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Immunology and Infection

Modelo suíno de infecção por biofilme e feridas invisíveis

Published: June 16, 2023
doi:
10.3791/65301
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1Indiana Center for Regenerative Medicine & Engineering, Indiana University Health Comprehensive Wound Center, Department of Surgery,Indiana University School of Medicine

Summary

Feridas crônicas resistentes a antibióticos são uma grande ameaça ao sistema de saúde. As infecções por biofilme são teimosas e hostis e podem causar fechamento funcional deficiente da ferida. Relatamos um modelo suíno clinicamente relevante de feridas crônicas de espessura total infectadas por biofilme. Esse modelo é poderoso tanto para estudos mecanicistas quanto para testar intervenções.

Abstract

A infecção por biofilme é um dos principais contribuintes para a cronicidade da ferida. O estabelecimento de infecção por biofilme de ferida experimental clinicamente relevante requer o envolvimento do sistema imune do hospedeiro. Mudanças iterativas no hospedeiro e no patógeno durante a formação desse biofilme clinicamente relevante só podem ocorrer in vivo. O modelo de feridas em suínos é reconhecido por suas vantagens como um poderoso modelo pré-clínico. Existem várias abordagens relatadas para o estudo de biofilmes de feridas. Os sistemas in vitro e ex vivo são deficientes em termos de resposta imune do hospedeiro. Estudos in vivo de curta duração envolvem respostas agudas e, portanto, não permitem a maturação do biofilme, como se sabe clinicamente. O primeiro estudo de biofilme de ferida suína de longo prazo foi relatado em 2014. O estudo reconheceu que feridas infectadas por biofilme podem fechar conforme determinado pela planimetria, mas a função de barreira cutânea do local afetado pode não ser restaurada. Posteriormente, essa observação foi validada clinicamente. Nascia, assim, o conceito de fechamento funcional da ferida. Feridas fechadas, mas deficientes na função de barreira cutânea, podem ser vistas como feridas invisíveis. Neste trabalho, procuramos relatar os detalhes metodológicos necessários para reproduzir o modelo de longo prazo suíno de lesão grave por queimadura infectada por biofilme, que é clinicamente relevante e tem valor translacional. Este protocolo fornece orientações detalhadas sobre o estabelecimento de uma infecção de biofilme de ferida de 8 semanas usando P. aeruginosa (PA01). Oito queimaduras de espessura total foram criadas simetricamente no dorso de suínos brancos domésticos, que foram inoculados com (PA01) no 3º dia pós-queimadura; posteriormente, avaliações não invasivas da cicatrização de feridas foram realizadas em diferentes momentos usando laser speckle imaging (LSI), ultrassom de alta resolução (HUSD) e perda de água transepidérmica (TEWL). As queimaduras inoculadas foram cobertas com curativo em quatro camadas. Os biofilmes, estabelecidos e confirmados estruturalmente pela MEV aos 7 dias pós-inoculação, comprometeram o fechamento funcional da ferida. Tal resultado adverso está sujeito a reversão em resposta a intervenções apropriadas.

Introduction

A infecção por biofilme complica queimaduras e feridas crônicas e causa cronicidade 1,2,3,4,5. Em microbiologia, os mecanismos do biofilme são estudados primariamente, com foco nos micróbios 1,6. As lições aprendidas com esses estudos são de suma importância do ponto de vista das ciências biológicas, mas podem não ser necessariamente aplicáveis a biofilmes patogênicos clinicamente relevantes 6,7,8. Agregados estruturais de biofilme clinicamente relevantes devem incluir fatores microbianos e hospedeiros 8,9,10. Tal microambiente permite a inclusão de interações iterativas hospedeiro-micróbio, que são críticas para o desenvolvimento de um biofilme clinicamente relevante 7,8. Nesse processo, a participação de células imunes e fatores transmitidos pelo sangue é crítica11,12. As interações hospedeiro-micróbio subjacentes aos biofilmes patogênicos clínicos, como visto em feridas crônicas, ocorrem por um longo período de tempo. Assim, qualquer abordagem experimental que vise desenvolver um modelo translacionalmente relevante de infecção por biofilme deve levar em conta esses fatores. Assim, buscou-se desenvolver um modelo de infecção crônica por biofilme suíno clinicamente reprodutível.

Embora os estudos em humanos representem claramente a melhor abordagem para estudar os resultados da cura, muitas vezes eles não são mais adequados para abordar os mecanismos subjacentes e os novos paradigmas mecanicistas. Preocupações éticas limitam o uso de desenhos de estudo que exigem a coleta de múltiplas biópsias de uma ferida crônica em diferentes momentos. Portanto, é fundamental ter um modelo animal bem estabelecido e reprodutível que possibilite estudos invasivos para o exame minucioso do destino do biofilme 7,13. A seleção de um modelo animal depende de vários fatores, incluindo relevância científica/translacional e logística. O sistema porcino é amplamente reconhecido como o modelo experimental de maior valor translacional para o estudo de feridas cutâneas humanas7. Assim, este trabalho relata um modelo estabelecido de suínos de lesão por queimadura de espessura total infectada por biofilme. Este trabalho baseia-se em diversas publicações originais relatadas na literatura2,7,13,14,15,16,17. Neste estudo, um isolado clínico de Pseudomonas aeruginosa multirresistente (PA01) foi escolhido para infectar a ferida. A P. aeruginosa é uma causa comum de infecções de feridas 2,18,19,20. É uma bactéria Gram-negativa de difícil tratamento devido à sua resistência a alguns antibióticos11,19,21. Nenhum dos modelos de biofilme suíno relatados até o momento envolveu estudos de longo prazo de 8 semanas 22,23,24,25,26. As feridas crônicas são aquelas que permanecem abertas por 4 semanas ou mais14,27,28. Não há outros modelos de biofilme de feridas crônicas relatados na literatura. Este trabalho aborda a noção de fechamento funcional da ferida 2,7,13,15,17,29.

Protocol

Todos os estudos em animais foram realizados de acordo com protocolos aprovados pela Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) #21147. O estudo foi realizado no Laboratory Animal Resource Center (LARC), da Universidade de Indiana. Neste protocolo, foi utilizada uma fêmea de porco branco doméstico (70-80 lb). 1. Aclimatação dos animais Após a chegada dos porcos ao estabelecimento, alojar os animais individualmente dentro do mesmo cômodo por pelo menos 3 dias para aclimatação e interação social. Alimente os porcos com uma dieta bem balanceada. Decida a quantidade alimentada com base no peso e siga as recomendações do fabricante. Certifique-se de que o animal esteja em jejum por 6-12 h antes do procedimento para evitar náuseas, vômitos e aspiração de líquidos estomacais enquanto estiver sob anestesia. 2. Configuração da sala de cirurgia Prepare o aparelho de anestesia e certifique-se de que está pronto com o circuito de reinalação. Organizar a sala para a cirurgia, conforme descrito abaixo (Figura 1A).Cubra a mesa de procedimentos com um campo estéril e coloque uma manta de água circulante por baixo para ajudar na termorregulação. Monte uma mesa com suprimentos de indução e materiais de preparação da cirurgia. Configure uma mesa com os dispositivos do gravador e as caixas de controle. Configure o equipamento de imagem e certifique-se de que ele está ligado. 3. Sedação do suíno Sedar o suíno com uma injeção intramuscular de TKX (Telazol 4,4 mg/kg; cetamina 2,2 mg/kg; xilazina 2,2 mg/kg) na dose de 1 mL/50 lb. Manter o porco na sala de procedimentos com isoflurano a 1%-3% administrado através de uma máscara. Administrar os analgésicos (pré-operatórios) aos suínos de acordo com o protocolo da IACUC; alguns exemplos são os seguintes: buprenorfina 0,3 mg/mL, 0,01-0,05 mg/kg IM; carprofeno 50 mg/mL, 4 mg/kg IM ou QS; fentanil transdérmico 100 mcg/h colocado no pavilhão auricular; gabapentina 300 mg cápsulas, 3-10 mg/kg via oral.NOTA: Para todos os procedimentos de queimadura e biópsia, 1 dose de gabapentina será administrada no dia anterior à cirurgia e 1 dose de carprofeno será administrada no dia do procedimento. Para o procedimento de queima principal, um adesivo de fentanil será colocado, e 1 dose completa de buprenorfina será administrada durante a preparação cirúrgica. 4. Indução anestésica Esterilizar a orelha com esfoliação alternada de clorexidina a 2% e álcool pelo menos três vezes. Inserir A 22-18 G 1 no cateter intravenoso na veia marginal da orelha e confirmar o fluxo sanguíneo. Lave o cateter com soro fisiológico e fixe-o com fita adesiva cirúrgica (Figura 1B). Intubar o porco com um tubo endotraqueal de tamanho adequado (7-9 mm) uma vez que o relaxamento muscular tenha sido alcançado pela inalação de anestesia através da máscara. Verificar o relaxamento muscular por uma perda do tônus mandibular e um reflexo palpebral sendo observado.Abra o tubo e teste o vazamento do manguito usando uma seringa de ar. Inserir o tubo com auxílio de laringoscópio30. Inflar o manguito e prender o tubo assim que a colocação adequada for confirmada. Conecte o porco ao circuito de reinalação.NOTA: O tubo é amarrado no lugar sobre o focinho, e gaze de rolo é usada para prendê-lo. A ausculta do tórax é realizada com um estetoscópio para confirmar o posicionamento adequado do tubo.NOTA: Durante a anestesia, o ar é fornecido a cada 5-10 min fechando a válvula pop-off e deprimindo a bolsa de reinalação até que o manômetro de pressão atinja 20 mm/Hg para evitar atelectasia posicional. Monitorar o animal e a profundidade da anestesia.Conecte o porco a um monitor multiparâmetro. O monitor irá ler continuamente a saturação de oxigênio (SpO 2), a taxa de pulso, o dióxido de carbono expirado final (EtCO2), a frequência respiratória e a temperatura. Registre os sinais vitais a cada 10 min durante todo o procedimento. Avalie a profundidade da anestesia testando os reflexos de dor com uma pinça do dedo do pé da perna traseira antes de iniciar a ferida.NOTA: Quando necessário, ajuste o vaporizador anestésico para administrar anestesia adicional ou aguarde alguns minutos. Verifique os reflexos de dor e reflexos palpebrais regularmente durante toda a cirurgia. 5. Preparação animal para queimaduras Desconecte o porco do aparelho de anestesia e mova-o para a mesa de procedimentos. Coloque o porco na posição de decúbito esternal e certifique-se de fixar todas as linhas e tubos conectados (Figura 1C). Reconectar o porco ao aparelho de anestesia e manter o O2 a 0,8-1,5 L/min e o isoflurano a 1%-3% até o final do procedimento. Administrar fluidos IV (LRS) ao porco a uma taxa de gotejamento de 8-10 mL/kg/h. Monitorar a anestesia como no passo 4.3. 6. Preparo antisséptico e marcação do local da queimadura na pele Prepare a área da ferida raspando e aplicando o creme depilatório, conforme descrito abaixo (Figura 2).Raspar o dorso do porco em uma área de aproximadamente 25 cm de largura da coluna vertebral até a axila de ambos os lados usando cortadores elétricos. Aplique o creme de depilação na área cortada e deixe descansar por 3-7 min. Retire o creme juntamente com o cabelo usando toalhas absorventes limpas. Preparo do local da queimaduraEsfregar a área a ser ferida com esfoliação alternada de clorexidina a 2% e álcool isopropílico a 70% pelo menos três vezes por aproximadamente 5 min. Certifique-se de que o esfoliante seja aplicado em um padrão bullseye (começando no centro e movendo-se para fora em uma espiral) pelo pessoal usando luvas estéreis. Marque os locais da ferida com molde estéril de queimadura e marcador cutâneo cirúrgico (Figura 2B). Marque de seis a oito feridas (2 pol x 2 pol) simetricamente no dorso. Cobrir as áreas ao redor dos locais marcados com um pano estéril para reduzir a contaminação (Figura 2C). 7. Procedimento de ferimento por queimadura Use um dispositivo de queimadura, como um queimador personalizado fabricado internamente que consiste em um bloco de aço inoxidável 2 em x 2 polegadas (peso: 352 g) conectado a uma caneta de metal, um microstat eletrônico e uma balança eletrônica (peso total: 1.714 g; Gráfico 3).Ajuste o queimador para a temperatura desejada. Ajustar a temperatura alvo para feridas de espessura total a 150 °C (Figura 3A). Para fazer isso, ajuste o set point (SP) na unidade de controle para 150 °C. Defina o setpoint baixo para 145 °C e o setpoint alto para 155 °C (Figura 1D). Crie uma ferida de queimadura de espessura total de 2 pol x 2 pol usando blocos de aço inoxidável aquecidos conectados ao dispositivo de queimadura e colocando-os sobre a pele por 60 s (Figura 3B, C). Durante a aplicação da queima, utilize a balança eletrônica para garantir que a pressão uniforme está sendo aplicada pelo queimador. 8. Avaliação da ferida de queimadura e exames de imagem Fotografia digitalImagem das feridas usando uma câmera DSLR e uma lente ultrassônica grande angular de foco curto (EFS) de foco curto (EFS) de 17-55 mm e uma lanterna. Tire uma foto digital de todo o porco de volta, incluindo um cartaz com a identificação do porco, ponto de hora e data. Em seguida, tire imagens para cada ferida separadamente mostrando um cartaz com o ID do porco, ID da ferida e ponto de tempo, e uma régua. Calcular a área da ferida como a porcentagem do tamanho original da ferida em cada momento da coleta até o dia 56.OBS: Neste trabalho, a área da ferida foi calculada em cada momento (d0, d7, d14, d28 e d56) como uma porcentagem da área original da ferida em d0. Imagem speckle a laser (LSI)Para imagens com laser speckle, use um imageador de perfusão sanguínea baseado na tecnologia de análise de contraste speckle laser (LASCA) para avaliar a perfusão microvascular da ferida em tempo real. Tire as imagens de todas as feridas em uma única gravação. Ajustar o valor medido da distância de trabalho da câmera laser à ferida para que seja consistente para a imagem de cada ferida (Figura 4A). Registre a perfusão por uma série de imagens tiradas em um período de 10-15 s. Depois que uma ferida é fotografada, a gravação é pausada automaticamente e a gravação é retomada assim que a câmera é ajustada para a ferida subsequente. Cada vez que a gravação pausa, um marcador é adicionado para identificar a ferida. Perda de água transepidérmica (TEWL)Meça o TEWL para cada ferida usando uma unidade padrão, uma sonda TEWL e um software (Figura 4B). Para cada ferida, coloque uma cobertura de sonda limpa sobre a ponta da sonda, que estará em contato com o tecido da ferida. Coloque a sonda suave e uniformemente sobre a pele e inicie a leitura pressionando o botão Iniciar na unidade. Meça cada ferida cinco vezes, primeiro no centro e depois em cada canto. Em seguida, exporte todas as leituras para uma planilha (Figura 4B). Ultrassom harmônico (HUSD)Realizar o mapeamento de HUSD escaneando a ferida com uma sonda de ultrassom (US) da linha média (coluna vertebral) a partir da pele normal em direção ao lado lateral do porco, onde há pele normal novamente. Siga este padrão de varredura para cada ferida no modo B e no modo de elastografia tecidual usando o aparelho de ultrassom (Figura 4C).Para a varredura em modo B, aplique gel de ultrassom estéril na área da ferida e aplique um pouco na sonda de alta resolução ML-615. Anote cada gravação com a etiqueta de identificação da ferida. Inicie a gravação e mova a sonda lentamente da linha média para baixo da ferida até que a pele normal do outro lado seja atingida.NOTA: Após concluir a digitalização, a gravação é salva e exportada da máquina para análise. Para elastografia, mude o aparelho de ultrassom para o modo elasto pressionando o botão Elasto . Digitalize a ferida novamente da mesma maneira que na varredura em modo B, garantindo que a pressão uniforme da sonda seja mantida para permitir que o indicador de cor da elastografia (barras verdes) permaneça visível durante toda a gravação.NOTA: A pressão apropriada pode ser determinada pela barra de escala na gravação, que aparece verde quando o contato correto está sendo feito (Figura 4D). Altere a anotação depois que cada ferida for visualizada nos modos B e elasto (duas gravações por ferida). Altere o comentário no software para incluir as informações da próxima ferida e repita o processo para as feridas subsequentes. 9. Enfaixamento e curativo Cobrir as queimaduras individualmente com curativo de filme transparente ou curativo teste (Figura 5A, B). Colocar um curativo de filme transparente maior sobre toda a área da ferida (Figura 5C). Aplique uma segunda camada de gaze de rolo frouxamente ao redor de todo o tronco do porco para absorver qualquer exsudato líquido que venha das feridas. Enrole o porco de lado para frente e para trás levemente de costas para envolver o material de enfaixamento ao redor do porco. Cubra a gaze frouxamente com uma camada de bandagem elástica flexível (Figura 5D). Certifique-se de que o curativo não seja muito apertado, pois aplicá-lo com muita força pode restringir a respiração e pressionar o abdômen, o que pode resultar em prolapso retal ou diferentes complicações.NOTA: A bandagem elástica é elástica e pode ser facilmente apertada durante a aplicação. Puxá-lo do rolo e deixá-lo deitado sobre a borda do envoltório anterior pode ajudar a evitar o aperto excessivo. Cobrir a bandagem elástica com uma camada final de 4 em fita elástica (Figura 4E). Novamente, certifique-se de que a aplicação não seja muito apertada, mas certifique-se de que o curativo esteja preso na borda superior e inferior para evitar que ele escorrege para baixo enquanto o porco se move após o procedimento. 10. Recuperação dos animais e cuidados pós-operatórios RecuperaçãoSuspender o gás anestésico após a conclusão da ferida, procedimento de imagem e enfaixamento. Deixe o porco permanecer com oxigênio por pelo menos 5 min. Mova o porco, depois de retornar ao recinto primário, da mesa de transporte/elevação para uma esteira de recuperação de espuma na gaiola. Levante o bebedouro automático e retire o j-feeder para evitar ferimentos no porco durante a recuperação. Cubra o porco com cobertores (incluindo uma manta de ar quente) se houver hipotermia. Monitore e registre os sinais vitais, incluindo a temperatura, pulso, taxa de respiração e SpO2 a cada 10-15 min. Monitorar continuamente o porco até que ele seja capaz de manter a decúbito esternal de forma independente. Uma vez que o porco está totalmente recuperado, abaixe o bebedouro do mamilo e, em seguida, o porco também pode ser alimentado. Avaliação da dorRealizar uma avaliação da dor pós-operatória usando um formulário modificado de pontuação de dor de Glasgow. Certifique-se de que as avaliações de dor sejam concluídas pela equipe do laboratório ou do LARC pelo menos a cada 12 h nos primeiros 3-4 dias de pós-operatório. A frequência da pontuação de dor é determinada pelo veterinário assistente. Se o animal pontuar acima de 5, administrar analgesia de resgate (buprenorfina ou hidromorfona). Fornecer analgesia administrando uma dose de buprenorfina 0,01-0,05 mg/kg IM pré-procedimento, com uma segunda dose administrada 8-12 h mais tarde. Coloque um adesivo de fentanil (100 mcg/h) no pavilhão auricular da orelha antes da queimadura. Injetar carprofeno 4 mg/kg IM ou SQ pré-procedimento e, em seguida, uma vez por dia IM, SQ ou PO por 2 dias ou conforme indicado pelo veterinário LARC. Dê gabapentina 3-10 mg/kg por via oral, com uma dose sendo administrada no dia anterior ao procedimento, na manhã do procedimento, na noite seguinte ao procedimento e, em seguida, a cada 12 h por 3-5 dias. DietaCertifique-se de que os porcos estão recuperados e, em seguida, permita o livre acesso à água e à comida de acordo com sua ração baseada no peso duas vezes ao dia. Fornecer enriquecimento de alimentos (frutas e vegetais frescos, frutas congeladas, marshmallows, iogurte, pudim, etc.), e usá-los para atrair a alimentação se uma diminuição do apetite for observada. Troca de curativosTroque os curativos pelo menos uma vez por semana ou mais vezes se os curativos ficarem sujos ou para acomodar estratégias de tratamento. Troque os curativos após exames de imagem ainda sob anestesia ou sedou o porco apenas com TKX para uma troca de curativo. Para substituir o curativo, comece removendo cuidadosamente o curativo sujo usando tesouras de bandagem Lister ou tesouras de trauma, estando atento para não permitir que a parte externa do curativo entre em contato com as feridas. Limpe a área ao redor das feridas, se necessário, usando NaCl a 0,9% em gaze limpa e seque a área suavemente. Siga as etapas de procedimento para enfaixamento descritas na seção 9.OBS: Se estiverem sendo aplicados curativos experimentais, estes poderão ser aplicados antes da cobertura das feridas com o curativo de filme transparente. Frequência de imagemObter imagens (fotos digitais, LSI, TEWL e HUSD) em vários momentos ao longo do estudo. Coletar dados de imagem no dia −3 (queimadura), dia 0 (inoculação) e dia 7, dia 14, dia 28, dia 35 e dia 56 pós-inoculação. 11. Preparação e inoculação de biofilmes Preparação do inóculoPrepare uma placa de partida a partir de um congelador de glicerol de Pseudomonas aeruginosa (PA01) para uma cultura pura da bactéria. Cultivar uma cultura de P. aeruginosa em ágar Luria−Bertani (LBA) com baixo teor de sal e incubar a 37 °C durante a noite. Inocular 5 mL de caldo Luria−Bertani (LBB) com uma única colônia de P. aeruginosa no dia seguinte e incubar durante a noite a 37 °C com agitação a 200 rpm. Para obter células em fase logarítmica, inocular 200 μL da cultura noturna em 5 mL de LBB e incubar no agitador a 200 rpm a 37 °C por 2,5 h. Medir a densidade óptica a 600 nm (OD600) usando um espectrofotômetro. Preparar diluições seriadas até 1 x 10−9 usando 100 μL da cultura em 900 μL de LBB estéril.NOTA: Iniciamos com amostras não diluídas e terminamos com 1 x 10 7 UFC/mL.Obtivemos colônias contáveis na diluição 1 x 107, então consideramos essa diluição como a diluição final. Espalhe 100 μL de cada diluição sobre LBA e incube durante a noite a 37 °C. De acordo com protocolos microbiológicos padrão, utilizar diluições mostrando colônias contáveis (30-300) para a contagem de colônias, e obter as unidades formadoras de colônias (UFC). Inoculação da feridaInocular 200 μL da cultura noturna em 5mL de caldo LB e incubar no agitador a 37 °C por 2,5 h. Medir a densidade óptica da cultura diurna a 600 nm (OD600). Para a inoculação de PA01, utilizar 3 x 10 8 UFC/mL (250 μL de 1 x 108 UFC/mL PA01 são inoculados por ferida). Transportar o inóculo para a instalação animal em um recipiente de risco biológico. Dispersar o inóculo por toda a superfície das feridas expostas no 3º dia pós-queimadura com pipeta e espalhar uniformemente com espalhador descartável (Figura 6). Mantenha as feridas abertas por aproximadamente 15 minutos antes do enfaixamento.NOTA: Todos os procedimentos cirúrgicos, inoculação, biópsias teciduais, exames de imagem e enfaixamento são feitos sob anestesia geral como nas seções 3 e 4. Confirmando o estabelecimento da infecçãoNOTA: Para confirmar que as feridas foram infectadas com sucesso após a inoculação, várias abordagens são utilizadas, e as amostras da ferida são comparadas com amostras coletadas de pele normal; Abaixo estão alguns exemplos.Para a análise anatomopatológica de amostras coletadas em diferentes momentos, use a contagem de unidades formadoras de colônias para estimar uma infecção (UFC; Figura 7E, F).Coletar 6 mm de tecidos da ferida por biópsia por punch. Rotular e pesar tubos vazios de fundo redondo de 5 mL. Transfira as amostras para os tubos e pese os tubos com as amostras. Corte o tecido com um bisturi em uma superfície estéril. Execute todas as etapas em um capô BSL2.NOTA: Para se certificar de que os tecidos são facilmente homogeneizados, o tamanho deve ser muito pequeno (mas não inferior a 0,5 mm) Coloque a amostra no tubo e adicione 1mL de PBS. Misture e triture o tecido usando uma sonda de moagem de tecido duro. Diluir serialmente (não diluído a 1 x 10−5) o homogeneizado, e placa 50 μL de cada diluição em meios seletivos (Agar de isolamento de Pseudomonas, PIA) e não seletivos (LBA). Incubar todas as diluições em condições aeróbias a 37 °C durante 18-24 horas. Imagem das placas com condições adequadas de iluminação. Selecione placas com 30-300 colônias, se nenhuma das placas tiver atingido essa concentração, use a placa não diluída. Use o ImageJ para contar os números de colônias e calcular a UFC por placa multiplicando o valor médio pelo fator de diluição final. Adquirir as imagens de amostras coletadas a partir do 7º dia pós-inoculação e outros momentos utilizando microscopia eletrônica de varredura (MEV) para confirmar a presença dos biofilmes bacterianos (Figura 7G).OBS: O dia 7 pós-inoculação foi selecionado por ser o dia do estabelecimento da infecção do biofilme e do início do amolecimento da escara de queimadura, o que permite a penetração das ondas de US e, assim, a visualização dos tecidos mais profundos. Na Figura 4, verifique a imagem da queimadura do dia 3 do US, que mostra a escara espessa e coriácea que impede a passagem das ondas de US para os tecidos mais profundos. Corar os cortes das biópsias da ferida operatória com anticorpos específicos contra P. aeruginosa para confirmar a presença da bactéria específica, como demonstrado em publicação anterior13 (Figura 7H). Realizar sequenciamento de próxima geração (NGS), conforme publicado em Sinha et al.31. Quantificar a bactéria 16srRNA das feridas infectadas e as amostras de pele normal não infectadas coletadas em diferentes momentos a partir do dia 7 pós-inoculação até o final do estudo. 12. Coleta de biópsia Coletar as biópsias de tecido para análise após exames de imagem no dia 7, dia 14, dia 28 e dia 56 pós-inoculação. Coletar biópsias de cada ferida apenas uma vez para minimizar a interferência no processo de cicatrização.NOTA: Todos os procedimentos cirúrgicos, inoculação, biópsias teciduais, exames de imagem e enfaixamento são feitos sob anestesia geral como nas seções 3 e 4.Infiltrar-se na área ao redor da ferida com bupivacaína a 0,5%. Cortar uma tira de 3-4 mm de largura de uma borda da ferida para a outra, mantendo pequenas margens de pele normal em ambos os lados, usando um bisturi descartável com uma lâmina tamanho 10. Coloque a tira em um tubo cônico marcado preenchido com formalina tamponada a 4% para fixação.NOTA: Para procedimentos de imagem e biópsia no momento inicial, uma dose completa de buprenorfina será administrada durante a preparação cirúrgica. Para procedimentos de biópsia tardia, uma meia dose de buprenorfina será administrada durante a preparação cirúrgica. Após todos os procedimentos de queimadura e biópsia, a gabapentina receberá BID por até 7 dias, conforme orientação do veterinário assistente. O carprofeno será administrado por dias pós-operatórios ou conforme orientação do veterinário assistente. Cortar uma biópsia por punch de 6 mm da ferida (seja do leito da ferida ou da borda da ferida). Coletar da borda da ferida, incluindo parte da pele normal e o leito da ferida, para diferentes tipos de análise. Retire a amostra com pinça esterilizada e tesoura dissecante. Coloque a amostra de biópsia no tubo ou apropriado para processamento e análise. Para CFU, SEM, RNA e FPPE, preservar as amostras em tubos com um tampão apropriado. Por exemplo, amostras podem ser colocadas em OCT em para microscopia de captura a laser (LCM) e imunohistoquímica (IHQ). Conseguir hemostasia após a coleta das amostras pressionando suavemente a ferida com uma gaze estéril. Cobrir a ferida com curativo não aderente e curativo como na seção 9. 13. Eutanásia e coleta de tecidos Sedar o porco no dia da eutanásia com TKX e anestesiar com isoflurano. Coloque um cateter intravenoso na veia marginal da orelha seguindo os passos descritos na secção 3. Intubar o suíno seguindo os passos da secção 4. Remova o curativo uma vez que o porco está anestesiado e limpe a área ao redor das feridas. Fotografia digital completa, LSI, TEWL e imagens HUSD. Recolher as amostras das feridas e da pele normal seguindo os passos descritos na secção 12. Uma vez que todas as amostras necessárias são coletadas, eutanasiar humanamente o porco ainda sob anestesia através de uma injeção intravenosa de solução de eutanásia comercialmente disponível (pentobarbital sódico). Use um estetoscópio para auscultar para confirmar a cessação dos batimentos cardíacos e respiração espontânea. Realizar um método secundário de eutanásia, conforme exigido pela MOS IACUC, usando um bisturi para induzir pneumotórax. Transfira a carcaça do porco para um barril e transporte para o freezer para ser recolhido para incineração.

Representative Results

Um dispositivo padronizado de queimadura foi usado para criar feridas de queimadura de espessura total a 150 °C por 1 min, o que resultou em uma queimadura profunda homogênea com uma margem uniforme de eritema e inflamação (Figura 3 e Figura 7). Cada porco recebeu oito queimaduras de espessura total no dorso, conforme Figura 3C. A avaliação não invasiva em tempo real das queimaduras por ultrassonografia de alta resolução modo-B para confirmar a profundidade da ferida e a progressão da cicatrização ao longo do tempo mostrou a destruição de todas as camadas da pele até a gordura subcutânea (Figura 4). O laser speckle imaging (LSI) foi utilizado para caracterização posterior da perfusão da ferida (Figura 4A). As queimaduras apresentavam membrana piogênica espessa na superfície da ferida no 7º dia pós-inoculação, confirmando a infecção e o estabelecimento do biofilme da queimadura (Figura 7A). A planimetria digital mostrou aumento da área da ferida no 3º dia pós-inoculação com PAO1 devido à resposta inflamatória no local e margens da ferida (Figura 7A,B). Embora a área da ferida tenha começado a diminuir no 14º dia pós-inoculação, observou-se cicatrização incompleta para aproximadamente 25% do tamanho original da ferida aos 56 dias, indicando a cronicidade das feridas (Figura 7B). A cronicidade da ferida e a cicatrização prejudicada foram confirmadas pelo TEWL, que mostrou alta perda de água transepidérmica. Os resultados do TEWL refletiram a perda da função de barreira cutânea em relação à pele normal em todos os momentos medidos, indicando comprometimento funcional da cicatrização da queimadura (Figura 7B). Isso também foi confirmado pela supressão das proteínas juncionais apertadas ZO-1 e 213 e pelo comprometimento da restauração da função de barreira cutânea, refletido nos altos valores de TEWL observados no 35º dia (meio) e 56º dia (tardio), apesar do fechamento da ferida visual (Figura 7I). A profundidade da queimadura foi posteriormente validada pela coloração H&E, que mostrou distorção e necrose de todas as camadas histológicas da pele, como mostra a Figura 7C. O biofilme estabelecido de PA01 foi validado no 7º dia pós-inoculação por UFC (Figura 7E,F), microscopia eletrônica de varredura (Figura 7G) e coloração por imunofluorescência (Figura 7H). Figura 1: Configuração do procedimento . (A) Preparo da mesa cirúrgica. (B) Canulação da veia auricular para fluidos endovenosos e administração de medicamentos. (C) Cobertura térmica para proteger o suíno da hipotermia durante o procedimento. (D) Configuração do queimador e temporizador. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Esterilização e marcação do sítio cirúrgico . (A) Corte e esterilização dos cabelos. (B) Marcação do local da queimadura com molde padrão estéril de oito feridas (cada ferida é de 2 pol x 2 pol). (C) Marcação final com marcador cutâneo estéril. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: Indução da queimadura. (A,B) Queimador padronizado com manômetro e unidade controladora automatizada (2 pol x 2 pol) aplicado no local da ferida pré-marcada. (C) Todo o dorso mostrando as oito queimaduras de espessura total. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: Imagem e avaliação não invasiva da ferida operatória . (A) A imagem speckle laser (LSI) com orientação adequada do indicador de feixe de laser para o centro da ferida é mostrada na imagem do lado esquerdo; a imagem do lado direito mostra o dispositivo LSI e o mapa de perfusão vascular da pele em tempo real. (B) A aplicação da sonda de perda hídrica transepidérmica (TEWL) no local da ferida em cinco pontos diferentes (quatro cantos da ferida e o centro demonstrado na imagem do canto inferior direito) é mostrada na imagem do lado esquerdo; a imagem do lado direito é uma tela representativa capturada em tempo real da medição TEWL. (C) Ultrassonografia harmônica da ferida queimada usando uma sonda de ultrassom de alta resolução de 16 MHz é mostrada no lado esquerdo; A imagem do lado direito mostra o aparelho de ultrassom e a gravação de tela em tempo real. (D) Imagens estruturais (imagens modo B, ultrassom em tons de cinza) e biomecânicas (elastografia, ultrassom colorido) do local da queimadura no dia da inoculação e no dia 7 pós-inoculação. A profundidade da ferida é indicada pela linha tracejada amarela. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5: Curativo e curativo . (A) Aplicação do curativo de filme transparente para cada ferida separadamente. (B) Todas as feridas de queimadura inoculadas dorsais são cobertas com a primeira camada de curativo. (C) Um curativo de filme transparente maior é colocado sobre toda a área da ferida. (D) Aplicação da segunda camada de gaze e uma camada solta de bandagem elástica ao redor de todo o tronco do porco para absorver qualquer exsudato líquido que venha das feridas. (E) Cobertura de toda a área da ferida com uma camada final de 4 em curativo adesivo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 6: Inoculação bacteriana . (A) Configuração para inoculação de Pseudomonas aeruginosa (PA01) no dia 3 pós-queimadura. (B) Aplicação tópica do inóculo com pipeta com volume de 500 μL para cada ferida. (C) O inóculo é disperso uniformemente pela superfície da ferida usando um espalhador descartável estéril. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 7: Evolução da cicatrização e confirmação do biofilme. (A) Imagens representativas do fechamento da ferida ao longo da linha do tempo do estudo. Barra de escala = 1 cm. (B) Quantificação da área da ferida e medidas do TEWL ao longo da linha do tempo do estudo (n = 6). Os dados são representados como média ± SD. N.S. refere-se ao valor TEWL da pele normal. (C) Diagrama esquemático mostrando diferentes locais de biópsia da ferida. Não. Coloração H&E com sua correspondente coloração tricrômico de Masson mostrando distorção e necrose de todas as camadas da pele no dia 3 pós-queimadura e no dia 7 pós-inoculação. Barra de escala = 500 μm. (E) Imagens digitais representativas de ágar não seletivo (ágar Luria-Bertani) e ágar seletivo (ágar isolamento Pseudomonas) com colônias bacterianas cultivadas a partir de tecido do leito da ferida suína. O meio seletivo permite a contagem precisa apenas das colônias PA01. (F) É apresentado um cálculo da unidade formadora de colónias (UFC) a partir das contagens de colónias retiradas das biópsias de feridas processadas no 7.º dia após a inoculação. (G) Imagens representativas de microscopia eletrônica de varredura (MEV) das queimaduras inoculadas no 7º dia pós-inoculação mostrando o biofilme PA01 estabelecido, com zoom no lado direito. Barra de escala = 1 μm. As pontas de seta vermelhas apontam para substâncias poliméricas extracelulares (EPS). (H) P. aeruginosa nas queimaduras foram visualizadas com anticorpo anti-Pseudomonas (verde); as imagens de imunofluorescência das biópsias da ferida do dia 7 pós-inoculação mostram forte colonização dos tecidos da ferida por P. aeruginosa. Barra de escala = 100 μm. (I) Mosaico representativo (barra de escala = 200 μm) e correspondentes imagens ampliadas (barra de escala = 50 μm) de cortes corados com ZO-1 e ZO-2 nos dias 35 e 56 pós-inoculação, demonstrando expressão reduzida das proteínas após a infecção induzida. Os cortes congelados (10 μm) incluídos em OCT foram corados usando anti-ZO-1 (verde) ou anti-ZO-2 (verde). Os cortes foram contracorados com DAPI. Os gráficos de barras apresentam a quantificação da intensidade do sinal ZO-1 e ZO-2. Os dados são apresentados como média ± DP (n = 3); * p < 0,05 em relação aos espontâneos. Mann-Whitney ou Kruskal-Wallis foram realizados testes de análise de variância one-way para testar a significância. A Figura 7H,I foi modificada de Roy et al.13. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Este relato fornece um protocolo detalhado para a criação de um modelo suíno de infecção crônica por biofilme de feridas para estudos experimentais. Vários modelos de biofilme suíno foram relatados anteriormente 22,23,24,25,26, mas nenhum deles é modelo suíno envolvendo estudos de 8 semanas a longo prazo. As feridas crônicas são aquelas que permanecem abertas por 4 semanas ou mais14,27,28. Não há outros modelos de biofilme de feridas crônicas relatados na literatura. Este trabalho aborda a noção de fechamento funcional da ferida 2,7,13,15,17,29. Um estudo realizado em 2014 foi o primeiro a relatar que feridas infectadas por biofilme podem fechar sem a restauração da função de barreira7. A mensuração da função de barreira cutânea na cicatrização de feridas utilizando a perda de água transepidérmica (TEWL) é relatada neste trabalho.

Anatômica e fisiologicamente, a pele suína, comparada à pele de outros pequenos animais, é uma pessoa mais próxima da pele humana32,33,34. Tanto a pele de suínos quanto a pele humana apresentam epiderme espessa 33, e a relação dermoepidérmica varia de 10:1 a13:1 em suínos, o que é comparável ao de humanos34,35. Histológica e biomecanicamente, a pele de humanos e suínos apresenta semelhanças nas cristas retas, gordura subdérmica, colágeno dérmico, distribuição dos pelos, estruturas anexiais, tamanho e distribuição dos vasos sanguíneos36,37,38. Funcionalmente, suínos e humanos compartilham semelhanças na composição dos componentes lipídicos, proteicos e queratinos da camada epidérmica, bem como padrões imuno-histológicos comparáveis37,38. O sistema imune suíno, comparado ao de outros pequenos animais, compartilha maiores semelhanças com o sistema imunológico humano, o que significa que os porcos são um modelo apropriado para estudos sobre as interações do hospedeiro que são parte integrante das complexidades do biofilme patológico em infecções de feridas39. A avaliação crítica dos prós e contras oferecidos por vários modelos animais levou ao consenso de que os suínos representam um modelo eficiente para o estudo da cicatrização de feridas34,38. Além disso, porcos domésticos desenvolvem espontaneamente infecções bacterianas crônicas, como observado em humanos10. O dispositivo de queimadura usado para criar as feridas é um dispositivo de queimadura avançado e automatizado que fornece energia térmica com base em uma leitura da temperatura do local da pele alvo22,40. Tal abordagem melhora o rigor e a reprodutibilidade da lesão por queimadura. O uso de isolados clínicos humanos de bactérias para infectar feridas de suínos agrega valor como modelo pré-clínico.

As lesões por queimaduras são complexas e causam diversas perturbações sistêmicas20,41. Assim, é importante reanimar o porco com fluidos adequados e prevenir a hipotermia durante a anestesia e recuperação. Vários fatores podem interferir na cicatrização da ferida, incluindo a nutrição pós-queimadura, líquidos e dor42. O monitoramento rigoroso das avaliações nutricionais e de dor é, portanto, importante. A dor pós-queimadura pode ser intensa e influenciar o comportamento e a dieta do animal. Intervenções para abordar preocupações comportamentais devem ser ativamente consideradas. A pontuação e o tratamento regulares e contínuos da dor são imperativos. Uma ficha completa de avaliação da dor com um plano de tratamento da dor muito detalhado está incluída neste protocolo. Para evitar contaminação cruzada entre as feridas, atenção especial deve ser dada à aplicação da primeira camada do curativo em cada ferida separadamente. Cuidados críticos devem ser tomados no manuseio de todos os materiais bioperigosos e ao realizar a desinfecção completa dos equipamentos, ferramentas e toda a sala cirúrgica. A aplicação de várias camadas do curativo evita que o porco exponha as feridas durante seu esforço para esfregar ou coçar a coceira nas costas.

O porco no modelo atual não foi comprometido por distúrbios metabólicos subjacentes (por exemplo, diabetes) e, portanto, o efeito em estudo foi puramente o impacto da infecção do biofilme bacteriano na cicatrização de feridas. No entanto, o modelo se presta à indução de diabetes (usando estreptozotocina, por exemplo) e poderia ser usado para estudar a infecção do biofilme em relação a um distúrbio metabólico subjacente. A outra limitação do modelo é o controle da infecção com P. aeruginosa, uma bactéria. Espera-se que a microflora normal da pele do porco também possa estar crescendo na ferida e possa afetar a cicatrização. Uma análise mais aprofundada usando NGS ou outras técnicas avançadas para delinear o conteúdo microbiano da ferida é necessária. O modelo atual também pode ser aplicado a infecções mistas com diferentes espécies microbianas (por exemplo, fúngicas, virais, etc.). Este é um elemento importante, pois feridas clinicamente relevantes provavelmente são povoadas por micróbios mistos, o que pode afetar a cicatrização de feridas de forma diferenciada.

Há muitas vantagens potenciais nesse modelo, incluindo a semelhança com a complexidade e sequelas a longo prazo de feridas crônicas humanas, o processo automatizado e reprodutível de queimadura e o uso de espécies bacterianas clinicamente isoladas. O uso de múltiplas modalidades de imagem não invasivas representa uma abordagem poderosa para a coleta de dados fisiológicos úteis que caracterizam a ferida. Finalmente, a avaliação da cicatrização funcional de feridas através da restauração da função de barreira cutânea baseada no TEWL é fundamental. Em conclusão, um protocolo robusto, simples, detalhado e fácil de usar para desenvolver uma lesão grave por queimadura infectada por biofilme usando um sistema modelo suíno é mostrado neste trabalho.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos ao Laboratory Animal Resource Center (LARC), da Universidade de Indiana, pelo apoio e pelos cuidados veterinários com os animais durante o estudo. Este trabalho foi parcialmente apoiado pelos subsídios do National Institutes of Health NR015676, NR013898 e DK125835 e pelo subsídio W81XWH-11-2-0142 do Departamento de Defesa. Além disso, esse trabalho se beneficiou dos seguintes prêmios do National Institutes of Health: GM077185, GM069589, DK076566, AI097511 e NS42617.

Materials

Sedation
Ketamine Zoetis 10004027 100mg/ml
Telazol Zoetis 106-111 100mg/ml
Xylazine Pivetal 04606-6750-02 100mg/ml Anased
3ml syringe w/ 20g needle Covidien-Monoject 8881513033
Winged infusion set 21g Jorgensen Labs J0454B
Anesthetic
Isoflurane Pivetal 21295097
Surgery
Hair clippers Wahl 8787-450A
Nair Church and Dwight Co. Inc 70506572
Chlorhexidine Solution First Priority Inc. 179925722
70% Isopropyl Alcohol Uline S-17474
0.9% Saline Solution ICU Medical  RL-7282
Non-woven gauze Pivetal 21295051
Paper tape McKesson 455531
2" Elastic tape Pivetal 21300869
18-22g Intravenous Angiocath SurVet (01)14806017512306
Spay hook Jorgensen Labs J0112A
Sterile lube McKesson 16-8942
Laryngoscope Jorgensen Labs J0449S
Roll gauze Pivetal 21295032
Endotracheal tube (7-9mm) Covidien 86112 Shiley Hi-Lo Oral Nasal Tracheal Tube Cuffed
15gtt/ml IV administration set ICU Medical 12672-28
LRS 1000ml bag ICU Medical 07953-09
Three Quarter Drape Sheet McKesson 16-i80-12110G
Analgesia
Buprenorphine RX Generics 42023-0179-05 0.3mg/ml
Fentanyl Transdermal
Carprofen 21294548 Pivetal 50mg/ml Levafen
Bandaging
Transparent film dressing 26×30 Genadyne Biotechnologies A4-S00F5
Film dressing 4 x 4-3/4 Frame Style McKesson 886408
Vetrap 3M 1410BK BULK
Elastic tape 4" Pivetal 21300931
Kerlix Roll Gauze Cardinal Health 3324
Imaging
Canon EOS 80D Canon 1263C004
Speedlight 600EX II-RT Canon 1177C002
EFS 17-55mm Ultrasonic Canon 1242B002
GE Logiq E9 GE 5197104-2
ML6-15 Probe GE 5199103
PeriCamPSI Perimed 90-00070
DermaLab Cortex Technologies Inc 4608D78
Biopsy/Tissue Collection
6mm punch biopsy Integra Lifesciences 33-36
bupivicaine 0.5% Auromedics Pharma 55150017030
Size 10 Disposable Scalpel McKesson 16-63810
Dissection scissors Pivetal 21294806
Rat tooth thumb tissue forceps Aesculap BD512R
Non-adherent Dressing Covidien 2132 Telfa
50ml Conical tube Falcon 352070
Eppendorf/microcentrifuge tube Fisherbrand 02-681-320
OCT Cassette
Non Woven Gauze 4×4 Pivetal 21295051
Inoculum
Low salt LB agar Invitrogen 22700-025
Low salt LB broth Fisher scientific BP1427-500
Petri plate Falcon REF-351029
Polyprophyline round bottom tubes (14 ml) Falcon REF-352059
Pseudomonas Agar Base (Dehydrated) Thermo Scientific OXCM0559B
LB Agar, powder (Lennox L agar) Thermo Fisher Scientific (Life Technologies) 22700025
Gibco™ DPBS, calcium, magnesium Gibco 14040133
Euthanasia
18-22g Intravenous Angiocath SurVet (01)14806017512306
Fatal Plus Vortech Pharmaceuticals 9373
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References

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El Masry, M., Bhasme, P., Mathew-Steiner, S. S., Smith, J., Smeenge, T., Roy, S., Sen, C. K. Swine Model of Biofilm Infection and Invisible Wounds. J. Vis. Exp. (196), e65301, doi:10.3791/65301 (2023).
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