JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Biyofilm Enfeksiyonu ve Görünmez Yaraların Domuz Modeli

Published: June 16, 2023
doi:
10.3791/65301
, , , , , ,
1Indiana Center for Regenerative Medicine & Engineering, Indiana University Health Comprehensive Wound Center, Department of Surgery,Indiana University School of Medicine

Summary

Antibiyotiklere dirençli kronik yaralar sağlık sistemi için büyük bir tehdittir. Biyofilm enfeksiyonları inatçı ve düşmancadır ve fonksiyonel yara kapanmasının yetersiz olmasına neden olabilir. Biyofilm ile enfekte tam kat kronik yaraların klinik olarak anlamlı bir domuz modelini sunuyoruz. Bu model, mekanik çalışmalar için olduğu kadar müdahaleleri test etmek için de güçlüdür.

Abstract

Biyofilm enfeksiyonu, yara kronikliğine önemli bir katkıda bulunur. Klinik olarak anlamlı deneysel yara biyofilm enfeksiyonunun oluşturulması, konakçı bağışıklık sisteminin katılımını gerektirir. Bu tür klinik olarak anlamlı biyofilmin oluşumu sırasında konakçı ve patojendeki yinelemeli değişiklikler sadece in vivo olarak meydana gelebilir. Domuz yarası modeli, güçlü bir klinik öncesi model olarak avantajları ile tanınmaktadır. Yara biyofilmlerini incelemek için bildirilen birkaç yaklaşım vardır. İn vitro ve ex vivo sistemlerde konak immün yanıtı açısından yetersizdir. Kısa süreli in vivo çalışmalar akut yanıtları içerir ve bu nedenle klinik olarak bilindiği gibi biyofilm olgunlaşmasına izin vermez. İlk uzun süreli domuz yarası biyofilm çalışması 2014 yılında rapor edilmiştir. Çalışma, biyofilm ile enfekte olmuş yaraların planimetri ile belirlendiği gibi kapanabileceğini, ancak etkilenen bölgenin cilt bariyeri işlevinin geri yüklenemeyebileceğini kabul etti. Daha sonra bu gözlem klinik olarak doğrulandı. Fonksiyonel yara kapanması kavramı böylece doğdu. Kapalı ancak cilt bariyer fonksiyonunda eksik olan yaralar gözle görülmeyen yaralar olarak görülebilir. Bu çalışmada, klinik olarak anlamlı ve translasyonel değeri olan biyofilm ile enfekte ciddi yanık yaralanmasının uzun vadeli domuz modelini yeniden üretmek için gerekli metodolojik ayrıntıları bildirmeye çalışıyoruz. Bu protokol, P. aeruginosa (PA01) kullanılarak 8 haftalık bir yara biyofilm enfeksiyonu oluşturma konusunda ayrıntılı rehberlik sağlar. Yanıktan sonraki 3. günde (PA01) ile aşılanan evcil beyaz domuzların sırtında simetrik olarak sekiz tam kalınlıkta yanık yarası oluşturuldu; daha sonra, lazer benek görüntüleme (LSI), yüksek çözünürlüklü ultrason (HUSD) ve transepidermal su kaybı (TEWL) kullanılarak farklı zaman noktalarında yara iyileşmesinin invaziv olmayan değerlendirmeleri yapıldı. Aşılanan yanık yaraları dört katlı bir pansuman ile kapatıldı. Biyofilmler, aşılamadan sonraki 7. günde SEM tarafından yapısal olarak belirlendiği ve onaylandığı gibi, fonksiyonel yara kapanmasını tehlikeye attı. Böyle olumsuz bir sonuç, uygun müdahalelere yanıt olarak tersine çevrilebilir.

Introduction

Biyofilm enfeksiyonu yanık ve kronik yaraları komplike hale getirir ve kronikleşmeye neden olur 1,2,3,4,5. Mikrobiyolojide, biyofilm mekanizmaları öncelikle mikroplara odaklanarak incelenir 1,6. Bu çalışmalardan öğrenilen dersler biyolojik bilim açısından büyük önem taşımaktadır, ancak klinik olarak ilgili patojenik biyofilmleremutlaka uygulanamayabilir 6,7,8. Klinik olarak anlamlı biyofilm yapısal agregaları, mikrobiyal ve konakçı faktörleriiçermelidir 8,9,10. Böyle bir mikro ortam, klinik olarak anlamlı bir biyofilm 7,8 geliştirmek için kritik olan konakçı-mikrop yinelemeli etkileşimlerinin dahil edilmesine izin verir. Böyle bir süreçte bağışıklık hücrelerinin ve kan yoluyla bulaşan faktörlerin katılımı kritik öneme sahiptir11,12. Kronik yaralarda görüldüğü gibi, klinik patojenik biyofilmlerin altında yatan konak-mikrop etkileşimleri uzun bir süre boyunca ortaya çıkar. Bu nedenle, translasyonel olarak ilgili bir biyofilm enfeksiyonu modeli geliştirmeyi amaçlayan herhangi bir deneysel yaklaşım, bu faktörleri hesaba katmalıdır. Bu nedenle, klinik olarak tekrarlanabilir bir domuz kronik biyofilm enfeksiyonu modeli geliştirmeye çalıştık.

İnsan çalışmaları, iyileşme sonuçlarını incelemek için en iyi yaklaşımı açıkça temsil etse de, çoğu zaman altta yatan mekanizmaları ve yeni mekanik paradigmaları ele almak için en uygun değildir. Etik kaygılar, farklı zaman noktalarında kronik bir yaradan birden fazla biyopsi toplanmasını gerektiren çalışma tasarımlarının kullanımını sınırlar. Bu nedenle, biyofilm kaderinin kapsamlı bir şekilde incelenmesi için invaziv çalışmalara olanak sağlamak için köklü ve tekrarlanabilir bir hayvan modeline sahip olmak çok önemlidir 7,13. Bir hayvan modelinin seçimi, bilimsel/translasyonel uygunluk ve lojistik dahil olmak üzere çeşitli faktörlere bağlıdır. Domuz sistemi, insan derisi yaralarını incelemek için translasyonel olarak en değerli deneysel model olarak kabul edilmektedir7. Bu nedenle, bu çalışma, biyofilm ile enfekte olmuş tam kalınlıkta yanık yaralanmasının yerleşik bir domuz modelini bildirmektedir. Bu çalışma,literatürde bildirilen çeşitli orijinal yayınlara dayanmaktadır 2,7,13,14,15,16,17. Bu çalışmada, yarayı enfekte etmek için çoklu ilaca dirençli Pseudomonas aeruginosa (PA01) klinik izolatı seçildi. P. aeruginosa, yara enfeksiyonlarının yaygın bir nedenidir 2,18,19,20. Bazı antibiyotiklere karşı direnci nedeniyle tedavisi zor olabilen Gram negatif bir bakteridir11,19,21. Şimdiye kadar bildirilen domuz biyofilm modellerinin hiçbiri 8 haftalık uzun süreli çalışmaları içermemiştir 22,23,24,25,26. Kronik yaralar 4 hafta veya daha uzun süre açık kalan yaralardır 14,27,28. Literatürde bildirilmiş başka bir kronik yara biyofilm modeli bulunmamaktadır. Bu çalışma, fonksiyonel yara kapanması kavramını ele almaktadır 2,7,13,15,17,29.

Protocol

Tüm hayvan çalışmaları, Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) #21147 tarafından onaylanan protokollere uygun olarak gerçekleştirildi. Çalışma, Indiana Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları Kaynak Merkezi’nde (LARC) gerçekleştirildi. Bu protokolde dişi bir evcil beyaz domuz (70-80 lb) kullandık. 1. Hayvan iklimlendirme Domuzların tesise gelmesinden sonra, iklimlendirme ve sosyal etkileşim için hayvanları en az 3 gün aynı odada ayrı ayrı barındırın. Domuzları dengeli bir diyetle besleyin. Ağırlığa göre beslenen miktara karar verin ve üreticinin tavsiyelerine uyun. Anestezi altındayken mide bulantısı, kusma ve mide sıvılarının aspirasyonunu önlemek için işlemden önce hayvanın 6-12 saat aç kaldığından emin olun. 2. Ameliyathane kurulumu Anestezi makinesini hazırlayın ve solunum devresi ile hazır olduğundan emin olun. Ameliyat odasını aşağıda açıklandığı gibi düzenleyin (Şekil 1A).Prosedür tablosunu steril bir örtü ile örtün ve termoregülasyona yardımcı olması için altına bir sirkülasyon su battaniyesi yerleştirin. İndüksiyon malzemeleri ve ameliyat hazırlık materyalleri içeren bir masa kurun. Brülör cihazları ve kontrol kutuları ile bir masa kurun. Görüntüleme ekipmanını kurun ve açık olduğundan emin olun. 3. Domuzun sedasyonu Domuzu 1 mL / 50 lb’lik bir dozda kas içi TKX (Telazol 4.4 mg / kg; ketamin 2.2 mg / kg; ksilazin 2.2 mg / kg) enjeksiyonu ile sakinleştirin. Domuzu prosedür odasında bir maske ile verilen% 1 -% 3 izofluran üzerinde tutun. (Preoperatif) analjezikleri IACUC protokolüne göre domuzlara uygulayın; bazı örnekler aşağıdaki gibidir: buprenorfin 0.3 mg/mL, 0.01-0.05 mg/kg IM; carprofen 50 mg/mL, 4 mg/kg IM veya SQ; Kulağın kulak kepçesine yerleştirilen fentanil transdermal 100 mcg / h; gabapentin 300 mg kapsül, 3-10 mg / kg PO.NOT: Tüm yanık ve biyopsi işlemleri için ameliyattan bir gün önce 1 doz gabapentin, işlem günü 1 doz karprofen verilecektir. Ana yakma prosedürü için bir fentanil bandı yerleştirilecek ve cerrahi hazırlık sırasında 1 tam doz buprenorfin verilecektir. 4. Anestezi indüksiyonu Kulağı en az üç kez dönüşümlü olarak% 2 klorheksidin ovma ve alkol ile sterilize edin. İntravenöz kateterde A 22-18 G 1’i marjinal kulak damarına yerleştirin ve kan akışını onaylayın. Kateteri salinle yıkayın ve kateteri cerrahi bantla sabitleyin (Şekil 1B). Maske aracılığıyla anestezinin solunmasıyla kas gevşemesi sağlandıktan sonra domuzu uygun boyutta bir endotrakeal tüp (7-9 mm) ile entübe edin. Çene tonusu kaybı ve palpebral refleks gözlenerek kas gevşemesini kontrol edin.Tüpü açın ve bir şırınga kullanarak manşet sızıntısını test edin. Tüpü bir laringoskop30 yardımıyla yerleştirin. Manşeti şişirin ve uygun yerleştirme onaylandıktan sonra tüpü sabitleyin. Domuzu yeniden solunum devresine bağlayın.NOT: Tüp burnun üzerine yerine bağlanır ve sabitlemek için rulo gazlı bez kullanılır. Göğsün oskültasyonu, tüpün uygun şekilde yerleştirildiğini doğrulamak için bir stetoskop ile gerçekleştirilir.NOT: Anestezi sırasında, pozisyonel atelektaziyi önlemek için her 5-10 dakikada bir pop-off valfi kapatılarak ve basınç manometresi 20 mm/Hg’ye ulaşana kadar solunum torbasına bastırılarak hava verilir. Hayvanı ve anestezi derinliğini izleyin.Pig’i çok parametreli bir monitöre bağlayın. Monitör, oksijen doygunluğunu (SpO 2), nabız hızını, gelgit sonu karbondioksiti (EtCO2), solunum hızını ve sıcaklığı sürekli olarak okuyacaktır. Prosedür boyunca her 10 dakikada bir hayati değerleri kaydedin. Yaraya başlamadan önce ağrı reflekslerini arka bacak ayak parmağı tutamıyla test ederek anestezi derinliğini değerlendirin.NOT: Gerektiğinde, ek anestezi uygulamak için anestezik buharlaştırıcıyı ayarlayın veya birkaç dakika bekleyin. Ameliyat boyunca ağrı reflekslerini ve palpebral refleksleri düzenli olarak kontrol edin. 5. Yanık yaralanması için hayvan hazırlığı Domuzu anestezi makinesinden ayırın ve prosedür masasına taşıyın. Domuzu sternal yaslanma pozisyonuna getirin ve bağlı tüm hatları ve tüpleri sabitlediğinizden emin olun (Şekil 1C). Domuzu anestezi makinesine tekrar bağlayın veO2’yi 0.8-1.5 L / dk’da ve izofluranı prosedürün sonuna kadar% 1-3’te tutun. IV sıvıları (LRS) domuza 8-10 mL / kg / saat damlama hızında uygulayın. Anesteziyi adım 4.3’teki gibi izleyin. 6. Antiseptik preparat ve cilt yanık bölgesinin işaretlenmesi Tıraş ederek ve tüy dökücü kremi uygulayarak yara bölgesini aşağıda anlatıldığı gibi hazırlayın (Şekil 2).Domuz sırtını yaklaşık 25 cm genişliğinde bir alanda, vertebral kolondan her iki taraftaki koltuk altına kadar elektrikli makas kullanarak tıraş edin. Tüy dökücü kremi kırpılan bölgeye uygulayın ve 3-7 dakika bekletin. Temiz emici havlular kullanarak kremi saçla birlikte çıkarın. Yanık bölgesinin hazırlanmasıYaralanacak bölgeyi dönüşümlü olarak %2 klorheksidin ovma ve izopropil alkol ile yaklaşık 5 dakika boyunca en az üç kez ovalayın. Fırçalamanın steril eldiven giyen personel tarafından bullseye şeklinde (merkezden başlayıp spiral şeklinde dışa doğru hareket ederek) uygulandığından emin olun. Steril bir yanık şablonu ve cerrahi bir cilt işaretleyici kullanarak yara bölgelerini işaretleyin (Şekil 2B). Sırt üzerinde simetrik olarak altı ila sekiz yara (2 inç x 2 inç) işaretleyin. Kontaminasyonu azaltmak için işaretli alanların etrafındaki alanları steril bir örtü ile örtün (Şekil 2C). 7. Yanık yaralama prosedürü Metal bir kaleme bağlı 2 inç x 2 inç paslanmaz çelik bloktan (ağırlık: 352 g), elektronik bir mikro stat ve bir elektronik teraziden (toplam ağırlık: 1,714 g; Şekil 3).Brülörü istediğiniz sıcaklığa ayarlayın. Tam kalınlıktaki yaralar için hedef sıcaklığı 150 °C’de ayarlayın (Şekil 3A). Bunu yapmak için kontrol ünitesindeki ayar noktasını (SP) 150 °C’ye ayarlayın. Düşük ayar noktasını 145 °C’ye ve yüksek ayar noktasını 155 °C’ye ayarlayın (Şekil 1D). Yanık cihazına bağlı ısıtılmış paslanmaz çelik bloklar kullanarak ve bunları 60 saniye boyunca cilde yerleştirerek 2 inç x 2 inç tam kalınlıkta bir yanık yarası oluşturun (Şekil 3B, C). Yanığın uygulanması sırasında, brülör tarafından eşit basınç uygulandığından emin olmak için elektronik teraziyi kullanın. 8. Yanık yarası değerlendirmesi ve görüntüleme Dijital fotoğrafçılıkBir DSLR fotoğraf makinesi ve elektro odaklı kısa arka odak (EFS) 17-55 mm ultrasonik geniş açılı lens ve bir el feneri kullanarak yaraları görüntüleyin. Domuz kimliği, zaman noktası ve tarih içeren bir afiş de dahil olmak üzere tüm domuzun dijital bir fotoğrafını çekin. Ardından, her yara için domuz kimliği, yara kimliği ve zaman noktası ve bir cetvel içeren bir afiş gösteren ayrı ayrı resimler çekin. Yara alanını, 56. güne kadar her toplama zaman noktasında orijinal yara boyutunun yüzdesi olarak hesaplayın.NOT: Bu çalışmada, yara alanı her zaman noktasında (d0, d7, d14, d28 ve d56) d0’daki orijinal yara alanının yüzdesi olarak hesaplanmıştır. Lazer benek görüntüleme (LSI)Lazer benek görüntüleme için, yara mikrovasküler perfüzyonunu gerçek zamanlı olarak değerlendirmek için lazer benek kontrast analizi (LASCA) teknolojisine dayalı bir kan perfüzyon görüntüleyici kullanın. Tüm yaraların görüntülerini tek bir kayıtta alın. Lazer kameradan yaraya olan çalışma mesafesinin ölçülen değerini, her yaranın görüntülenmesi için tutarlı olacak şekilde ayarlayın (Şekil 4A). Perfüzyonu 10-15 s’lik bir süre boyunca çekilen bir dizi görüntü ile kaydedin. Bir yara görüntülendikten sonra, kayıt otomatik olarak duraklatılır ve kamera sonraki yara için ayarlandığında kayıt devam eder. Kayıt her durakladığında, yarayı tanımlamak için bir işaretleyici eklenir. Transepidermal su kaybı (TEWL)Standart bir ünite, bir TEWL probu ve yazılım kullanarak her yara için TEWL’yi ölçün (Şekil 4B). Her yara için, yara dokusu ile temas edecek şekilde prob ucunun üzerine temiz bir prob kapağı yerleştirin. Probu cilde nazikçe ve eşit bir şekilde yerleştirin ve ünite üzerindeki Başlat düğmesine basarak okumaya başlayın. Her yarayı önce merkezde ve sonra her köşede olmak üzere beş kez ölçün. Ardından, tüm okumaları bir elektronik tabloya aktarın (Şekil 4B). Harmonik ultrason (HUSD)Normal deriden başlayarak domuzun tekrar normal derinin olduğu lateral tarafına doğru orta hattan (vertebral kolon) yarayı bir ultrason (US) probu ile tarayarak HUSD haritalaması yapın. Ultrason makinesini kullanarak hem B modunda hem de doku elastografi modunda her yara için bu tarama modelini takip edin (Şekil 4C).B modu taraması için, yara bölgesine steril ultrason jeli uygulayın ve ML-615 yüksek çözünürlüklü proba biraz uygulayın. Her kayda yara tanımlama etiketiyle açıklama ekleyin. Kaydı başlatın ve probu diğer taraftaki normal cilde ulaşılana kadar orta hattan yaranın aşağısına doğru yavaşça hareket ettirin.NOT: Taramayı bitirdikten sonra, kayıt kaydedilir ve analiz için makineden dışa aktarılır. Elastografi için, Elasto düğmesine basarak ultrason makinesini elasto moduna geçirin. Yarayı B modu taramasında olduğu gibi tekrar tarayın ve elastografi renk göstergesinin (yeşil çubuklar) kayıt boyunca görünür kalmasını sağlamak için probun eşit basıncının korunduğundan emin olun.NOT: Uygun basınç, doğru temas yapıldığında yeşil görünen kayıt üzerindeki ölçek çubuğu ile belirlenebilir (Şekil 4D). Her yara hem B modunda hem de elasto modunda görüntülendikten sonra ek açıklamayı değiştirin (yara başına iki kayıt). Yazılımdaki yorumu bir sonraki yara için bilgileri içerecek şekilde değiştirin ve sonraki yaralar için işlemi tekrarlayın. 9. Bandajlama ve pansuman Yanık yaralarını şeffaf film pansumanları veya test pansumanı ile ayrı ayrı örtün (Şekil 5A, B). Tüm yara bölgesine daha büyük bir şeffaf film pansuman yerleştirin (Şekil 5C). Yaralardan gelen herhangi bir sıvı eksüdasını emmek için domuzun tüm gövdesinin etrafına gevşek bir şekilde ikinci bir rulo gazlı bez tabakası uygulayın. Bandaj malzemesini domuzun etrafına sarmak için domuzu yanından hafifçe sırtına doğru ileri geri yuvarlayın. Gazlı bezi bir esnek elastik bandaj tabakasıyla gevşek bir şekilde örtün (Şekil 5D). Bandajın çok sıkı olmadığından emin olun, çünkü çok sıkı uygulamak nefes almayı kısıtlayabilir ve karın üzerine baskı uygulayarak rektal prolapsusa veya farklı komplikasyonlara neden olabilir.NOT: Elastik bandaj esnektir ve uygulama sırasında kolayca aşırı sıkılabilir. Rulodan çekerek ve önceki sargının kenarına uzanmasına izin vermek, aşırı sıkmayı önlemeye yardımcı olabilir. Elastik bandajı elastik bantta 4’lük son bir tabaka ile örtün (Şekil 4E). Yine, uygulamanın çok sıkı olmadığından emin olun, ancak işlem sonrası domuz hareket ederken aşağı kaymasını önlemek için pansumanın üst ve alt kenardan sabitlendiğinden emin olun. 10. Hayvan kurtarma ve ameliyat sonrası bakım KurtarmaYaralama, görüntüleme prosedürü ve bandajlama tamamlandıktan sonra anestezik gazı bırakın. Domuzun en az 5 dakika oksijende kalmasına izin verin. Birincil muhafazaya döndükten sonra domuzu taşıma/kaldırma masasından kafesteki bir köpük geri kazanım matına taşıyın. Kurtarma sırasında domuzun yaralanmasını önlemek için otomatik suluğu kaldırın ve j-besleyiciyi çıkarın. Hipotermi varsa domuzu battaniyelerle (sıcak hava battaniyesi dahil) örtün. Her 10-15 dakikada bir sıcaklık, nabız, solunum hızı ve SpO2 dahil olmak üzere hayati değerleri izleyin ve kaydedin. Sternal yaslanmayı bağımsız olarak koruyabilene kadar domuzu sürekli olarak izleyin. Domuz tamamen iyileştiğinde, meme suluğunu indirin ve ardından domuz da beslenebilir. Ağrı değerlendirmesiModifiye edilmiş bir Glasgow ağrı skorlama formu kullanarak ameliyat sonrası ağrı değerlendirmesi yapın. Ağrı değerlendirmelerinin ameliyat sonrası ilk 3-4 gün boyunca en az 12 saatte bir laboratuvar veya LARC personeli tarafından tamamlandığından emin olun. Ağrı skorlamasının sıklığı ilgili veteriner hekim tarafından belirlenir. Hayvan 5’in üzerinde puan alırsa, kurtarma analjezisi (buprenorfin veya hidromorfon) uygulayın. İşlem öncesi 0.01-0.05 mg / kg IM doz buprenorfin uygulayarak analjezi sağlayın, ikinci bir doz 8-12 saat sonra verilir. Yanık yarasından önce kulağın kulak kepçesine bir fentanil bandı (100 mcg/s) yerleştirin. Prosedür öncesi carprofen 4 mg / kg IM veya SQ enjekte edin ve ardından 2 gün boyunca veya LARC veterinerinin önerdiği şekilde günde bir kez IM, SQ veya PO enjekte edin. Gabapentini oral olarak 3-10 mg / kg verin, işlemden bir gün önce, işlem sabahı, işlemden sonraki akşam ve daha sonra 3-5 gün boyunca her 12 saatte bir doz verilir. PerhizDomuzların iyileştiğinden emin olun ve ardından günde iki kez ağırlığa dayalı rasyonlarına göre su ve yiyeceğe serbest erişime izin verin. Yiyecekleri zenginleştirin (taze meyve ve sebzeler, dondurulmuş meyveler, marshmallowlar, yoğurt, puding vb.) sağlayın ve iştah azalması gözlenirse bunları yemeye teşvik etmek için kullanın. Pansuman değişimiBandajları haftada en az bir kez veya bandajlar kirlenirse veya tedavi stratejilerine uyum sağlamak için daha sık değiştirin. Hala anestezi altındayken görüntülemeden sonra bandajları değiştirin veya pansuman değişikliği için domuzu sadece TKX ile sakinleştirin. Bandajı değiştirmek için, pansumanın dışının yaralarla temas etmesine izin vermemeye dikkat ederek, Lister bandaj makası veya travma makası kullanarak kirli bandajı dikkatlice çıkararak başlayın. Gerekirse temiz gazlı bez üzerinde% 0.9 NaCl kullanarak yaraların etrafındaki alanı temizleyin ve bölgeyi nazikçe kurulayın. Bölüm 9’da özetlenen bandajlama prosedür adımlarını izleyin.NOT: Deneysel pansumanlar uygulanıyorsa, bunlar şeffaf film pansuman ile yaralar kapatılmadan önce uygulanabilir. Görüntüleme frekansıÇalışma boyunca çeşitli zaman noktalarında görüntüleme (dijital fotoğraflar, LSI, TEWL ve HUSD) elde edin. Aşılamadan sonra -3. gün (yanık yaralanması), 0. gün (aşılama) ve 7. gün, 14. gün, 28. gün, 35. gün ve 56. günde görüntüleme verilerini toplayın. 11. Biyofilm hazırlama ve aşılama Aşı hazırlamaSaf bir bakteri kültürü için Pseudomonas aeruginosa’nın (PA01) gliserol dondurucu stoğundan bir başlangıç plakası hazırlayın. Düşük tuzlu Luria-Bertani agarında (LBA) bir P. aeruginosa kültürü yetiştirin ve gece boyunca 37 ° C’de inkübe edin. Ertesi gün 5 mL düşük tuzlu Luria-Bertani suyunu (LBB) tek bir P. aeruginosa kolonisi ile aşılayın ve gece boyunca 37 ° C’de 200 rpm’de çalkalayarak inkübe edin. Log faz hücreleri elde etmek için, gece kültürünün 200 μL’sini 5 mL LBB’ye aşılayın ve çalkalayıcıda 2.5 saat boyunca 37 ° C’de 200 rpm’de inkübe edin. Bir spektrofotometre kullanarak optik yoğunluğu 600 nm’de (OD600) ölçün. 900 μL steril LBB’de kültürden 100 μL kullanarak 1 x 10−9’a kadar seri dilüsyonlar hazırlayın.NOT: Seyreltilmemiş örneklerle başladık ve 1 x 10 7 CFU/mL ile bitirdik.1 x 107 seyreltmede sayılabilir koloniler elde ettik, bu nedenle bu seyreltmeyi bitiş seyreltmesi olarak kabul ettik. Her seyreltmeden 100 μL’yi LBA’ya yayın ve gece boyunca 37 °C’de inkübe edin. Standart mikrobiyolojik protokollere göre, koloni sayımı için sayılabilir kolonileri (30-300) gösteren seyreltmeler kullanın ve koloni oluşturan birimleri (CFU) elde edin. Yaranın aşılanmasıGece kültüründen 200 μL’yi 5 mL LB et suyuna aşılayın ve çalkalayıcıda 37 °C’de 2,5 saat inkübe edin. Gündüz kültürünün optik yoğunluğunu 600 nm’de (OD600) ölçün. PA01 aşılaması için 3 x 10 8 CFU/mL kullanın (yara başına 250 μL 1 x 108 CFU/mL PA01 aşılanır). Aşıyı biyolojik tehlike içeren bir kapta hayvan tesisine taşıyın. Bir pipet kullanarak yanıktan sonraki 3. günde aşıyı açıkta kalan yaraların yüzeyine dağıtın ve tek kullanımlık bir yayıcı kullanarak eşit şekilde yayın (Şekil 6). Bandajlamadan önce yaraları yaklaşık 15 dakika açık tutun.NOT: Tüm cerrahi işlemler, aşılama, doku biyopsileri, görüntüleme ve bandajlama 3. ve 4. bölümlerde olduğu gibi genel anestezi altında yapılır. Enfeksiyon oluşumunun doğrulanmasıNOT: Aşılamayı takiben yaraların başarılı bir şekilde enfekte olduğunu doğrulamak için çeşitli yaklaşımlar kullanılır ve yara örnekleri normal deriden toplanan örneklerle karşılaştırılır; Aşağıda bazı örnekler verilmiştir.Farklı zaman noktalarında toplanan örneklerin patolojiye dayalı analizi için, bir enfeksiyonu tahmin etmek için koloni oluşturan birimlerin sayısını kullanın (CFU; Şekil 7E, F).Punch biyopsi ile 6 mm’lik yara dokusu toplayın. Boş 5 mL yuvarlak tabanlı tüpleri etiketleyin ve tartın. Numuneleri tüplere aktarın ve tüpleri numunelerle tartın. Dokuyu steril bir yüzeyde bir neşter ile doğrayın. Bir BSL2 davlumbazındaki tüm adımları gerçekleştirin.NOT: Dokuların kolayca homojenize edildiğinden emin olmak için boyut çok küçük olmalıdır (ancak 0,5 mm’den az olmamalıdır) Numuneyi tüpe koyun ve 1 mL PBS ekleyin. Sert doku öğütme probu kullanarak dokuyu karıştırın ve öğütün. Homojenatı seri olarak seyreltin (1 x 10−5’e seyreltilmemiş) ve seçici (Pseudomonas İzolasyon Agar, PIA) ve seçici olmayan (LBA) ortamda her seyreltmenin 50 μL’sini plakalayın. Tüm seyreltmeleri aerobik koşullar altında 37 °C’de 18-24 saat inkübe edin. Plakaları uygun aydınlatma koşullarıyla görüntüleyin. 30-300 kolonili plakaları seçin, plakaların hiçbiri bu konsantrasyona ulaşmadıysa, seyreltilmemiş plakayı kullanın. Koloni sayılarını saymak için ImageJ’yi kullanın ve ortalama değeri son seyreltme faktörü ile çarparak plaka başına CFU’yu hesaplayın. Bakteriyel biyofilmlerin varlığını doğrulamak için taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanarak aşılamadan sonraki 7. günden ve diğer zaman noktalarından toplanan örneklerden görüntüler elde edin (Şekil 7G).NOT: Biyofilm enfeksiyonunun oluştuğu ve US dalgalarının penetrasyonuna ve dolayısıyla daha derin dokuların görüntülenmesine izin veren yanık eskar yumuşamasının başladığı gün olduğu için aşılamadan sonraki 7. gün seçilmiştir. Şekil 4’te, ABD dalgalarının daha derin dokulara geçmesini engelleyen kalın kösele eskarı gösteren 3. gün ABD yanık yarası görüntüsünü kontrol edin. Yara biyopsilerinin bölümlerini P. aeruginosa’ya karşı spesifik antikorlarla boyayın, önceki bir yayında gösterildiği gibi spesifik bakterilerin varlığını doğrulamak için13 (Şekil 7H). Sinha ve ark.31’de yayınlandığı gibi yeni nesil dizileme (NGS) gerçekleştirin. Enfekte yaralardan bakteri 16srRNA’yı ve aşılamadan sonraki 7. günden başlayarak çalışmanın sonuna kadar farklı zaman noktalarında toplanan normal enfekte olmamış cilt örneklerini ölçün. 12. Biyopsi toplanması Aşılamadan sonraki 7. gün, 14. gün, 28. gün ve 56. günde görüntülemeyi takiben analiz için doku biyopsilerini toplayın. İyileşme sürecine müdahaleyi en aza indirmek için her yaradan yalnızca bir kez biyopsi toplayın.NOT: Tüm cerrahi işlemler, aşılama, doku biyopsileri, görüntüleme ve bandajlama 3. ve 4. bölümlerde olduğu gibi genel anestezi altında yapılır.Yaranın etrafındaki alana% 0.5 bupivakain ile sızın. Yaranın bir kenarından diğerine 3-4 mm genişliğinde bir şerit kesin, her iki tarafta da normal cildin küçük kenarlarını koruyarak, 10 numara bıçaklı tek kullanımlık bir neşter kullanın. Şeridi, sabitleme için% 4 tamponlu formalin ile doldurulmuş etiketli bir konik tüpe yerleştirin.NOT: Erken zaman noktası görüntüleme ve biyopsi prosedürleri için, cerrahi hazırlık sırasında tam doz buprenorfin verilecektir. Geç zaman noktası biyopsi prosedürleri için, cerrahi hazırlık sırasında yarım doz buprenorfin verilecektir. Tüm yanık ve biyopsi işlemlerinden sonra, gabapentin, ilgili veteriner hekimin önerdiği şekilde 7 güne kadar BID verilecektir. Carprofen, ameliyattan sonraki günler için veya ilgili veteriner hekimin önerdiği şekilde verilecektir. Yaradan 6 mm’lik bir punch biyopsisi kesin (yara yatağından veya yara kenarından). Farklı analiz türleri için normal cildin bir kısmı ve yara yatağı dahil olmak üzere yara kenarından toplayın. Sterilize edilmiş forseps ve diseksiyon makası kullanarak numuneyi çıkarın. Biyopsi örneğini işleme ve analiz için uygun tüpe veya kasete yerleştirin. CFU, SEM, RNA ve FPPE için numuneleri uygun bir tampon ile tüplerde saklayın. Örneğin, lazer yakalama mikroskobu (LCM) ve immünohistokimya (IHC) için kasetlerde örnekler OCT’ye yerleştirilebilir. Numuneler toplandıktan sonra yaraya steril bir gazlı bezle hafifçe bastırarak hemostaz elde edin. Yarayı yapışmayan pansuman ve bölüm 9’daki gibi bandajla örtün. 13. Ötenazi ve doku toplama Ötanazi gününde domuzu TKX ile sakinleştirin ve izofluran ile uyuşturun. Bölüm 3’te belirtilen adımları izleyerek marjinal kulak damarına intravenöz bir kateter yerleştirin. Bölüm 4’teki adımları izleyerek domuzu entübe edin. Domuz uyuşturulduktan sonra bandajı çıkarın ve yaraların etrafındaki alanı temizleyin. Eksiksiz dijital fotoğrafçılık, LSI, TEWL ve HUSD görüntüleme. Bölüm 12’de belirtilen adımları izleyerek yaralardan ve normal deriden örnekleri toplayın. Gerekli tüm numuneler toplandıktan sonra, ticari olarak temin edilebilen ötanazi çözeltisinin (sodyum pentobarbital) intravenöz enjeksiyonu yoluyla hala anestezi altındayken domuzu insancıl bir şekilde ötenazi yapın. Kalp atışının ve spontan solunumun durmasını doğrulamak için oskültasyon yapmak için bir stetoskop kullanın. Pnömotoraksı indüklemek için bir neşter kullanarak SOM IACUC’un gerektirdiği şekilde ikincil bir ötenazi yöntemi uygulayın. Domuz karkasını bir fıçıya aktarın ve yakmak üzere alınmak üzere dondurucuya taşıyın.

Representative Results

150 °C’de 1 dakika boyunca tam kat yanık yaraları oluşturmak için standart bir yanık cihazı kullanıldı, bu da homojen bir eritem ve inflamasyon marjı ile homojen bir derin yanık ile sonuçlandı (Şekil 3 ve Şekil 7). Her domuzun sırtında, Şekil 3C’de gösterildiği gibi sekiz tam kalınlıkta yanık yarası vardı. Yara derinliğini ve yara iyileşmesinin zaman içindeki ilerlemesini doğrulamak için yanık yaralarının B-mod yüksek çözünürlüklü ultrason ile non-invaziv gerçek zamanlı değerlendirmesi, deri altı yağa kadar tüm cilt katmanlarının tahrip olduğunu gösterdi (Şekil 4). Yara perfüzyonunun ileri karakterizasyonu için lazer benek görüntüleme (LSI) kullanıldı (Şekil 4A). Yanık yaraları, aşılamadan sonraki 7. günde yara yüzeyinde kalın bir piyojenik membran gösterdi, böylece enfeksiyonu ve yanık yarası biyofilminin oluşumunu doğruladı (Şekil 7A). Dijital planimetri, yara bölgesi ve kenarlarındaki inflamatuar yanıt nedeniyle PAO1 ile aşılamadan sonraki 3. günde artmış bir yara alanı gösterdi (Şekil 7A, B). Yara alanı aşılamadan sonraki 14. günde küçülmeye başlasa da, 56. günde orijinal yara boyutunun yaklaşık% 25’ine kadar eksik iyileşme gözlendi ve bu da yaraların kronikliğini gösterdi (Şekil 7B). Yara kronikliği ve bozulmuş yara iyileşmesi, yüksek transepidermal su kaybı gösteren TEWL ile daha da doğrulandı. TEWL sonuçları, ölçülen tüm zaman noktalarında normal cilde kıyasla cilt bariyeri fonksiyon kaybını yansıttı, böylece yanık yara iyileşmesinin fonksiyonel bozulmasını gösterdi (Şekil 7B). Bu aynı zamanda, sıkı bağlantı proteinleri ZO-1 ve 213’ün baskılanması ve görsel yara kapanmasına rağmen 35. günde (orta) ve 56. günde (geç) görülen yüksek TEWL değerlerinde yansıtıldığı gibi cilt bariyeri fonksiyonunun restorasyonunun bozulması ile de doğrulanmıştır (Şekil 7I). Yanık derinliği, Şekil 7C’de gösterildiği gibi, tüm histolojik cilt katmanlarının distorsiyonunu ve nekrozunu gösteren H & E boyaması ile daha da doğrulandı. PA01’in yerleşik biyofilmi, aşılamadan sonraki 7. günde CFU (Şekil 7E, F), SEM görüntüleme (Şekil 7G) ve immünofloresan boyama (Şekil 7H) ile daha da doğrulandı. Şekil 1: Prosedür için kurulum . (A) Ameliyat masası hazırlığı. (B) IV sıvılar için kulak damarı kanülasyonu ve ilaç uygulaması. (C) İşlem sırasında domuzu hipotermiden korumak için termal battaniye örtüsü. (D) Brülör ve zamanlayıcı ayarı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: Cerrahi alan sterilizasyonu ve işaretlemesi . (A) Saç kesme ve sterilizasyon. (B) Yanık bölgesinin steril sekiz yaralı standart şablon kullanılarak işaretlenmesi (her yara 2 inç x 2 inçtir). (C) Steril bir cilt işaretleyici kullanarak son işaretleme. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: Yanık yarası indüksiyonu. (A,B) Önceden işaretlenmiş yara bölgesine uygulanan bir basınç göstergesi ve otomatik kontrol ünitesi (2 inç x 2 inç) ile standartlaştırılmış brülör. (C) Sekiz tam kalınlıkta yanık yarasını gösteren sırtın tamamı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: Noninvaziv yanık yarası görüntüleme ve değerlendirmesi. (A) Lazer ışını göstergesinin yaranın merkezine uygun şekilde yönlendirildiği lazer benek görüntüleme (LSI) sol taraftaki resimde gösterilmektedir; sağdaki resimde LSI cihazı ve gerçek zamanlı cilt vasküler perfüzyon haritası gösterilmektedir. (B) Yara bölgesine beş farklı noktada (dört yara köşesi ve sağ alt köşe resimde gösterilen merkez) transepidermal su kaybı (TEWL) probu uygulaması sol taraftaki resimde gösterilmiştir; Sağ taraftaki görüntü, TEWL ölçümünün temsili gerçek zamanlı olarak yakalanmış bir ekranıdır. (C) Sol tarafta yüksek çözünürlüklü 16 MHz ultrason probu kullanılarak yanık yarasının harmonik ultrason taraması gösterilir; Sağdaki resim, ultrason cihazını ve gerçek zamanlı ekran kaydını gösterir. (D) Aşılama günü ve aşılamadan sonraki 7. günde yanık yarası bölgesinin yapısal (B-mod görüntüleri, gri tonlamalı ultrason) ve biyomekanik (elastografi, renkli ultrason) görüntüleri. Yara derinliği sarı kesikli çizgi ile gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 5: Yara pansumanı ve bandajlama . (A) Her yara için ayrı ayrı şeffaf film sargısı uygulanması. (B) Tüm dorsal aşılanmış yanık yaraları ilk pansuman tabakası ile kaplıdır. (C) Tüm yara bölgesine daha büyük bir şeffaf film sargısı yerleştirilir. (D) Yaralardan gelen herhangi bir sıvı eksüdasını emmek için domuzun tüm gövdesi boyunca ikinci kat gazlı bez ve gevşek bir esnek elastik bandaj tabakasının uygulanması. (E) Tüm yara bölgesinin yapışkan pansumanda son 4 kat ile kaplanması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 6: Bakteriyel aşılama . (A) Yanıktan sonraki 3. günde Pseudomonas aeruginosa (PA01) aşılaması için kurulum. (B) Her yara için 500 μL hacim kullanılarak bir pipet ile aşının topikal uygulaması. (C) Aşı, steril tek kullanımlık bir yayıcı kullanılarak yara yüzeyine eşit olarak dağıtılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 7: Yara iyileşmesinin ilerlemesi ve biyofilm onayı. (A) Çalışmanın zaman çizelgesi boyunca yara kapanışının temsili görüntüleri. Ölçek çubuğu = 1 cm. (B) Yara alanının kantitasyonu ve çalışmanın zaman çizelgesi boyunca TEWL ölçümleri (n = 6). Veriler ortalama ± SD. olarak temsil edilir. (C) Farklı yara biyopsi bölgelerini gösteren şematik diyagram. D. Yanıktan sonraki 3. günde ve aşılamadan sonraki 7. günde tüm cilt katmanlarında bozulma ve nekroz gösteren karşılık gelen Masson trikrom boyaması ile H&E boyama. Ölçek çubuğu = 500 μm. (E) Seçici olmayan agar (Luria-Bertani agar) ve seçici agarın (Pseudomonas İzolasyon Agar) domuz yara yatağı dokusundan yetiştirilen bakteri kolonileri ile temsili dijital görüntüleri. Seçici besiyeri, yalnızca PA01 kolonilerinin doğru sayımını sağlar. (F) Aşılama sonrası 7. gün işlenen yara biyopsilerinden alınan koloni sayımlarından bir örnek koloni oluşturan birim (CFU) hesaplaması gösterilmektedir. (G) Aşılamadan sonraki 7. günde aşılanmış yanık yaralarının temsili taramalı elektron mikroskobu (SEM) görüntüleri, sağ tarafta yakınlaştırılmış bir görüntü ile yerleşik PA01 biyofilmini gösterir. Ölçek çubuğu = 1 μm. Kırmızı ok uçları hücre dışı polimerik maddelere (EPS) işaret eder. (H) Yanık yaraları üzerindeki P. aeruginosa, anti-Pseudomonas (yeşil) antikoru kullanılarak görüntülendi; Aşılama sonrası 7. günün immünofloresan görüntüleri, yara dokularının P. aeruginosa tarafından ağır kolonizasyonunu göstermektedir. Ölçek çubuğu = 100 μm. (I) Temsili mozaik (ölçek çubuğu = 200 μm) ve aşılamadan sonraki 35. ve 56. günde ZO-1- ve ZO-2 ile boyanmış kesitlerin karşılık gelen yakınlaştırılmış (ölçek çubuğu = 50 μm) görüntüleri, indüklenen enfeksiyonu takiben proteinlerin ekspresyonunun azaldığını gösterir. OCT gömülü donmuş bölümler (10 μm), anti-ZO-1 (yeşil) veya anti-ZO-2 (yeşil) kullanılarak boyandı. Bölümler DAPI kullanılarak boyandı. Çubuk grafikler, ZO-1 ve ZO-2 sinyal yoğunluğunun niceliğini sunar. Veriler ortalama ± SD (n = 3) olarak sunulmuştur; * p < spontan olanlara göre 0.05'tir. Anlamlılığı test etmek için Mann-Whitney veya Kruskal-Wallis tek yönlü varyans analizi testleri yapılmıştır. Şekil 7H, I, Roy ve ark.13’ten değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Bu rapor, deneysel çalışmalar için kronik yara biyofilm enfeksiyonunun bir domuz modelinin oluşturulması için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Daha önce22,23,24,25,26 yıllarında birkaç domuz biyofilm modeli bildirilmiştir, ancak bunların hiçbiri 8 haftalık uzun süreli çalışmaları içeren domuz modelleri değildir. Kronik yaralar 4 hafta veya daha uzun süre açık kalan yaralardır 14,27,28. Literatürde bildirilmiş başka bir kronik yara biyofilm modeli bulunmamaktadır. Bu çalışma, fonksiyonel yara kapanması kavramını ele almaktadır 2,7,13,15,17,29. 2014 yılında yapılan bir çalışma, biyofilm ile enfekte olmuş yaraların bariyer fonksiyonu7 restorasyonu olmadan kapanabileceğini bildiren ilk çalışmadır. Bu çalışmada transepidermal su kaybı (TEWL) kullanılarak iyileşen yaradaki cilt bariyeri fonksiyonunun ölçümü bildirilmiştir.

Anatomik ve fizyolojik olarak, domuz derisi, diğer küçük hayvanların derisine kıyasla, insan derisine daha yakındır32,33,34. Hem domuz hem de insan derisi kalın bir epidermise sahiptir 33 ve dermal-epidermal kalınlık oranı domuzlarda 10:1 ila13:1 arasında değişir, bu da insanlarlakarşılaştırılabilir 34,35. Histolojik ve biyomekanik olarak, insan ve domuz derisi, rete-sırtlar, deri altı yağ, dermal kollajen, saç dağılımı, adneksiyal yapılar ve kan damarı boyutu ve dağılımı açısından benzerlikler gösterir36,37,38. İşlevsel olarak, hem domuzlar hem de insanlar, epidermal tabakanın lipit, protein ve keratin bileşenlerinin bileşiminde ve karşılaştırılabilir immünohistolojik modellerdebenzerlikler paylaşır 37,38. Domuz bağışıklık sistemi, diğer küçük hayvanlarınkiyle karşılaştırıldığında, insan bağışıklık sistemi ile daha yüksek benzerlikler paylaşır, yani domuzlar, yara enfeksiyonlarında patolojik biyofilmin karmaşıklıklarının ayrılmaz bir parçası olan konakçı etkileşimleri üzerine çalışmalar için uygun bir modeldir39. Çeşitli hayvan modelleri tarafından sunulan artıların ve eksilerin eleştirel değerlendirmesi, domuzların yara iyileşmesini incelemek için etkili bir model olduğu konusunda fikir birliğine yol açmıştır34,38. Ek olarak, evcil domuzlar, insanlarda gözlemlendiği gibi kendiliğinden kronik bakteriyel enfeksiyonlar geliştirir10. Yaraları oluşturmak için kullanılan yanık cihazı, hedeflenen cilt bölgesinden22,40 okunan bir sıcaklığa dayalı olarak ısı enerjisi sağlayan gelişmiş ve otomatik bir yanık cihazıdır. Böyle bir yaklaşım, yanık yaralanmasının titizliğini ve tekrarlanabilirliğini artırır. Domuz yaralarını enfekte etmek için insan klinik bakteri izolatlarının kullanılması, klinik öncesi bir model olarak değer katmaktadır.

Yanık yaralanmaları karmaşıktır ve çeşitli sistemik bozulmalara neden olur20,41. Bu nedenle, domuzu yeterli sıvılarla canlandırmak ve anestezi ve iyileşme sırasında hipotermiyi önlemek önemlidir. Yanık sonrası beslenme, sıvılar ve ağrı dahil olmak üzere çeşitli faktörler yara iyileşmesini engelleyebilir42. Bu nedenle beslenme ve ağrı değerlendirmelerinin yakından izlenmesi önemlidir. Yanma sonrası ağrı şiddetli olabilir ve hayvanın davranışını ve diyetini etkileyebilir. Davranışsal kaygıları ele almak için müdahaleler aktif olarak düşünülmelidir. Düzenli ve sürekli ağrı skorlaması ve yönetimi şarttır. Bu protokolde çok ayrıntılı bir ağrı yönetim planı içeren kapsamlı bir ağrı değerlendirme sayfası yer almaktadır. Yaralar arasında çapraz bulaşmayı önlemek için, pansumanın ilk katının her yaraya ayrı ayrı uygulanmasına özel dikkat gösterilmelidir. Tüm biyolojik olarak tehlikeli maddelerin taşınmasında ve ekipmanın, aletlerin ve tüm ameliyathanenin kapsamlı dezenfeksiyonunu gerçekleştirirken kritik özen gösterilmelidir. Pansumanın birden fazla katmanının uygulanması, domuzun kaşıntıyı ovalama veya kaşıma çabası sırasında yaraları açığa çıkarmasını önler.

Mevcut modeldeki domuz, altta yatan metabolik bozukluklardan (örneğin diyabet) ödün vermedi ve bu nedenle, incelenen etki tamamen bakteriyel biyofilm enfeksiyonunun yara iyileşmesi üzerindeki etkisiydi. Bununla birlikte, model diyabetin indüksiyonuna (örneğin streptozotosin kullanarak) uygundur ve altta yatan bir metabolik bozuklukla ilgili olarak biyofilm enfeksiyonunu incelemek için kullanılabilir. Modelin diğer sınırlaması, bir bakteri olan P. aeruginosa kullanılarak kontrollü enfeksiyon ortamıdır. Domuzun normal deri mikro florasının da yarada büyümesi ve iyileşmeyi etkilemesi beklenir. Yaranın mikrobiyal içeriğini tanımlamak için NGS veya diğer gelişmiş teknikler kullanılarak daha fazla analiz gereklidir. Mevcut model, farklı mikrobiyal türlere (örneğin, mantar, viral, vb.) sahip karışık enfeksiyonlara da uygulanabilir. Bu önemli bir unsurdur, çünkü klinik olarak ilgili yaraların, yara iyileşmesini farklı şekilde etkileyebilecek karışık mikroplar tarafından doldurulması muhtemeldir.

Bu modelde, insan kronik yaralarının karmaşıklığına ve uzun vadeli sekellerine benzerlik, otomatik ve tekrarlanabilir yanma süreci ve klinik olarak izole edilmiş bakteri türlerinin kullanımı dahil olmak üzere birçok potansiyel avantaj vardır. Çoklu non-invaziv görüntüleme yöntemlerinin kullanımı, yarayı karakterize eden yararlı fizyolojik verilerin toplanması için güçlü bir yaklaşımı temsil eder. Son olarak, TEWL’ye dayalı cilt bariyeri fonksiyonunun restorasyonu yoluyla fonksiyonel yara iyileşmesinin değerlendirilmesi kritik öneme sahiptir. Sonuç olarak, bu çalışmada bir domuz model sistemi kullanarak biyofilm ile enfekte ciddi yanık yaralanması geliştirmek için sağlam, basit, ayrıntılı ve kullanımı kolay bir protokol gösterilmiştir.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Indiana Üniversitesi, Laboratuvar Hayvanları Kaynak Merkezi’ne (LARC), destekleri ve çalışma sırasında hayvanların veteriner bakımı için teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri hibeleri NR015676, NR013898 ve DK125835 ve Savunma Bakanlığı hibesi W81XWH-11-2-0142 tarafından desteklenmiştir. Ek olarak, bu çalışma aşağıdaki Ulusal Sağlık Enstitüleri ödüllerinden yararlandı: GM077185, GM069589, DK076566, AI097511 ve NS42617.

Materials

Sedation
Ketamine Zoetis 10004027 100mg/ml
Telazol Zoetis 106-111 100mg/ml
Xylazine Pivetal 04606-6750-02 100mg/ml Anased
3ml syringe w/ 20g needle Covidien-Monoject 8881513033
Winged infusion set 21g Jorgensen Labs J0454B
Anesthetic
Isoflurane Pivetal 21295097
Surgery
Hair clippers Wahl 8787-450A
Nair Church and Dwight Co. Inc 70506572
Chlorhexidine Solution First Priority Inc. 179925722
70% Isopropyl Alcohol Uline S-17474
0.9% Saline Solution ICU Medical  RL-7282
Non-woven gauze Pivetal 21295051
Paper tape McKesson 455531
2" Elastic tape Pivetal 21300869
18-22g Intravenous Angiocath SurVet (01)14806017512306
Spay hook Jorgensen Labs J0112A
Sterile lube McKesson 16-8942
Laryngoscope Jorgensen Labs J0449S
Roll gauze Pivetal 21295032
Endotracheal tube (7-9mm) Covidien 86112 Shiley Hi-Lo Oral Nasal Tracheal Tube Cuffed
15gtt/ml IV administration set ICU Medical 12672-28
LRS 1000ml bag ICU Medical 07953-09
Three Quarter Drape Sheet McKesson 16-i80-12110G
Analgesia
Buprenorphine RX Generics 42023-0179-05 0.3mg/ml
Fentanyl Transdermal
Carprofen 21294548 Pivetal 50mg/ml Levafen
Bandaging
Transparent film dressing 26×30 Genadyne Biotechnologies A4-S00F5
Film dressing 4 x 4-3/4 Frame Style McKesson 886408
Vetrap 3M 1410BK BULK
Elastic tape 4" Pivetal 21300931
Kerlix Roll Gauze Cardinal Health 3324
Imaging
Canon EOS 80D Canon 1263C004
Speedlight 600EX II-RT Canon 1177C002
EFS 17-55mm Ultrasonic Canon 1242B002
GE Logiq E9 GE 5197104-2
ML6-15 Probe GE 5199103
PeriCamPSI Perimed 90-00070
DermaLab Cortex Technologies Inc 4608D78
Biopsy/Tissue Collection
6mm punch biopsy Integra Lifesciences 33-36
bupivicaine 0.5% Auromedics Pharma 55150017030
Size 10 Disposable Scalpel McKesson 16-63810
Dissection scissors Pivetal 21294806
Rat tooth thumb tissue forceps Aesculap BD512R
Non-adherent Dressing Covidien 2132 Telfa
50ml Conical tube Falcon 352070
Eppendorf/microcentrifuge tube Fisherbrand 02-681-320
OCT Cassette
Non Woven Gauze 4×4 Pivetal 21295051
Inoculum
Low salt LB agar Invitrogen 22700-025
Low salt LB broth Fisher scientific BP1427-500
Petri plate Falcon REF-351029
Polyprophyline round bottom tubes (14 ml) Falcon REF-352059
Pseudomonas Agar Base (Dehydrated) Thermo Scientific OXCM0559B
LB Agar, powder (Lennox L agar) Thermo Fisher Scientific (Life Technologies) 22700025
Gibco™ DPBS, calcium, magnesium Gibco 14040133
Euthanasia
18-22g Intravenous Angiocath SurVet (01)14806017512306
Fatal Plus Vortech Pharmaceuticals 9373
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goodwine, J., et al. Pyruvate-depleting conditions induce biofilm dispersion and enhance the efficacy of antibiotics in killing biofilms in vitro and in vivo. Scientific Reports. 9 (1), 3763 (2019).
  2. Sen, C. K., Roy, S., Mathew-Steiner, S. S., Gordillo, G. M. Biofilm management in wound care. Plastic and Reconstructive Surgery. 148 (2), 275-288 (2021).
  3. Church, D., Elsayed, S., Reid, O., Winston, B., Lindsay, R. Burn wound infections. Clinical Microbiology Reviews. 19 (2), 403-434 (2006).
  4. Nguyen, T. T., Gilpin, D. A., Meyer, N. A., Herndon, D. N. Current treatment of severely burned patients. Annals of Surgery. 223 (1), 14-25 (1996).
  5. Eriksson, E., et al. Chronic wounds: Treatment consensus. Wound Repair and Regeneration. 30 (2), 156-171 (2022).
  6. Lebeaux, D., Chauhan, A., Rendueles, O., Beloin, C. From in vitro to in vivo models of bacterial biofilm-related infections. Pathogens. 2 (2), 288-356 (2013).
  7. Ganesh, K., et al. Chronic wound biofilm model. Advances in Wound Care. 4 (7), 382-388 (2015).
  8. Bjarnsholt, T., et al. The in vivo biofilm. Trends in Microbiology. 21 (9), 466-474 (2013).
  9. Stewart, P. S. Biophysics of biofilm infection. Pathogens and Disease. 70 (3), 212-218 (2014).
  10. Jensen, L. K., Johansen, A. S. B., Jensen, H. E. Porcine models of biofilm infections with focus on pathomorphology. Frontiers in Microbiology. 8, 1961 (2017).
  11. Mah, T. F., O’Toole, G. A. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends in Microbiology. 9 (1), 34-39 (2001).
  12. Gonzalez, J. F., Hahn, M. M., Gunn, J. S. Chronic biofilm-based infections: Skewing of the immune response. Pathogens and Disease. 76 (3), 023 (2018).
  13. Roy, S., et al. Mixed-species biofilm compromises wound healing by disrupting epidermal barrier function. Journal of Pathology. 233 (4), 331-343 (2014).
  14. Sen, C. K. Human wound and its burden: Updated 2020. Compendium of Estimates. Advances in Wound Care. 10 (5), 281-292 (2021).
  15. Barki, K. G., et al. Electric field based dressing disrupts mixed-species bacterial biofilm infection and restores functional wound healing. Annals of Surgery. 269 (4), 756-766 (2019).
  16. Dusane, D. H., et al. Electroceutical treatment of Pseudomonas aeruginosa biofilms. Scientific Reports. 9 (1), 2008 (2019).
  17. Roy, S., et al. Staphylococcus aureus biofilm infection compromises wound healing by causing deficiencies in granulation tissue collagen. Annals of Surgery. 271 (6), 1174-1185 (2020).
  18. Ghanbari, A., et al. Inoculation density and nutrient level determine the formation of mushroom-shaped structures in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Scientific Reports. 6, 32097 (2016).
  19. Yin, R., Cheng, J., Wang, J., Li, P., Lin, J. Treatment of Pseudomonas aeruginosa infectious biofilms: Challenges and strategies. Frontiers in Microbiology. 13, 955286 (2022).
  20. Norbury, W., Herndon, D. N., Tanksley, J., Jeschke, M. G., Finnerty, C. Infection in burns. Surgical Infections. 17 (2), 250-255 (2016).
  21. Nitz, F., et al. Molecular detection of drug-resistance genes of bla(OXA-23)-bla(OXA-51) and mcr-1 in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa. Microorganisms. 9 (4), 786 (2021).
  22. Davis, S. C., et al. Microscopic and physiologic evidence for biofilm-associated wound colonization in vivo. Wound Repair and Regeneration. 16 (1), 23-29 (2008).
  23. Breuing, K., Kaplan, S., Liu, P., Onderdonk, A. B., Eriksson, E. Wound fluid bacterial levels exceed tissue bacterial counts in controlled porcine partial-thickness burn infections. Plastic and Reconstructive Surgery. 111 (2), 781-788 (2003).
  24. Nusbaum, A. G., et al. Effective method to remove wound bacteria: Comparison of various debridement modalities in an in vivo porcine model. Journal of Surgical Research. 176 (2), 701-707 (2012).
  25. Hirsch, T., et al. Enhanced susceptibility to infections in a diabetic wound healing model. BMC Surgery. 8, 5 (2008).
  26. Roche, E. D., et al. Increasing the presence of biofilm and healing delay in a porcine model of MRSA-infected wounds. Wound Repair and Regeneration. 20 (4), 537-543 (2012).
  27. Hartoch, R. S., McManus, J. G., Knapp, S., Buettner, M. F. Emergency management of chronic wounds. Emergency Medical Clinics of North America. 25 (1), 203-221 (2007).
  28. Mustoe, T. Understanding chronic wounds: a unifying hypothesis on their pathogenesis and implications for therapy. American Journal of Surgery. 187 (5), 65-70 (2004).
  29. Bhattacharya, M., et al. Staphylococcus aureus biofilms release leukocidins to elicit extracellular trap formation and evade neutrophil-mediated killing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (28), 7416-7421 (2018).
  30. Chum, H., Pacharinsak, C. Endotracheal intubation in swine. Lab Animal. 41 (11), 309-311 (2012).
  31. Sinha, M., et al. Pseudomonas aeruginosa theft biofilm require host lipids of cutaneous wound. Annals of Surgery. 277 (3), e634-e647 (2023).
  32. Fan, G. Y., et al. Severe burn injury in a swine model for clinical dressing assessment. Journal of Visualized Experiments. (141), e57942 (2018).
  33. Sullivan, T. P., Eaglstein, W. H., Davis, S. C., Mertz, P. The pig as a model for human wound healing. Wound Repair and Regeneration. 9 (2), 66-76 (2001).
  34. Meyer, W., Schwarz, R., Neurand, K. The skin of domestic mammals as a model for the human skin, with special reference to the domestic pig. Current Problems in Dermatology. 7, 39-52 (1978).
  35. Vardaxis, N. J., Brans, T. A., Boon, M. E., Kreis, R. W., Marres, L. M. Confocal laser scanning microscopy of porcine skin: implications for human wound healing studies. Journal of Anatomy. 190, 601-611 (1997).
  36. Heinrich, W., Lange, P. M., Stirtz, T., Iancu, C., Heidemann, E. Isolation and characterization of the large cyanogen bromide peptides from the alpha1- and alpha2-chains of pig skin collagen. FEBS Letters. 16 (1), 63-67 (1971).
  37. Marcarian, H. Q., Calhoun, M. L. Microscopic anatomy of the integument of adult swine. American Journal of Veterinary Research. 27 (118), 765-772 (1966).
  38. Sullivan, T. P., Eaglstein, W. H., Davis, S. C., Mertz, P. The pig as a model for human wound healing. Wound Repair and Regeneration. 9 (2), 66-76 (2001).
  39. Dawson, H. D., et al. Structural and functional annotation of the porcine immunome. BMC Genomics. 14, 332 (2013).
  40. Kim, J. Y., Dunham, D. M., Supp, D. M., Sen, C. K., Powell, H. M. Novel burn device for rapid, reproducible burn wound generation. Burns. 42 (2), 384-391 (2016).
  41. Nielson, C. B., Duethman, N. C., Howard, J. M., Moncure, M., Wood, J. G. Burns: Pathophysiology of systemic complications and current management. Journal of Burn Care and Research. 38 (1), e469-e481 (2017).
  42. Rowan, M. P., et al. Burn wound healing and treatment: Review and advancements. Critical Care. 19 (1), 243 (2015).

Tags

Swine ModelBiofilm InfectionWound ChronicityPreclinical ModelClinically Isolated PathogensWound Biofilm FormationHost-microbe InteractionsBiofilm AggregatesWound Barrier FunctionTransepidermal Water LossIn Vivo StudiesHost Immune ResponseBiofilm Maturation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
El Masry, M., Bhasme, P., Mathew-Steiner, S. S., Smith, J., Smeenge, T., Roy, S., Sen, C. K. Swine Model of Biofilm Infection and Invisible Wounds. J. Vis. Exp. (196), e65301, doi:10.3791/65301 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image