Análise da densidade mitocondrial e distribuição longitudinal em fibras musculares esqueléticas vivas de ratos por microscopia confocal
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para analisar mudanças na densidade mitocondrial e distribuição longitudinal por imagens de músculo esquelético vivo usando microscopia confocal para varredura de rede mitocondrial.
Abstract
A mitocôndria é uma organela que pode ser alongada, fragmentada e renovada de acordo com as necessidades metabólicas das células. O remodelamento da rede mitocondrial permite que mitocôndrias saudáveis atendam às demandas celulares; entretanto, a perda dessa capacidade tem sido relacionada ao desenvolvimento ou progressão de diferentes patologias. No músculo esquelético, observam-se alterações na densidade e distribuição mitocondrial em condições fisiológicas e patológicas como exercício, envelhecimento, obesidade, entre outras. Portanto, o estudo da rede mitocondrial pode fornecer um melhor entendimento dos mecanismos relacionados a essas condições.
Aqui, um protocolo para imagens mitocondriais de fibras musculares esqueléticas vivas de ratos é descrito. As fibras são dissecadas manualmente em uma solução relaxante e incubadas com um indicador fluorescente de imagem de células vivas da mitocôndria (éster etílico de tetrametilrodamina, TMRE). O sinal mitocondrial é registrado por microscopia confocal usando o modo de varredura XYZ para obter imagens confocais da rede mitocondrial intermiofibrilar (FMI). Em seguida, as imagens confocais são processadas por limiar e binarização. A imagem confocal binarizada representa os pixels positivos para as mitocôndrias, que são então contados para obter a densidade mitocondrial. A rede mitocondrial no músculo esquelético é caracterizada por uma alta densidade populacional de FMI, que tem uma distribuição longitudinal periódica semelhante à dos túbulos T (TT). A Transformada Rápida de Fourier (FFT) é uma técnica de análise padrão realizada para avaliar a distribuição de TT que permite encontrar a frequência de distribuição e o nível de sua organização. Neste protocolo, a implementação do algoritmo FFT é descrita para a análise da distribuição mitocondrial longitudinal no músculo esquelético.
Introduction
As mitocôndrias formam redes altamente dinâmicas que são reguladas principalmente pelo equilíbrio entre seu alongamento (fusão) e fragmentação (fissão)1,2, que são moduladas pela expressão e atividade de proteínas como a Mitofusina 1 e 2 (Mfn1 e Mfn2), e a Atrofia de proteínas ópticas 1 (Opa1), que regulam a fusão da membrana mitocondrial externa e da membrana interna, respectivamente 1,2. A proteína relacionada à dinamina (Drp1) regula predominantemente a fissão mitocondrial quando é fosforilada no Ser6163.
No músculo esquelético, está bem estabelecido que a rede mitocondrial está disposta em subpopulações estruturalmente bem definidas com base na proximidade com diferentes regiões celulares (miofibrilas, sarcolemas e núcleos)4,5. As mitocôndrias localizadas logo abaixo do sarcolema são chamadas de mitocôndrias subsarcolemais (MES), aquelas localizadas entre os filamentos contráteis são chamadas de mitocôndrias intermiofibrilares (FMI) e a subpopulação mitocondrial ao redor dos núcleos é chamada de rede mitocondrial perinuclear (NMP). Além disso, tem sido sugerido que essas subpopulações mitocondriais têm funções específicas da região e são metabolicamente especializadas 4,5.
A manutenção da homeostase energética celular, que permite a função metabólica e contrátil, depende em grande parte da interação e comunicação em locais específicos através da rede mitocondrial (por exemplo, interação FMI e MSE)4,6. Além das interações da rede mitocondrial, as mitocôndrias também podem interagir com outras organelas, formando complexos estruturais e funcionais. Nesse sentido, tem sido demonstrado que o FMI pode estar localizado adjacente ao retículo sarcoplasmático (RS) e próximo às unidades de liberação de Ca2+ (CRU), formadas pelos túbulos transversos (TT)7. Este fato é relevante devido ao papel da captação mitocondrial de Ca2+ na regulação da síntese de ATP e apoptose. Recentemente, um papel potencial na regulação dos transitórios citosólicos de Ca2+ também tem sido sugerido8.
Os TT são invaginações do sarcolema que apresentam distribuição periódica ao longo do eixo longitudinal dos cardiomiócitos e das fibras musculares esqueléticas9,10, semelhante à distribuição doFMI5. Alterações na distribuição do TT têm implicações fisiológicas importantes, dado seu papel na função contrátil. Entretanto, essas alterações têm sido avaliadas principalmente nos cardiomiócitos. A análise por Transformada Rápida de Fourier (FFT) permite a conversão de sinais periódicos do domínio da distância para o domínio da frequência, resultando em um espectro de FFT que indica a frequência e a regularidade do sinal11,12,13. Embora existam evidências de que a organização da rede mitocondrial nas fibras musculares esqueléticas seja essencial para a adaptação a diferentes condições metabólicas, como durante a regeneração após lesãomuscular14,15, a maioria das análises é realizada qualitativamente.
Além disso, dado que a disfunção mitocondrial tem sido associada a várias doenças musculares esqueléticas (por exemplo, atrofia por desuso)2 e não musculares, particularmente doenças metabólicas, e à perda de massa muscular associada (isto é, atrofia)16, a avaliação quantitativa da rede e distribuição mitocondrial no músculo esquelético assume relevância. Recentemente, uma diferença significativa na distribuição longitudinal das mitocôndrias das fibras musculares gastrocnêmias entre um grupo de obesos (Ob; Zucker fa/fa ratos) e um grupo magro (Lean; Zucker +/+ ratos) foi identificada através da FFT17. Este estudo demonstrou a utilidade da FFT na análise da distribuição mitocondrial. Portanto, este protocolo apresenta uma metodologia para estudar mitocôndrias em fibras musculares esqueléticas vivas a partir de imagens obtidas por microscopia confocal de fluorescência. A densidade mitocondrial é quantificada pelo limiar de fundo, e a análise da distribuição mitocondrial longitudinal pela análise FFT também é descrita. Um esquema de fluxo de trabalho é apresentado na Figura 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
As mitocôndrias são organelas com alta capacidade de remodelação. Seu conteúdo, densidade e distribuição podem ser rapidamente modificados através da ativação dos mecanismos de fusão e fissão mitocondrial, conhecidos como dinâmica mitocondrial1, e do equilíbrio entre os mecanismos de turnover mitocondrial: a biogênese mitocondrial e a via especializada de degradação mitocondrial, a mitofagia21,22. O conteúdo e a morfologia mitocondrial podem variar de acordo com o tipo celular e o estágio de desenvolvimento e podem ser remodelados sob diferentes estímulos fisiológicos e patológicos 17,22,23,24. Portanto, o estudo da morfologia mitocondrial tem sido relevante há mais de meio século25. Notadamente, a análise de mitocôndrias por microscopia eletrônica tem sido a técnica padrão aplicada em múltiplosestudos26.
Estudos fluorescentes por microscopia confocal têm ganhado relevância nos últimos anos devido à sua capacidade de imageamento de células vivas de mitocôndrias em diferentes profundidades de fibras, o que poderia ajudar a entender melhor o papel das mitocôndrias no músculo esquelético em diferentes condições adaptativas e desadaptativas27. Neste estudo, uma metodologia para a análise da densidade e distribuição mitocondrial em fibras musculares esqueléticas vivas por microscopia confocal é descrita. Um dos principais desafios de trabalhar com fibras musculares esqueléticas vivas é evitar a contração desde os processos de isolamento até o registro confocal mitocondrial. Para atingir esse objetivo, uma solução de alto teor de Mg e ATP Relax17 é utilizada para manter as fibras relaxadas por pelo menos 2 h, o que dá tempo suficiente para realizar o processo de isolamento das fibras, a carga de fluoróforo e a aquisição do sinal mitocondrial por microscopia confocal. Um ponto crítico do protocolo é a obtenção das fibras mecanicamente, pois requer alta precisão e tecido fresco; no entanto, é possível obter feixes de fibras viáveis a partir de músculo de rato com esta técnica previamente utilizada erelatada28. A obtenção de fibras íntegras permite preservar o sarcolema e o meio intracelular, mantendo o crosstalk metabólico e funcional entre as estruturas celulares28,29.
Ao contrário do trabalho com tecidos ou células fixas, a aquisição de imagens fluorescentes de células vivas por microscopia confocal permite o monitoramento em tempo real do efeito de diversas condições experimentais. O presente protocolo pode ser utilizado para explorar mudanças na densidade e distribuição mitocondrial em tempo real e explorar diferenças entre grupos experimentais, como os exemplos aqui apresentados entre fibras magras e derivadas de Ob (Figura 3 e Figura 4). Deve-se sempre considerar que a imagem de células vivas implica na padronização de condições ideais de trabalho com pequenos danos celulares. O tempo de trabalho, a qualidade das soluções utilizadas, os parâmetros de aquisição e a exposição dos lasers devem ser finamente controlados. Assim, considerações essenciais são mencionadas a seguir.
As mitocôndrias das fibras musculares não podem ser registradas inteiramente longitudinalmente por microscopia confocal devido ao tamanho da fibra e ao dano da fibra que pode ser causado pela longa exposição ao laser. No entanto, uma amostra representativa da fibra é registrada sob esta técnica. Embora seja possível registrar toda a espessura da fibra muscular esquelética de um rato por microscopia confocal, isso implica em maior tempo de registro e exposição ao feixe de laser. No caso de ratos controle, problemas com essas gravações não foram encontrados. No entanto, fibras de condições patológicas podem ser mais suscetíveis a danos, como observado nas fibras de ratos Ob. Consequentemente, a aquisição de uma pilha de imagens confocais representativas obtidas em diferentes distâncias Z é preferível. Quando apenas uma seção da espessura da fibra é registrada, recomenda-se tomar a pilha na mesma profundidade em todas as fibras testadas, uma vez que a distribuição e a densidade mitocondrial podem variar de acordo com sua posição dentro da fibra. A aquisição do sinal a uma profundidade acima de 15 μm é recomendada para obter imagens confocais representativas do FMI, evitando populações de MES situadas próximas à periferia.
Durante a aquisição confocal, algumas considerações importantes devem ser levadas em consideração. Primeiramente, a seleção da objetiva de imersão considerando o meio de magnificação, NA alto e imersão. Como as células são mantidas em um meio de incubação hidrofílico, o índice de refração do meio de incubação e imersão deve ser semelhante para obter um bom sinal e varrer profundamente o tecido. Geralmente obtido usando uma lente objetiva de imersão em água. As imagens confocais da Figura 3 e Figura 4 foram adquiridas com objetiva de imersão em água de 20x, 0,7 NA. Este objetivo permite o registro da fibra em toda a sua profundidade, mas a varredura a 15, 18 e 21 μm foi decidida, uma vez que imagens confocais representativas do FMI podem ser obtidas com sinal de alta intensidade de fluorescência e pequenos danos à fibra. Outras ampliações, como 40x e óleo como meio de imersão, podem ser consideradas, mas precisam ser avaliadas.
Em segundo lugar, o tamanho do pixel para aquisição da imagem é calculado de acordo com o teorema de Nyquist, que permite a seleção de um tamanho de pixel apropriado que evite a superamostra (maior exposição ao laser) e a subamostra (leva a menor resolução)30. O cálculo depende das características da objetiva selecionada e do comprimento de onda (~90 nm). Pode ser ajustado com o zoom; portanto, apenas uma configuração de zoom fornece um tamanho de pixel ideal30. No entanto, na prática, o zoom também depende da área do espécime a ser analisado. Assim, encontrar equilíbrio permite trabalhar com um tamanho de pixel que se aproxime mais do critério de Nyquist e que também se encaixe na área a ser analisada. A Figura 3 e a Figura 4 foram adquiridas com um tamanho de pixel de 150 e 190 nm, o que permitiu a análise da largura total da fibra que é de ~50-80 μm.
Em terceiro lugar, deve ser usado um diâmetro de orifício apropriado que impeça que a luz fora de foco atinja o detector. Tipicamente, 1 Airy é considerado o tamanho ideal do orifício, pois permite a detecção de ~80% dos fótons provenientes do plano de foco30. No entanto, algumas amostras biológicas coradas que apresentam baixos níveis de fluorescência requerem um aumento do orifício30. As imagens confocais da Figura 3 e Figura 4 foram adquiridas com um orifício de 3 Airy devido a um baixo sinal captado com um Airy mais baixo. É importante considerar que o aumento da intensidade do sinal resultante do aumento do tamanho do orifício leva à redução da resolução devido ao aumento da luz captada fora de foco. Por esse motivo, recomendamos o uso de um tamanho pinhole o mais próximo possível de 1 arejado.
Quando adequadamente adquiridas, as imagens confocais podem ser processadas para obter informações quantitativas sobre densidade e distribuição mitocondrial. Independentemente disso, a etapa crítica de processamento da imagem de limiar precisa ser realizada antes da análise para melhorar a quantificação do sinal. Durante esta etapa crucial, o valor de intensidade de fluorescência que separa os pixels positivos para mitocôndrias daqueles do fundo é definido. O limiar pode ser definido por um ajuste gaussiano do pico que representa a mitocôndria quando o histograma da imagem exibe dois picos, um correspondendo ao fundo e outro à mitocôndria. No entanto, uma distribuição bimodal nem sempre é alcançada em cada uma das imagens, portanto, outros métodos de limiares devem ser aplicados.
Nesse protocolo, descreve-se a implementação do thresholding de Otsu, que é um método não paramétrico e não supervisionado projetado para encontrar o valor limite quando os dois picos não estão separados, ou outros picos estão presentes31. Otsu pode ser facilmente aplicado usando uma plataforma de código aberto para análise de imagens biológicas; no entanto, outros métodos de limiares podem ser testados. O mesmo método de limiar deve ser aplicado a todas as imagens confocais e deve ser calculado independentemente para cada imagem confocal. Aplicar o limite a uma pilha inteira leva a resultados incorretos. Uma vez obtidas as imagens binárias após o processo de limiarização, a análise da densidade mitocondrial e FFT pode ser facilmente realizada seguindo as instruções descritas neste protocolo. No entanto, deve-se ter cuidado ao realizar ambas as análises para evitar a inclusão de núcleos e capilares, pois isso levaria a erros de quantificação. Em relação à densidade, basta subtrair os pixels, ou a área ocupada pelos núcleos ou capilares, dos pixels ou área total a ser analisada. Além disso, ao realizar a análise do FFT, deve-se verificar se o sinal mitocondrial está reto. Por outro lado, quando o sinal mitocondrial é inclinado, ele pode produzir perfis que não representam a distribuição longitudinal mitocondrial, produzindo dados incorretos do espectro FFT. Além disso, uma etapa de pré-processamento pode ser aplicada para reduzir o ruído nas imagens. Este protocolo descreve duas etapas opcionais de pré-processamento usando um filtro mediano e deconvolução 2D. Os efeitos desses métodos de pré-processamento sobre a imagem e o conteúdo de densidade mitocondrial são apresentados na Figura Suplementar S1. É importante considerar que, embora esses pré-processos possam melhorar a qualidade da imagem, eles também podem resultar na perda de certos detalhes da imagem. Portanto, devem ser usados com cautela e aplicados de forma consistente em todas as imagens analisadas.
Apesar de suas vantagens, a microscopia confocal é limitada por uma resolução lateral (XY) de 180-250 nm quando as condições ótimas de aquisição são implementadas32. O diâmetro mitocondrial é de ~200-700 nm, próximo ao limite de difração da microscopia confocal; assim, estruturas submitocondriais não podem ser adequadamente detectadas33 e não podem ser avaliadas por análises de densidade e FFT mostradas neste protocolo. Outras técnicas de super-resolução da microscopia, como a microscopia de reconstrução óptica estocástica (STORM), a microscopia de depleção de emissão estimulada (STED) ou a microscopia de iluminação estruturada (SIM), podem ser exploradas para resolver estruturas submitocondriais32. Neste protocolo, as imagens confocais das mitocôndrias são obtidas utilizando o fluoróforo TMRE, que depende do potencial de membrana mitocondrial. Portanto, a intensidade fluorescente mitocondrial pode variar de acordo com seu potencial de membrana. Um processo de limiar é realizado antes da análise dos dados para superar esse problema. Todos os pixels acima de um limiar definido são considerados positivos para o sinal mitocondrial, independentemente do seu valor de fluorescência. No entanto, deve-se notar que mitocôndrias com um potencial de membrana muito baixo não podem ser resolvidas com esta técnica. Assim, estudos complementares de quantificação do conteúdo de proteínas mitocondriais são recomendados. Uma vantagem do uso da TMRE é que imagens confocais também podem ser usadas para análise do potencial de membrana mitocondrial, mas controles adequados com agentes desacopladores precisam ser realizados, como carbonilcianeto-p-trifluorometoxifenilhidrazona (FCCP). Além disso, as instruções para análise de densidade e distribuição mitocondrial podem ser obtidas usando indicadores fluorescentes verdes para mitocôndrias, que carregam mitocôndrias independentemente de seu potencial de membrana, mas a estratégia de incubação e os ajustes de aquisição confocal precisam ser padronizados.
Dado que a estrutura mitocondrial está relacionada às funções mitocondriais e celulares essenciais, o protocolo aqui descrito pode fornecer informações valiosas sobre sua remodelação durante a doença ou por um insulto ao estresse particular. Isso poderia contribuir para uma melhor compreensão das principais funções do músculo esquelético governado por mitocôndrias, como a produção de energia, ou nas quais as mitocôndrias desempenham um papel importante na interação com outras organelas, como o acoplamento contração-metabolismo. Seguir as instruções do protocolo permite estimar a densidade e distribuição mitocondrial no músculo vivo esquelético. As etapas do protocolo são divididas em três etapas principais focadas na dissecção do feixe muscular esquelético, microscopia confocal e análise de imagens, onde instruções detalhadas e considerações importantes são incluídas. Notavelmente, o protocolo pode ser otimizado para explorar etapas Z adicionais para a reconstrução mitocondrial completa dentro da fibra de acordo com as necessidades do usuário. Por exemplo, as etapas de análise e imagem confocal podem ser testadas para estudar estruturas celulares com distribuição semelhante, como TT em amostras vivas e fixas.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Faculdade de Medicina e pelo Instituto de Pesquisa em Obesidade de Tecnologico de Monterrey. A Figura 3A foi criada com o software Scientific Image and Illustration.
Materials
| Adenosine 5’-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A6419 | |
| Borosilicate glass coverslip | Warner Instruments | 64-0709 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 | |
| Confocal microscope software Leica Application Suite | Leica | 2.7.3.9723 | |
| Creatine Phosphokinase | Sigma-Aldrich | C3755 | |
| DeconvolutionLab2 (DeconvolutionLab_2.jar) | Biomedical Imaging Group, EPFL | http://bigwww.epfl.ch/deconvolution/deconvolutionlab2/ | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DL-Aspartic acid potassium sat hemihydrate | Sigma-Aldrich | 11240 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N´N´-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Forceps | Miltex | MH-18 | |
| HC PL APO 20x/ 0.7 IMM objective | Leica | 506517 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Iris scissors | Miltex | 5-304 | |
| L-(-)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M7397 | |
| L-glutamic acid monosodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Maxchelator | UC Davis Health | https://somapp.ucdmc.ucdavis.edu/pharmacology/bers/maxchelator/downloads.htm | |
| Micro scissors | Miltex | 18-1633 | |
| Open-source platform for biological-image analysis Fiji | Public, maintained by Eliceiri/LOCI group, Jug group, and Tomancak lab.Fiji | https://fiji.sc/ | |
| Phosphocreatine disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| PSF Generator (PSF_Generator.jar) | Biomedical Imaging Group, EPFL | http://bigwww.epfl.ch/algorithms/psfgenerator/ | |
| Recording chamber | Warner Instruments | RC-27N | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Spreadsheet Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 508 | |
| Tetramethylrhodamine, ethyl ester | Invitrogen | T669 |
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