Analisi della densità mitocondriale e della distribuzione longitudinale nelle fibre muscolari scheletriche vive di ratto mediante microscopia confocale
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per analizzare i cambiamenti nella densità mitocondriale e nella distribuzione longitudinale mediante imaging del muscolo scheletrico vivo utilizzando la microscopia confocale per la scansione della rete mitocondriale.
Abstract
Il mitocondrio è un organello che può essere allungato, frammentato e rinnovato in base alle esigenze metaboliche delle cellule. Il rimodellamento della rete mitocondriale consente ai mitocondri sani di soddisfare le richieste cellulari; Tuttavia, la perdita di questa capacità è stata correlata allo sviluppo o alla progressione di diverse patologie. Nel muscolo scheletrico, si osservano cambiamenti nella densità mitocondriale e nella distribuzione in condizioni fisiologiche e patologiche come l’esercizio fisico, l’invecchiamento e l’obesità, tra gli altri. Pertanto, lo studio della rete mitocondriale può fornire una migliore comprensione dei meccanismi legati a tali condizioni.
Qui, viene descritto un protocollo per l’imaging mitocondriale di fibre muscolari scheletriche vive di ratti. Le fibre vengono sezionate manualmente in una soluzione rilassante e incubate con un indicatore fluorescente di imaging su cellule vive dei mitocondri (estere etilico tetrametilrodamina, TMRE). Il segnale mitocondriale viene registrato mediante microscopia confocale utilizzando la modalità di scansione XYZ per ottenere immagini confocali della rete mitocondriale intermiofibrillare (IMF). Successivamente, le immagini confocali vengono elaborate mediante thresholding e binarizzazione. L’immagine confocale binarizzata tiene conto dei pixel positivi per i mitocondri, che vengono poi contati per ottenere la densità mitocondriale. La rete mitocondriale nel muscolo scheletrico è caratterizzata da un’alta densità di popolazione IMF, che ha una distribuzione longitudinale periodica simile a quella dei tubuli T (TT). La Fast Fourier Transform (FFT) è una tecnica di analisi standard eseguita per valutare la distribuzione delle TT che permette di trovare la frequenza di distribuzione e il livello della loro organizzazione. In questo protocollo viene descritta l’implementazione dell’algoritmo FFT per l’analisi della distribuzione mitocondriale longitudinale nel muscolo scheletrico.
Introduction
I mitocondri formano reti altamente dinamiche che sono regolate principalmente dall’equilibrio tra il loro allungamento (fusione) e frammentazione (fissione)1,2, che sono modulate dall’espressione e dall’attività di proteine come la Mitofusina 1 e 2 (Mfn1 e Mfn2), e l’atrofia della proteina ottica 1 (Opa1), che regolano la fusione della membrana mitocondriale esterna e della membrana interna, rispettivamente 1,2. La proteina correlata alla dinamina (Drp1) regola prevalentemente la fissione mitocondriale quando è fosforilata nel Ser6163.
Nel muscolo scheletrico, è stato ben stabilito che la rete mitocondriale è organizzata in sottopopolazioni strutturalmente ben definite in base alla loro vicinanza a diverse regioni cellulari (miofibrille, sarcolemmi e nuclei)4,5. I mitocondri situati proprio sotto il sarcolemma sono chiamati mitocondri subsarcolemmali (SSM), quelli situati tra i filamenti contrattili sono chiamati mitocondri intermiofibrillari (IMF) e la sottopopolazione mitocondriale intorno ai nuclei è chiamata rete mitocondriale perinucleare (PMN). Inoltre, è stato suggerito che queste sottopopolazioni mitocondriali abbiano funzioni regionali-specifiche e siano metabolicamente specializzate 4,5.
Il mantenimento dell’omeostasi energetica cellulare, che consente la funzione metabolica e contrattile, dipende in larga misura dall’interazione e dalla comunicazione su siti specifici attraverso la rete mitocondriale (ad esempio, l’interazione IMF e SSM)4,6. Oltre alle interazioni della rete mitocondriale, il mitocondrio può interagire anche con altri organelli, formando complessi strutturali e funzionali. A questo proposito, è stato dimostrato che l’IMF può essere localizzato adiacente al reticolo sarcoplasmatico (SR) e in prossimità delle unità di rilascio di Ca2+ (CRU), formate dai tubuli trasversali (TT)7. Questo fatto è rilevante a causa del ruolo dell’assorbimento mitocondriale di Ca2+ nella regolazione della sintesi di ATP e dell’apoptosi. Recentemente, è stato anche suggerito un potenziale ruolo nella regolazione dei transienti citosolici di Ca2+ 8.
Le TT sono invaginazioni di sarcolemmi che hanno una distribuzione periodica lungo l’asse longitudinale dei cardiomiociti e delle fibre muscolari scheletriche 9,10, simile alla distribuzione IMF 5. I cambiamenti nella distribuzione delle TT hanno importanti implicazioni fisiologiche, dato il loro ruolo nella funzione contrattile. Tuttavia, questi cambiamenti sono stati valutati principalmente nei cardiomiociti. L’utilizzo dell’analisi FFT (Fast Fourier Transform) consente la conversione di segnali periodici dal dominio della distanza al dominio della frequenza, ottenendo uno spettro FFT che indica la frequenza e la regolarità del segnale11,12,13. Sebbene vi siano prove che l’organizzazione della rete mitocondriale nelle fibre muscolari scheletriche sia essenziale per l’adattamento a diverse condizioni metaboliche, poiché durante la rigenerazione dopo una lesione muscolare14,15, la maggior parte delle analisi viene eseguita qualitativamente.
Inoltre, dato che la disfunzione mitocondriale è stata associata a diverse malattie legate al muscolo scheletrico (ad esempio, atrofia da disuso)2 e non muscolari, in particolare le malattie metaboliche, e la perdita associata di massa muscolare (ad esempio, atrofia)16, la valutazione quantitativa della rete mitocondriale e della distribuzione nel muscolo scheletrico assume rilevanza. Recentemente, una differenza significativa nella distribuzione longitudinale dei mitocondri delle fibre muscolari gastrocnemie tra un gruppo obeso (Ob; Zucker fa/fa ratti), e un gruppo magro (Lean; Zucker +/+ ratti) è stato identificato attraverso FFT17. Questo studio ha dimostrato l’utilità della FFT nell’analisi della distribuzione mitocondriale. Pertanto, questo protocollo presenta una metodologia per studiare i mitocondri nelle fibre muscolari scheletriche vive da immagini ottenute mediante microscopia confocale a fluorescenza. La densità mitocondriale viene quantificata mediante la soglia di fondo e viene descritta anche l’analisi della distribuzione mitocondriale longitudinale mediante analisi FFT. Nella Figura 1 viene presentato uno schema del flusso di lavoro.
Protocol
Representative Results
Discussion
I mitocondri sono organelli con un’elevata capacità di rimodellamento. Il loro contenuto, la loro densità e la loro distribuzione possono essere rapidamente modificati attraverso l’attivazione dei meccanismi di fusione e fissione mitocondriale, noti come dinamica mitocondriale1, e l’equilibrio tra i meccanismi di turnover mitocondriale: la biogenesi mitocondriale e la via di degradazione dei mitocondri specializzata, la mitofagia21,22. Il contenuto e la morfologia mitocondriale possono variare a seconda del tipo di cellula e dello stadio di sviluppo e possono essere rimodellati sotto diversi stimoli fisiologici e patologici 17,22,23,24. Pertanto, lo studio della morfologia mitocondriale è stato rilevante per oltre mezzo secolo25. In particolare, l’analisi dei mitocondri attraverso la microscopia elettronica è stata la tecnica standard applicata in molteplici studi26.
Gli studi di fluorescenza al microscopio confocale hanno acquisito rilevanza negli ultimi anni grazie alla loro capacità di imaging di mitocondri a diverse profondità di fibra, che potrebbero aiutare a comprendere meglio il ruolo dei mitocondri nel muscolo scheletrico in diverse condizioni adattative e disadattive27. In questo studio viene descritta una metodologia per l’analisi della densità e della distribuzione dei mitocondri nelle fibre muscolari scheletriche vive mediante microscopia confocale. Una delle principali sfide del lavoro con le fibre muscolari scheletriche vive è quella di evitare la contrazione dai processi di isolamento fino alla registrazione confocale mitocondriale. Per raggiungere questo obiettivo, viene utilizzata una soluzione ad alto contenuto di Mg e ATP Relax17 per mantenere le fibre rilassate per almeno 2 ore, il che dà il tempo sufficiente per eseguire il processo di isolamento delle fibre, il carico di fluorofori e l’acquisizione del segnale mitocondriale mediante microscopia confocale. Un punto critico del protocollo è l’ottenimento meccanico delle fibre poiché richiede alta precisione e tessuto fresco; Tuttavia, è possibile ottenere fasci di fibre vitali dal muscolo di ratto con questa tecnica precedentemente utilizzata e riportata28. L’ottenimento di fibre intatte permette di preservare il sarcolemma e l’ambiente intracellulare, mantenendo il crosstalk metabolico e funzionale tra le strutture cellulari28,29.
A differenza del lavoro con tessuti o cellule fisse, l’acquisizione di immagini fluorescenti per l’imaging di cellule vive mediante microscopia confocale consente il monitoraggio in tempo reale dell’effetto di diverse condizioni sperimentali. Il presente protocollo può essere utilizzato per esplorare i cambiamenti nella densità e nella distribuzione mitocondriale in tempo reale ed esplorare le differenze tra i gruppi sperimentali, come gli esempi qui presentati tra fibre derivate da Lean e Ob (Figura 3 e Figura 4). Va sempre considerato che l’imaging di cellule vive implica la standardizzazione di condizioni di lavoro ottimali con un danno cellulare minore. Il tempo di lavoro, la qualità delle soluzioni utilizzate, i parametri di acquisizione e l’esposizione dei laser devono essere finemente controllati. Di seguito, quindi, si riportano le considerazioni essenziali.
I mitocondri delle fibre muscolari non possono essere registrati interamente longitudinalmente dalla microscopia confocale a causa delle dimensioni della fibra e del danno della fibra che può essere causato da una lunga esposizione al laser. Tuttavia, con questa tecnica viene registrato un campione rappresentativo della fibra. Sebbene sia possibile registrare l’intero spessore della fibra muscolare scheletrica di un ratto mediante microscopia confocale, ciò implica un tempo di registrazione e un’esposizione al raggio laser più lunghi. Nel caso dei ratti di controllo, non sono stati riscontrati problemi con queste registrazioni. Tuttavia, le fibre provenienti da condizioni patologiche possono essere più suscettibili ai danni, come osservato nelle fibre dei ratti Ob. Di conseguenza, è preferibile acquisire una pila di immagini confocali rappresentative ottenute a diverse distanze Z. Quando viene registrata solo una sezione dello spessore della fibra, si consiglia di prelevare la pila alla stessa profondità su tutte le fibre testate poiché la distribuzione e la densità mitocondriale possono variare in base alla sua posizione all’interno della fibra. L’acquisizione del segnale ad una profondità superiore a 15 μm è raccomandata per ottenere immagini confocali rappresentative dell’FMI, evitando le popolazioni SSM che si trovano vicino alla periferia.
Durante l’acquisizione confocale, è necessario tenere conto di alcune importanti considerazioni. Innanzitutto, la selezione dell’obiettivo a immersione considerando l’ingrandimento, l’elevato NA e il mezzo di immersione. Poiché le cellule sono mantenute in un mezzo di incubazione idrofilo, l’indice di rifrazione del mezzo di incubazione e immersione deve essere simile per ottenere un buon segnale e scansionare in profondità nel tessuto. Di solito si ottiene utilizzando una lente dell’obiettivo a immersione in acqua. Le immagini confocali della Figura 3 e della Figura 4 sono state acquisite con un obiettivo a immersione in acqua 20x, 0,7 NA. Questo obiettivo consente di registrare la fibra in tutta la sua profondità, ma è stata decisa la scansione a 15, 18 e 21 μm poiché è possibile ottenere immagini confocali rappresentative dell’IMF con segnale ad alta intensità di fluorescenza e danni minori alla fibra. Altri ingrandimenti, come il 40x e l’olio come mezzo di immersione, possono essere presi in considerazione, ma devono essere valutati.
In secondo luogo, la dimensione dei pixel per l’acquisizione delle immagini viene calcolata in base al teorema di Nyquist, che consente la selezione di una dimensione dei pixel appropriata che evita il sovracampionamento (maggiore esposizione laser) e il sottocampionamento (porta a una minore risoluzione)30. Il calcolo dipende dalle caratteristiche della lente dell’obiettivo selezionata e dalla lunghezza d’onda (~90 nm). Può essere regolato con lo zoom; Pertanto, solo un’impostazione di zoom fornisce una dimensione ottimaledei pixel 30. Tuttavia, in pratica, lo zoom dipende anche dall’area del campione da analizzare. Pertanto, trovare l’equilibrio consente di lavorare con una dimensione dei pixel che si avvicina di più al criterio di Nyquist e che si adatta anche all’area da analizzare. La Figura 3 e la Figura 4 sono state acquisite con una dimensione dei pixel di 150 e 190 nm, che ha permesso di analizzare l’intera larghezza della fibra che è ~50-80 μm.
In terzo luogo, è necessario utilizzare un diametro stenopeico appropriato che impedisca alla luce sfocata di raggiungere il rilevatore. Tipicamente, 1 Airy è considerata la dimensione ottimale del foro stenopeico poiché consente la rilevazione di ~80% dei fotoni provenienti dal piano di fuoco30. Tuttavia, alcuni campioni biologici colorati che mostrano bassi livelli di fluorescenza richiedono un aumento del foro stenopeico30. Le immagini confocali della Figura 3 e della Figura 4 sono state acquisite con una dimensione del foro stenopeico di 3 Airy a causa di un segnale basso catturato con un Airy inferiore. È importante considerare che l’aumento dell’intensità del segnale derivante dall’aumento della dimensione del foro stenopeico porta alla riduzione della risoluzione a causa dell’aumento della luce catturata fuori fuoco. Per questo motivo, si consiglia di utilizzare una dimensione del foro stenopeico il più vicino possibile a 1 ariosa.
Se adeguatamente acquisite, le immagini confocali possono essere elaborate per ottenere informazioni quantitative sulla densità e la distribuzione mitocondriale. Indipendentemente da ciò, la fase critica di elaborazione dell’immagine di soglia deve essere eseguita prima dell’analisi per migliorare la quantificazione del segnale. Durante questo passaggio cruciale, viene definito il valore dell’intensità di fluorescenza che separa i pixel positivi per i mitocondri da quelli dello sfondo. La soglia può essere definita da un adattamento gaussiano del picco che rappresenta i mitocondri quando l’istogramma dell’immagine mostra due picchi, uno corrispondente allo sfondo e l’altro ai mitocondri. Tuttavia, non sempre si ottiene una distribuzione bimodale in ciascuna delle immagini, quindi è necessario applicare altri metodi di soglia.
In questo protocollo viene descritta l’implementazione della soglia di Otsu, che è un metodo non parametrico e non supervisionato progettato per trovare il valore di soglia quando i due picchi non sono separati o sono presenti altri picchi31. Otsu può essere facilmente applicato utilizzando una piattaforma open-source per l’analisi di immagini biologiche; Tuttavia, è possibile testare altri metodi di soglia. Lo stesso metodo di soglia deve essere applicato a tutte le immagini confocali e deve essere calcolato indipendentemente per ciascuna immagine confocale. L’applicazione della soglia a un intero stack porta a risultati errati. Una volta ottenute le immagini binarie dopo il processo di soglia, l’analisi della densità mitocondriale e della FFT può essere facilmente effettuata seguendo le istruzioni descritte in questo protocollo. Tuttavia, quando si eseguono entrambe le analisi, è necessario prestare attenzione per evitare di includere nuclei e capillari, in quanto ciò comporterebbe errori di quantificazione. Per quanto riguarda la densità, è sufficiente sottrarre i pixel, ovvero l’area occupata dai nuclei o dai capillari, dai pixel o dall’area totale da analizzare. Inoltre, quando si esegue l’analisi FFT, è necessario verificare che il segnale mitocondriale sia dritto. Al contrario, quando il segnale mitocondriale è inclinato, può produrre profili che non rappresentano la distribuzione longitudinale mitocondriale, producendo dati errati sullo spettro FFT. Inoltre, è possibile applicare una fase di pre-elaborazione per ridurre il rumore nelle immagini. Questo protocollo descrive due fasi di pre-elaborazione facoltative utilizzando un filtro mediano e la deconvoluzione 2D. Gli effetti di questi metodi di pre-elaborazione sull’immagine e sul contenuto di densità mitocondriale sono presentati nella Figura supplementare S1. È importante considerare che, sebbene queste pre-elaborazioni possano migliorare la qualità dell’immagine, possono anche comportare la perdita di alcuni dettagli dell’immagine. Pertanto, devono essere utilizzati con cautela e applicati in modo coerente a tutte le immagini analizzate.
Nonostante i suoi vantaggi, la microscopia confocale è limitata da una risoluzione laterale (XY) di 180-250 nm quando si verificano le condizioni ottimali per l’acquisizione32. Il diametro mitocondriale è ~200-700 nm, vicino al limite di diffrazione della microscopia confocale; pertanto, le strutture sub-mitocondriali non possono essere adeguatamente rilevate33 e non possono essere valutate mediante analisi di densità e FFT mostrate in questo protocollo. Altre tecniche di microscopia a super-risoluzione, come la microscopia stocastica a ricostruzione ottica (STORM), la nanoscopia a deplezione di emissione stimolata (STED) o la microscopia a illuminazione strutturata (SIM), possono essere esplorate per risolvere le strutture sub-mitocondriali32. In questo protocollo, le immagini confocali dei mitocondri sono ottenute utilizzando il fluoroforo TMRE, che dipende dal potenziale di membrana mitocondriale. Pertanto, l’intensità della fluorescenza mitocondriale può variare in base al loro potenziale di membrana. Prima dell’analisi dei dati viene eseguito un processo di soglia per superare questo problema. Tutti i pixel al di sopra di una soglia definita sono considerati positivi per il segnale mitocondriale indipendentemente dal loro valore di fluorescenza. Tuttavia, va notato che i mitocondri con un potenziale di membrana molto basso non possono essere risolti con questa tecnica. Pertanto, si raccomandano studi complementari sulla quantificazione del contenuto proteico mitocondriale. Un vantaggio dell’utilizzo di TMRE è che le immagini confocali possono essere utilizzate anche per l’analisi del potenziale di membrana mitocondriale, ma è necessario eseguire controlli adeguati con agenti di disaccoppiamento come il carbonilcianuro-p-trifluorometossifenilidrazone (FCCP). Inoltre, le istruzioni per l’analisi della densità e della distribuzione mitocondriale possono essere ottenute utilizzando indicatori fluorescenti verdi per i mitocondri, che caricano i mitocondri indipendentemente dal loro potenziale di membrana, ma la strategia di incubazione e le impostazioni di acquisizione confocale devono essere standardizzate.
Dato che la struttura dei mitocondri è correlata a funzioni mitocondriali e cellulari essenziali, il protocollo qui descritto può fornire preziose informazioni sul loro rimodellamento durante la malattia o da un particolare insulto da stress. Potrebbe contribuire a una migliore comprensione delle funzioni chiave del muscolo scheletrico governato dai mitocondri, come la produzione di energia, o in cui i mitocondri svolgono un ruolo importante nell’interazione con altri organelli, come l’accoppiamento contrazione-metabolismo. Seguire le istruzioni del protocollo consente di stimare la densità e la distribuzione mitocondriale nel muscolo scheletrico vivo. Le fasi del protocollo sono suddivise in tre fasi principali incentrate sulla dissezione del fascio muscolare scheletrico, sulla scansione al microscopio confocale e sull’analisi delle immagini, in cui sono incluse istruzioni dettagliate e considerazioni importanti. In particolare, il protocollo può essere ulteriormente ottimizzato per esplorare ulteriori passaggi Z per la ricostruzione mitocondriale completa all’interno della fibra in base alle esigenze dell’utente. Ad esempio, l’immagine confocale e le fasi di analisi possono essere testate per studiare strutture cellulari con distribuzione simile, come la TT in campioni vivi e fissi.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Scuola di Medicina e dall’Istituto per la Ricerca sull’Obesità del Tecnologico de Monterrey. La Figura 3A è stata creata con il software Scientific Image and Illustration.
Materials
| Adenosine 5’-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A6419 | |
| Borosilicate glass coverslip | Warner Instruments | 64-0709 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 | |
| Confocal microscope software Leica Application Suite | Leica | 2.7.3.9723 | |
| Creatine Phosphokinase | Sigma-Aldrich | C3755 | |
| DeconvolutionLab2 (DeconvolutionLab_2.jar) | Biomedical Imaging Group, EPFL | http://bigwww.epfl.ch/deconvolution/deconvolutionlab2/ | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DL-Aspartic acid potassium sat hemihydrate | Sigma-Aldrich | 11240 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N´N´-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Forceps | Miltex | MH-18 | |
| HC PL APO 20x/ 0.7 IMM objective | Leica | 506517 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Iris scissors | Miltex | 5-304 | |
| L-(-)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M7397 | |
| L-glutamic acid monosodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Maxchelator | UC Davis Health | https://somapp.ucdmc.ucdavis.edu/pharmacology/bers/maxchelator/downloads.htm | |
| Micro scissors | Miltex | 18-1633 | |
| Open-source platform for biological-image analysis Fiji | Public, maintained by Eliceiri/LOCI group, Jug group, and Tomancak lab.Fiji | https://fiji.sc/ | |
| Phosphocreatine disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| PSF Generator (PSF_Generator.jar) | Biomedical Imaging Group, EPFL | http://bigwww.epfl.ch/algorithms/psfgenerator/ | |
| Recording chamber | Warner Instruments | RC-27N | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Spreadsheet Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 508 | |
| Tetramethylrhodamine, ethyl ester | Invitrogen | T669 |
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