lichtbron (Microscope Light Emitting Diode) en de computer in (zie Materiaaltabel). Open het programma en open een nieuw bestand. Klik onder Bestand in de linkerbovenhoek van het scherm op Nieuw. Klik op Verzamelen, kies Experimenten en selecteer vervolgens “iPSC + Calcium”. Schakel de klimaatregeling in. Stel de temperatuur in op 37 °C en het CO2-niveau op 5%. Vervang het hiPSC-CM kweekmedium door Tyrode oplossing (0,5 ml/put in een plaat met 24 putten). Vervang het plaatdeksel door het deksel van de klimaatregeling.OPMERKING: Als calciumtransiënte metingen moeten worden uitgevoerd, laadt u de cellen met Fura-2 AM, zoals beschreven in rubriek 4. Plaats de plaat in het op optiek gebaseerde meetsysteem zodra de klimaatregeling aangeeft dat de temperatuur 37 °C is.OPMERKING: Contractie wordt gemeten met behulp van brightfield-omstandigheden. Klik op Open cell finder onder de werkbalk en wacht tot er een nieuw scherm verschijnt. Selecteer in de rechterbovenhoek van het scherm het plaatformaat en de put. Selecteer een put, kies een gebied in de put om gesynchroniseerde contractie en ontspanning te observeren, druk op de start, klik op Meting toevoegen. Selecteer de duur van de metingen in de instellingen (10 s per gebied). Verwijder asynchrone contractiemetingen onmiddellijk en selecteer een nieuw gebied.OPMERKING: De real-time contractiliteitstransiënten zijn te zien op de monitor. Voor gesynchroniseerde contracties wordt een vloeiende continue transiënt waargenomen, terwijl voor asynchrone contracties kleine extra pieken worden waargenomen. Meet meerdere gebieden in de put, afhankelijk van de grootte van de put. Om deze studie te volgen, meet u bijvoorbeeld 10 gebieden per put in een plaat met 24 putten. Als alleen nulmetingen nodig zijn en er geen plan is om een verbinding te testen, ga dan verder met stap 3.13. Nadat de gebieden in een put zijn gemeten, drukt u op complete en opent u het op optica gebaseerde meetinstrument om de stressor / verbinding aan de put toe te voegen (bijv. 500 nM ISO, opgelost in Tyrode). Kies de incubatietijd afhankelijk van de samengestelde rente (2 min met ISO in dit protocol). Klik op automatische meting om het op optiek gebaseerde meetinstrument metingen te laten uitvoeren in dezelfde gebieden waar de nulmetingen werden uitgevoerd, wat resulteert in gepaarde metingen in de put. Druk op voltooien zodra alle metingen in de put zijn uitgevoerd. Kies het volgende putje in de rechterbovenhoek van het scherm. Ga door met meten voor alle benodigde putten. Klik op stoppen zodra alle vereiste putten zijn gemeten en sla het bestand op.OPMERKING: De klimaatregeling wordt gebruikt om CO2 stabiel te houden. Dit maakt het mogelijk om het effect van verbindingen/stressoren op hiPSC-CMs op een snelle manier te meten. 4. Calcium transiënte metingen Bereid 37 °C Tyrode oplossing. Los de Fura-2 AM aliquots op in Tyrode oplossing zodat een eindconcentratie van 1 μM Fura-2 AM aan de cellen wordt toegevoegd.OPMERKING: Zorg er tijdens het gebruik van Fura-2 AM voor dat de lampjes in de stroomkap uit zijn om blootstelling aan licht te minimaliseren. Zuig het medium aan en vervang het door een Tyrode-oplossing die Fura-2 AM bevat. Incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C in een incubator of in het op optica gebaseerde meetsysteem. Verwijder de Tyrode-oplossing met Fura-2 AM en was vervolgens 2x met verse Tyrode-oplossing. Incubeer ten slotte de cellen in Tyrode-oplossing gedurende nog eens 5 minuten bij 37 °C om de verestering van Fura-2 AM mogelijk te maken. Plaats de plaat in het op optiek gebaseerde meetsysteem en start de metingen, zoals beschreven in rubriek 3.OPMERKING: In stap 4.6. Door de metingen gelijktijdig met de contractiemetingen te starten, wordt een ratiometrische calciumtransiënt geregistreerd: excitatie bij 340 nm en 385 nm op een plek van 100 μm; emissie verzameld bij 510 ± 40 nm. Naast de contractiliteitssporen verschijnen er real-time ratiometrische calciumtransiënten op het scherm. 5. Data-analyse Om de gegevens te analyseren, klikt u op CytoSolver op het bureaublad. Klik op importeren en selecteer de bestanden die u wilt analyseren. Nadat het programma de analyse heeft uitgevoerd, observeert u de geaccepteerde (blauwe) en afgewezen (rode) transiënten die op het scherm verschijnen (figuur 1A).OPMERKING: Hier werden de volgende standaard afstotingscriteria, gedefinieerd door signaal-ruisverhouding (SNR) en goedheid van pasvorm (R 2), gebruikt: R 2 > 0,9 en SNR > 4 voor contractietransiënten, en R2 > 0,5 en SNR > 3 voor calciumtransiënten. Deze afstotingscriteria kunnen door de gebruiker worden aangepast, afhankelijk van de kwaliteit van de metingen, de kwaliteit van de cellen en de primaire uitkomst voor de onderzoeker. Als de interesse van de onderzoeker bijvoorbeeld vooral ontspanningskinetiek is, kunnen de criteria worden verlaagd voor de tijd tot piekvariabelen. Als zeer sterke calciumtransiënten worden verkregen, moet de SNR mogelijk worden verhoogd om gegevens uit te sluiten die luidruchtiger zijn. Klik op exporteren en vink aan voor de gemiddelde transiënte gegevens. Inspecteer de geanalyseerde gegevens die in een spreadsheet worden gepresenteerd. Schakel de computer en alle andere instrumenten uit.

Representative Results

Volgens dit protocol werden metingen van contractiliteit, Ca2+ transiënten en respons op een verbinding in hiPSC-CMs uitgevoerd. Door gebruik te maken van dit op optica gebaseerde meetsysteem konden hiPSC-CMs eenvoudig opnieuw worden geplateerd op de vereiste platen en konden de contractiliteitsmetingen worden uitgevoerd. Contractiliteit wordt gemeten in een interessegebied (ROI) van 100 μm x 100 μm bij 250 frames per seconde door de pixelcorrelatie ten opzichte van een referentiekader te berekenen. Het referentiekader wordt automatisch gedetecteerd door het systeem bij einddiastole. Gelijktijdig met de contractiemetingen wordt een ratiometrische calciumtransiënt geregistreerd. In deze studie werden drie verschillende differentiatierondes gebruikt als drie biologische replicaties. Voor elke batch differentiatie werden drie putten gemeten als technische replicaties. Deze studie werd uitgevoerd met behulp van 24-putplaten en 10 gebieden binnen elke put werden gemeten. Na de metingen werd het CytoSolver-programma gebruikt om de gegevens onmiddellijk te analyseren. De volgende parameters werden gerapporteerd: de rustfrequentie van het kloppen, TP. Con, en TB. Con80 van de controle hiPSC-CMs (Figuur 2A-C). Om de variabiliteit van gegevens voor elke genoemde parameter te visualiseren, worden de metingen binnen elke put en de gemiddelde waarden van drie putten voor elke differentiatieronde gepresenteerd als superplots10. Om de variabiliteit van gegevens voor elke differentiatieronde en tussen de drie rondes beter te evalueren, werd de variantiecoëfficiënt (figuur 2D) voor elke parameter berekend. Zoals weergegeven in figuur 2D, vallen de waarden van technische replicaties die overeenkomen met één biologische replicaat binnen een zeer dicht bereik van elkaar (d.w.z. een lage variantiecoëfficiënt), wat de robuustheid van deze methode illustreert. Deze applicatie is zeer geschikt om de effecten van geneesmiddelen te testen. Hier werd het effect van 500 nM ISO, een niet-selectieve β-adrenerge receptoragonist, op de contractiliteit van controle hiPSC-CMs getest. Van deze verbinding is bekend dat het de hartslag verhoogt en een positief lusitroop effect uitoefent. Zoals afgebeeld in figuur 3A, verhoogde ISO de slagfrequentie in alle putten aanzienlijk. ISO verhoogde ook de kinetiek, wat duidelijk blijkt uit een afname van TP. Con en TB. Con80 (figuur 3B,C). Over het algemeen was bij incubatie met ISO de klopfrequentie in alle putten aanzienlijk verhoogd, samen met een vermindering van de contractie- en ontspanningstijd, wat aangaf dat de verwachte respons op deze verbinding door dit platform werd geregistreerd. Parallel aan contractiliteitsmetingen werden ook calciummetingen uitgevoerd. Op dezelfde manier als contractiliteitsgegevens (figuur 2) worden de calciummeetgegevens van hiPSC-CMs weergegeven in figuur 4. De TB.Ca80 is aanzienlijk langzamer dan bij geïsoleerde cardiomyocyten bij ratten of muizen, wat deels wordt verklaard door soort- en hartslagverschillen11, evenals door de onrijpe calciumbehandeling in hiPSC-CMs als gevolg van lagere calciumdynamiek binnen het sarcoplasmatisch reticulum en lagere expressie van calciumverwerkende eiwitten in vergelijking met primaire cellen12. Net als bij contractiliteitsgegevens werd de variantiecoëfficiënt voor calciummetingen berekend en toont deze een lage variabiliteit binnen de technische en biologische replicaties (figuur 4C). Figuur 1: Onmiddellijk gebruik van de CytoSolver transiënte analysetool na het experiment om de gegevens te analyseren. (A) Een voorbeeld van de geaccepteerde transiënten (allemaal in blauw) van één gebied gemeten in een put. Paneel A1 toont de contractiele transiënten. Paneel A2 vertegenwoordigt de calciumtransiënten. (B) Gemiddelde contractiliteit van voorbijgaande aard verkregen uit metingen in drie putten van één differentiatieronde. Van elke afzonderlijke of gemiddelde voorbijgaande, gegevens van verschillende tijdstippen tot piek (TP. Con) en tijd tot baseline (TB. Con) van de contractiliteit van voorbijgaande aard kon worden geëxtraheerd. Omdat het exacte begin van de krimp niet altijd eenduidig kan worden bepaald, wordt de tijd tot piek 20% als uitgangspunt genomen voor metingen van de tijd tot de piek. Evenzo is het exacte moment waarop het signaal terugkeert naar de basislijn moeilijk te beoordelen. Daarom wordt de tijd tot baseline 80% gebruikt om de ontspanningstijd te beschrijven. Hier, TP. Con (time to peak – time to peak 20%) en TB. Con80 (time to baseline 80% – time to peak) worden gebruikt. (C) Gemiddelde calciumtransiënte gegevens verkregen uit metingen in drie putten van één differentiatieronde. Uit elke afzonderlijke of gemiddelde calciumtransiënt konden gegevens van verschillende tijdspunten tot piek (TP.Ca) en tijd tot baseline (TB.Ca) van calciumtransiënten worden geëxtraheerd. Voor de tijd tot piekmetingen is het beginpunt de tijd om 20% te pieken en voor de tijd tot de basislijn is het eindpunt de tijd tot de basislijn 80%. In deze studie worden TP.Ca(time to peak – time to peak 20%) en TB.Ca 80 (time to baseline 80% – time to peak) gebruikt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Baseline contractiliteitsmetingen uitgevoerd op drie verschillende differentiatierondes. Drie biologische replicaties en drie putten voor elke differentiatieronde (d.w.z. drie technische replicaties). Drie hoofdsymbolen voor elke differentiatieronde vertegenwoordigen de gemiddelde waarde van de gemeten gebieden (de achtergrondsymbolen in vervaagde kleuren) binnen elke put. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. Gegevens met betrekking tot de rustfrequentie worden weergegeven in Hertz en voor TP. Con en TB. Con80, de gegevens zijn in seconden. (A) Rustfrequentie kloppen. (B) Tijd tot piek (TP. Tegen). (C) Tijd tot baseline 80% (TB. Con80). (D) Om de variatie tussen de in elke ronde verkregen gegevens en tussen alle drie de differentiatierondes te evalueren, werd de variantiecoëfficiënt berekend aan de hand van de gemiddelde waarden van elk put. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Contractiliteitsmetingen bij baseline (-) en na incubatie met ISO (+) op drie putten uit drie differentiatierondes. (A) De rustfrequentie (-) en de slagfrequentie na incubatie met 500 nM ISO (+). (B) Tijd tot piek (TP. Con) metingen bij baseline en na incubatie met ISO. (C) Tijd tot baseline 80% (TB. Con80) metingen bij baseline en na incubatie met ISO. Om het effect van ISO op de contractiliteitsparameters te evalueren, werd een tweerichtings-Anova met Bonferroni-correctie uitgevoerd. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. Gegevens over de rustfrequentie worden weergegeven in Hertz en voor TP. Con en TB. Con80, de gegevens worden weergegeven in seconden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: Baseline calcium transiënte metingen uitgevoerd op drie putten uit drie differentiatierondes . (A) Tijd tot piek (TP.Ca) en (B) tijd tot baseline 80% (TB.Ca80) van calciumtransiënten. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. TP.Ca en TB.Ca80 gegevens worden weergegeven in seconden. (C) Om de variatie tussen de in elke ronde verkregen gegevens en tussen alle drie de differentiatierondes te evalueren, werd de variantiecoëfficiënt berekend aan de hand van de gemiddelde waarde van elk put. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

In deze studie wordt een methode beschreven om contractiliteits- en calciumtransiënte metingen uit te voeren op hiPSC-CMs en het effect van stressoren/geneesmiddelen op deze cellen te bestuderen. Contractiliteitsmetingen, ratiometrische calciummetingen en de respons op ISO werden uitgevoerd op drie verschillende differentiatierondes als biologische replicaties. Voor elke biologische replicatie werden metingen uitgevoerd op drie putten terwijl de technische replicaties plaatsvonden. De reden om de metingen op deze manier uit te voeren was om ervoor te zorgen dat de biologische variabiliteit en de technische variabiliteit van het monster en het platform konden worden geëvalueerd. Afgezien van het overwegen van het juiste aantal biologische en technische replicaties, kan de hiPSC-CM-kweekconditie een belangrijke rol spelen bij het bereiken van constante en robuuste resultaten. Het is belangrijk om consistent te zijn met criteria, zoals de leeftijd van hiPSC-CMs, samenstelling van het medium, replatingcondities en samengestelde incubatietijd tijdens metingen. In deze studie duurde het gemiddeld 568 ± 24 s om 11 gebieden tweemaal gedurende 10 s in één put te meten. Dit omvat een ISO-incubatietijd van 79 ± 11 s. Dit komt neer op ongeveer 10 minuten per put, wat onderzoekers in staat zou moeten stellen om een volledige 24-putplaat in ~ 4 uur te meten. De klimaatregeling wordt gebruikt om CO2 stabiel te houden. Dit maakt het mogelijk om het effect van verbindingen/stressoren op hiPSC-CMs op een snelle manier te meten.

Om de contractiele functie van iPSC-CMs te meten, zijn er verschillende bestaande systemen die vertrouwen op optogenetica13 of labelvrije videogebaseerde microscopie 5,6. Optogenetische systemen zijn vrij complex en vereisen speciale technieken om elektrofysische en/of contractiliteitsgegevens te verkrijgen. Andere systemen vertrouwen op post-hoc analyse van video’s, die veel opslagruimte vereist en directe feedback tijdens video-acquisitie mist. Bovendien is voldoende temporele en ruimtelijke resolutie moeilijk te bereiken, wat kan leiden tot onderbemonstering. Evenzo kunnen CRISPR / CAS-9-bewerkte hiPSC-CMs met fluorescerende reporters7 ongewenste effecten op cardiomyocytengedrag introduceren. Het gebruik van fluorescerende kleurstoffen voor contractie-relaxatiemetingen is ook een elegante benadering, maar beperkt het uitvoeren van experimenten op hetzelfde monster over een langere periode14.

Dit op optica gebaseerde meetplatform kan echter worden gebruikt voor het meten van contractie-ontspanningstijden zonder gebruik te maken van fluorescerende kleurstof of invasieve methoden. Omdat pixelcorrelatie echter geen ruimtelijke informatie oplevert, kan deze methode niet worden gebruikt om de sterkte van de contractie te meten, maar kan deze alleen betrouwbaar veranderingen in de snelheid van contractie en ontspanning detecteren. Het geïntroduceerde meetsysteem is temperatuurgestuurd en kan calcium- en contractiliteitsgegevens in realtime verkrijgen met een resolutie van > 200 frames per seconde. Bovendien wordt de locatie van elke meting opgeslagen, waardoor gepaarde metingen mogelijk zijn, waardoor de kracht van de experimenten wordt verhoogd. Bovendien biedt dit platform onderzoekers de mogelijkheid om gegevens op te slaan en deze direct na het experiment te analyseren. Over het algemeen blijkt dit op optica gebaseerde meetsysteem een veelbelovende methode te zijn om cellulaire pathomechanismen te bestuderen, het effect van verbindingen op de functionaliteit van hiPSC-CMs te evalueren en kan het nuttig zijn bij het preklinische proces bij het screenen van geneesmiddelen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit onderzoek is mede gefinancierd door Eurostars-subsidie Estars2 113937 CARDIOMYO (EM & DK) en NWO-VICI-subsidie 91818602 (JV).

Materials

µ-Plate 24 Well Black ID 14 mm ibidi 82421
B-27 Supplement (50x) Thermo Fisher 17504044
CytoSolver transient analysis tool CytoCypher A fast automatic data analysis tool
DMEM/F-12 Thermo Fisher 11320033
Fura-2, AM Thermo Fisher F1221
Isoprenaline hydrochloride Merck 15627
KnockOut™ Serum Replacement Thermo Fisher 10828010
Matrigel Merck CLS3542C Basement membrane
MultiCell CytoCypher with Nikon 20x Super Fluor objective and 730 nm LED light source and Ionwizard software CytoCypher Optics-based measurement system
ROCK inhibitor Y-27632 Tocris 1254
RPMI 1640 Thermo Fisher 11875119
Tyrode Self-made solution with final concentration of the following components: NaCl 134 mM, KCl 5 mM, Hepes 12 mM, MgSO4 1.2 mM, NaH2PO4 H2O 1.2 mM, Glucose 11 mM, Sodium Pyrovate 5 mM, 1 mM CaCl2
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tsao, C. W., et al. Heart disease and stroke statistics-2022 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 145 (8), e153 (2022).
  2. Ghionzoli, N., et al. Current and emerging drug targets in heart failure treatment. Heart Failure Reviews. 27 (4), 1119-1136 (2022).
  3. Criscione, J., et al. Heart-on-a-chip platforms and biosensor integration for disease modeling and phenotypic drug screening. Biosensors and Bioelectronics. 220, 114840 (2023).
  4. vander Velden, J., et al. Animal models and animal-free innovations for cardiovascular research: current status and routes to be explored. Consensus document of the ESC Working Group on Myocardial Function and the ESC Working Group on Cellular Biology of the Heart. Cardiovascular Research. 118 (15), 3016-3051 (2022).
  5. Maddah, M., et al. A non-invasive platform for functional characterization of stem-cell-derived cardiomyocytes with applications in cardiotoxicity testing. Stem Cell Reports. 4 (4), 621-631 (2015).
  6. Sala, L., et al. MUSCLEMOTION: A versatile open software tool to quantify cardiomyocyte and cardiac muscle contraction in vitro and in vivo. Circulation Research. 122 (3), e5-e16 (2018).
  7. Sharma, A., et al. CRISPR/Cas9-mediated fluorescent tagging of endogenous proteins in human pluripotent stem cells. Current Protocols in Human Genetics. 96 (1), 1-20 (2018).
  8. Wang, L., et al. Hypertrophic cardiomyopathy-linked mutation in troponin T causes myofibrillar disarray and pro-arrhythmic action potential changes in human iPSC cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 114, 320-327 (2018).
  9. Luo, X., et al. IP3R-mediated compensatory mechanism for calcium handling in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes with cardiac ryanodine receptor deficiency. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 772 (2020).
  10. Lord, S. J., Velle, K. B., Mullins, R. D., Fritz-Laylin, L. K. SuperPlots: communicating reproducibility and variability in cell biology. The Journal of Cellular Biology. 219 (6), e202001064 (2020).
  11. Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacology and Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).
  12. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
  13. Klimas, A., Ortiz, G., Boggess, S. C., Miller, E. W., Entcheva, E. Multimodal on-axis platform for all-optical electrophysiology with near-infrared probes in human stem-cell-derived cardiomyocytes. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 154, 62-70 (2020).
  14. van Meer, B. J., et al. Simultaneous measurement of excitation-contraction coupling parameters identifies mechanisms underlying contractile responses of hiPSC-derived cardiomyocytes. Nature Communications. 10 (1), 4325 (2019).

Tags

Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived CardiomyocytesHiPSC-CMsContractilityCalcium HandlingReal-time MeasurementsPixel CorrelationCalcium-sensitive FluorophoreFura-22D PlatformPreclinical Drug Screening

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Dinani, R., Manders, E., Helmes, M., Wang, L., Knollmann, B. C., Kuster, D. W. D., van der Velden, J. Real-Time Measurements of Calcium and Contractility Parameters in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (195), e65326, doi:10.3791/65326 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image