قياسات في الوقت الحقيقي لمعلمات الكالسيوم والانقباض في الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة بالإنسان
Summary
هنا ، يتم وصف طريقة راسخة لإجراء قياسات الانقباض والكالسيوم في خلايا عضلة القلب المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان باستخدام منصة قائمة على البصريات. تمكن هذه المنصة الباحثين من دراسة تأثير الطفرات والاستجابة لمختلف المحفزات بطريقة سريعة وقابلة للتكرار.
Abstract
تمثل الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية (hiPSC-CMs) أداة قوية لدراسة التغيرات بوساطة الطفرة في وظيفة عضلة القلب وتحديد آثار الضغوطات والتدخلات الدوائية. في هذه الدراسة ، ثبت أن هذا النظام القائم على البصريات هو أداة قوية لتقييم المعلمات الوظيفية ل hiPSC-CMs في 2D. باستخدام هذه المنصة ، من الممكن إجراء قياسات مزدوجة في بيئة درجة حرارة محفوظة جيدا على تخطيطات لوحات مختلفة. علاوة على ذلك ، يوفر هذا النظام للباحثين تحليلا فوريا للبيانات.
تصف هذه الورقة طريقة لقياس انقباض hiPSC-CMs غير المعدلة. يتم قياس حركية الانكماش عند 37 درجة مئوية بناء على تغيرات ارتباط البكسل بالنسبة إلى إطار مرجعي تم التقاطه عند الاسترخاء عند تردد أخذ العينات 250 هرتز. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن الحصول على قياسات متزامنة لعابرات الكالسيوم داخل الخلايا عن طريق تحميل الخلية بفلوروفور حساس للكالسيوم ، مثل Fura-2. باستخدام مفتاح فائق ، يمكن إجراء قياسات الكالسيوم النسبية على بقعة إضاءة قطرها 50 ميكرومتر ، بما يتوافق مع منطقة قياسات الانقباض.
Introduction
قصور القلب هو السبب الرئيسي للوفاة في جميع أنحاء العالم. في عام 2019 ، تسببت أمراض القلب والأوعية الدموية في 18.6 مليون حالة وفاة على مستوى العالم ، مما يعكس زيادة بنسبة 17.1٪ خلال العقدالماضي 1. على الرغم من الجهود التي يبذلها الباحثون لتحديد أهداف الأدوية للوقاية من قصور القلب وعلاجه ، لا تزال نتائج المرضى ضعيفة2. يمكن أن يكون الاختلاف في الفيزيولوجيا المرضية للنماذج الحيوانية فيما يتعلق بالبشر أحد العوامل الأساسية في النجاح المحدود لتحسين علاج قصور القلب3. هناك ما يبرر نماذج إضافية شبيهة بالإنسان لنمذجة المرض واختبار سمية وفعالية مركبات الأدوية الجديدة.
تمثل الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية (hiPSC-CMs) أداة قوية لتحديد الآليات المرضية الخلوية التي تسببها الضغوطات أو نقص التروية أو التمثيل الغذائي المتغير أو المتغيرات الجينية المسببة للأمراض وفعالية وسمية التدخلات الدوائية4. لتحديد التأثيرات على الخصائص الوظيفية ل hiPSC-CMs ، هناك ما يبرر وجود نظام عالي السرعة يقيس الخصائص الانقباضية والانبساطية للانقباضات الخلوية بطريقة غير متحيزة وقابلة للتكرار. هذا الهدف العام للدراسة الحالية هو إثبات أن النظام القائم على البصريات هو أداة قوية لإجراء تحليلات في الوقت الفعلي للمعلمات الوظيفية ل hiPSC-CMs.
حاليا ، هناك منصات متعددة لتقييم انقباض hiPSC-CMs. ومع ذلك ، فإن الأنظمة الحالية إما تقدم قراءة بطيئة ، أو قد يمثل العدد المطلوب من الخلايا تحديا. تعتمد أنظمة قياس الفيديو الخالية من الملصقات 5,6 على التحليل اللاحق لمقاطع الفيديو ، الأمر الذي يتطلب مساحة تخزين كبيرة ويفتقر إلى التعليقات المباشرة أثناء الحصول على الفيديو. وبالإضافة إلى ذلك، يصعب تحقيق استبانة زمنية ومكانية كافية، وقد يؤدي ذلك إلى نقص العينات. قد تتداخل الطرق الأخرى لتحديد خصائص الخلايا العضلية القلبية ، مثل التكرارات العنقودية القصيرة المتباعدة بانتظام (CRISPR) / HiPSC-CMs7 المحررة بواسطة Cas9 مع مراسلي الفلورسنت مع استقرار الجينات للخلايا وتتطلب خبرة مخبرية متخصصة.
للتغلب على القيود المذكورة أعلاه ، تم تطوير نظام قياس فريد قائم على البصريات وتقديمه في هذه الدراسة. تتيح هذه المنصة قياسات الانقباض على hiPSC-CMs غير المعدلة ببساطة عن طريق إعادة طلائها على أي تنسيق لوحة مطلوب ، دون أي قيود في حجم اللوحة. علاوة على ذلك ، تسمح القياسات في الوقت الفعلي بالمراقبة والتحليلات المباشرة للمعلمات الوظيفية ل hiPSC-CMs ، وبالتالي توفر إعدادا تجريبيا لضبط البروتوكولات وتحسينها على الفور. علاوة على ذلك ، يتم تخزين موقع كل قياس ، مما يتيح إجراء قياسات مزدوجة على نفس العينة ، وبالتالي زيادة قوة التجارب.
لإثبات النظام القائم على البصريات ، تم إجراء قياسات الانقباض على خط التحكم hiPSC-CM. تم إنشاء خط التحكم hiPSC هذا من الخلايا الليفية الجلدية لمتبرع ذكر سليم مع النمط النوويالطبيعي 8. تم قياس حركية الانكماش عند 37 درجة مئوية ، بناء على تغيرات ارتباط البكسل بالنسبة إلى إطار مرجعي تم التقاطه أثناء الاسترخاء عند تردد أخذ العينات 250 هرتز. نظرا لأنه لا يمكن دائما تحديد البداية الدقيقة للانكماش بشكل لا لبس فيه ، فقد تم أخذ النقطة الزمنية التي تم فيها الوصول إلى 20٪ من ارتفاع الذروة (الوقت إلى الذروة 20٪) كنقطة انطلاق لقياسات الوقت حتى الذروة. من خلال القيام بذلك ، تم العثور على تباين أقل لهذه المعلمة داخل عينة واحدة. وبالمثل، نظرا لصعوبة تقييم اللحظة الدقيقة التي تعود فيها الإشارة إلى خط الأساس، فقد تم استخدام الوقت المستغرق للوصول إلى 80٪ من العودة إلى خط الأساس من الذروة (الوقت إلى خط الأساس 80٪) لوصف وقت الاسترخاء.
تضمنت قياسات الانقباض الإجمالية ترددات الضرب أثناء الراحة ، والوقت من 20٪ من الذروة إلى الذروة (TP. Con) ، والوقت من ذروة الانكماش إلى 80٪ من خط الأساس (TB. Con80) (الشكل 1 ب). لاختبار تأثير الإجهاد ، تم تحضين الخلايا باستخدام الأيزوبرينالين (ISO). بالإضافة إلى ذلك ، بالتزامن مع قياسات الانقباض ، تم قياس عابري Ca 2+ عن طريق تحميل الخلايا باستخدام إستر Fura-2-acetoxymethyl (Fura-2 AM) بتردد أخذ عينات يبلغ 250 هرتز. تم إجراء قياسات Ratiometric Ca 2+ 9 باستخدام مفتاح فائق على منطقة إضاءة قطرها 50 ميكرومتر ، المقابلة لمنطقة قياسات الانقباض. يتم تصوير بيانات قياس Ca 2+ على أنها الوقت من 20٪ من الذروة إلى الذروة في Ca2+ العابر (TP.Ca) والوقت من الذروة إلى 80٪ من خط الأساس (TB.Ca80) (الشكل 1C). تم استخدام أداة تحليل بيانات سريعة وتلقائية للحصول على متوسط المعلمات الحركية للانقباض والكالسيوم لكل منطقة.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الدراسة ، تم وصف طريقة لإجراء قياسات الانقباض والكالسيوم العابرة على hiPSC-CMs ودراسة تأثير الضغوطات / الأدوية على هذه الخلايا. تم إجراء قياسات الانقباض وقياسات الكالسيوم النسبية والاستجابة ل ISO على ثلاث جولات مختلفة من التمايز كتكرارات بيولوجية. لكل نسخة بيولوجية ، تم إجراء قياسات على ثلاثة آبار أثناء تكرار التقنية. كان سبب إجراء القياسات بهذه الطريقة هو ضمان إمكانية تقييم التباين البيولوجي والتباين التقني للعينة والمنصة. بصرف النظر عن النظر في العدد المناسب من النسخ البيولوجية والتقنية ، يمكن أن تلعب حالة استزراع hiPSC-CM دورا مهما في تحقيق نتائج ثابتة وقوية. من المهم أن تكون متسقة مع المعايير ، مثل عمر hiPSC-CMs ، وتكوين الوسط ، وظروف إعادة الطلاء ، ووقت حضانة المركب أثناء القياسات. في هذه الدراسة ، استغرق الأمر في المتوسط 568 ± 24 ثانية لقياس 11 منطقة مرتين لمدة 10 ثوان في بئر واحدة. يتضمن ذلك وقت حضانة ISO من 79 ± 11 ثانية. هذا ينخفض إلى ما يقرب من 10 دقائق لكل بئر ، والتي ينبغي أن تمكن الباحثين من قياس لوحة كاملة من 24 بئرا في ~ 4 ساعات. يتم استخدام التحكم في المناخ للحفاظ على استقرار CO2. هذا يسمح بقياس تأثير المركبات / الضغوطات على hiPSC-CMs بطريقة عالية السرعة.
لقياس وظيفة انقباض iPSC-CMs ، هناك العديد من الأنظمة الحالية التي تعتمد على علم البصرياتالوراثي 13 أو الفحص المجهري القائم على الفيديوالخالي من الملصقات 5,6. أنظمة علم البصريات الوراثية معقدة للغاية وتتطلب تقنيات خاصة للحصول على بيانات الكهروفيزيائية و / أو الانقباض. تعتمد الأنظمة الأخرى على التحليل اللاحق لمقاطع الفيديو ، الأمر الذي يتطلب مساحة تخزين كبيرة ويفتقر إلى التعليقات المباشرة أثناء الحصول على الفيديو. وبالإضافة إلى ذلك، يصعب تحقيق استبانة زمنية ومكانية كافية، مما قد يؤدي إلى نقص العينات. وبالمثل ، فإن HIPSC-CMs المحررة من CRISPR / CAS-9 مع مراسليالفلورسنت 7 قد تحدث تأثيرات غير مرغوب فيها على سلوك خلايا عضلة القلب. يعد استخدام الأصباغ الفلورية لقياسات استرخاء الانكماش نهجا أنيقا أيضا ، ولكنه يحد من إجراء التجارب على نفس العينة على مدى فترة أطول14.
ومع ذلك ، يمكن استخدام منصة القياس القائمة على البصريات هذه لقياس أوقات الانكماش والاسترخاء دون استخدام أي صبغة فلورية أو طرق غازية. ومع ذلك ، نظرا لأن ارتباط البكسل لا يوفر معلومات مكانية ، فلا يمكن استخدام هذه الطريقة لقياس قوة الانكماش ، بل يمكنها فقط اكتشاف التغيرات في سرعة الانكماش والاسترخاء بشكل موثوق. يتم التحكم في درجة حرارة نظام القياس المقدم ويمكنه الحصول على بيانات الكالسيوم والانقباض في الوقت الفعلي بدقة >200 إطار في الثانية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تخزين موقع كل قياس ، مما يتيح القياسات المزدوجة ، وبالتالي زيادة قوة التجارب. علاوة على ذلك ، توفر هذه المنصة للباحثين القدرة على تخزين البيانات وتحليلها على الفور بعد التجربة. بشكل عام ، يظهر نظام القياس القائم على البصريات هذا أنه طريقة واعدة لدراسة آليات العلاج الخلوي ، ويمكنه تقييم تأثير المركبات على وظائف hiPSC-CMs ، ويمكن أن يكون مفيدا في العملية قبل السريرية في فحص الأدوية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا البحث جزئيا من خلال منحة Eurostars Estars2 113937 CARDIOMYO (EM & DK) ، ومنحة NWO-VICI 91818602 (JV).
Materials
| µ-Plate 24 Well Black ID 14 mm | ibidi | 82421 | |
| B-27 Supplement (50x) | Thermo Fisher | 17504044 | |
| CytoSolver transient analysis tool | CytoCypher | A fast automatic data analysis tool | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher | 11320033 | |
| Fura-2, AM | Thermo Fisher | F1221 | |
| Isoprenaline hydrochloride | Merck | 15627 | |
| KnockOut™ Serum Replacement | Thermo Fisher | 10828010 | |
| Matrigel | Merck | CLS3542C | Basement membrane |
| MultiCell CytoCypher with Nikon 20x Super Fluor objective and 730 nm LED light source and Ionwizard software | CytoCypher | Optics-based measurement system | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher | 11875119 | |
| Tyrode | Self-made solution with final concentration of the following components: NaCl 134 mM, KCl 5 mM, Hepes 12 mM, MgSO4 1.2 mM, NaH2PO4 H2O 1.2 mM, Glucose 11 mM, Sodium Pyrovate 5 mM, 1 mM CaCl2 |
References
- Tsao, C. W., et al. Heart disease and stroke statistics-2022 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 145 (8), e153 (2022).
- Ghionzoli, N., et al. Current and emerging drug targets in heart failure treatment. Heart Failure Reviews. 27 (4), 1119-1136 (2022).
- Criscione, J., et al. Heart-on-a-chip platforms and biosensor integration for disease modeling and phenotypic drug screening. Biosensors and Bioelectronics. 220, 114840 (2023).
- vander Velden, J., et al. Animal models and animal-free innovations for cardiovascular research: current status and routes to be explored. Consensus document of the ESC Working Group on Myocardial Function and the ESC Working Group on Cellular Biology of the Heart. Cardiovascular Research. 118 (15), 3016-3051 (2022).
- Maddah, M., et al. A non-invasive platform for functional characterization of stem-cell-derived cardiomyocytes with applications in cardiotoxicity testing. Stem Cell Reports. 4 (4), 621-631 (2015).
- Sala, L., et al. MUSCLEMOTION: A versatile open software tool to quantify cardiomyocyte and cardiac muscle contraction in vitro and in vivo. Circulation Research. 122 (3), e5-e16 (2018).
- Sharma, A., et al. CRISPR/Cas9-mediated fluorescent tagging of endogenous proteins in human pluripotent stem cells. Current Protocols in Human Genetics. 96 (1), 1-20 (2018).
- Wang, L., et al. Hypertrophic cardiomyopathy-linked mutation in troponin T causes myofibrillar disarray and pro-arrhythmic action potential changes in human iPSC cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 114, 320-327 (2018).
- Luo, X., et al. IP3R-mediated compensatory mechanism for calcium handling in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes with cardiac ryanodine receptor deficiency. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 772 (2020).
- Lord, S. J., Velle, K. B., Mullins, R. D., Fritz-Laylin, L. K. SuperPlots: communicating reproducibility and variability in cell biology. The Journal of Cellular Biology. 219 (6), e202001064 (2020).
- Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages. Pharmacology and Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).
- Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
- Klimas, A., Ortiz, G., Boggess, S. C., Miller, E. W., Entcheva, E. Multimodal on-axis platform for all-optical electrophysiology with near-infrared probes in human stem-cell-derived cardiomyocytes. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 154, 62-70 (2020).
- van Meer, B. J., et al. Simultaneous measurement of excitation-contraction coupling parameters identifies mechanisms underlying contractile responses of hiPSC-derived cardiomyocytes. Nature Communications. 10 (1), 4325 (2019).
