Chronische Wunden, die gegen Antibiotika resistent sind, stellen eine große Bedrohung für das Gesundheitssystem dar. Biofilminfektionen sind hartnäckig und feindlich und können zu einem mangelhaften funktionellen Wundverschluss führen. Wir berichten über ein klinisch relevantes Schweinemodell von Biofilm-infizierten chronischen Wunden voller Dicke. Dieses Modell eignet sich sowohl für mechanistische Studien als auch für das Testen von Interventionen.
Biofilminfektionen tragen wesentlich zur Wundchronizität bei. Die Etablierung einer klinisch relevanten experimentellen Wundbiofilminfektion erfordert die Beteiligung des Immunsystems des Wirts. Iterative Veränderungen des Wirts und des Erregers während der Bildung eines solchen klinisch relevanten Biofilms können nur in vivo auftreten. Das Schweinewundmodell ist für seine Vorteile als leistungsfähiges präklinisches Modell anerkannt. Es gibt mehrere Berichte über Ansätze zur Untersuchung von Wundbiofilmen. In-vitro – und Ex-vivo-Systeme weisen Defizite in Bezug auf die Immunantwort des Wirts auf. Kurzfristige In-vivo-Studien beinhalten ein akutes Ansprechen und erlauben daher keine Biofilmreifung, wie sie bekanntermaßen klinisch auftritt. Die erste Langzeitstudie zum Wundbiofilm von Schweinen wurde 2014 veröffentlicht. In der Studie wurde erkannt, dass sich mit Biofilm infizierte Wunden zwar planimetrisch geschlossen werden können, die Hautbarrierefunktion der betroffenen Stelle jedoch möglicherweise nicht wiederhergestellt wird. Später wurde diese Beobachtung klinisch validiert. Das Konzept des funktionellen Wundverschlusses war geboren. Geschlossene Wunden, bei denen die Hautbarrierefunktion jedoch unzureichend ist, können als unsichtbare Wunden angesehen werden. In dieser Arbeit versuchen wir, die methodischen Details zu berichten, die notwendig sind, um das langfristige Schweinemodell der Biofilm-infizierten schweren Verbrennungsverletzung zu reproduzieren, das klinisch relevant ist und einen translationalen Wert hat. Dieses Protokoll enthält eine detaillierte Anleitung zum Nachweis einer 8-wöchigen Wundbiofilminfektion mit P. aeruginosa (PA01). Acht Brandwunden in voller Dicke wurden symmetrisch auf dem Rücken von weißen Hausschweinen angelegt, die am Tag 3 nach der Verbrennung mit (PA01) geimpft wurden; Anschließend wurden nicht-invasive Beurteilungen der Wundheilung zu verschiedenen Zeitpunkten mittels Laser-Speckle-Imaging (LSI), hochauflösendem Ultraschall (HUSD) und transepidermalem Wasserverlust (TEWL) durchgeführt. Die geimpften Brandwunden wurden mit einem vierlagigen Verband abgedeckt. Biofilme, die am Tag 7 nach der Inokulation durch REM festgestellt und strukturell bestätigt wurden, beeinträchtigten den funktionellen Wundverschluss. Ein solches unerwünschtes Ergebnis kann als Reaktion auf geeignete Interventionen rückgängig gemacht werden.
Eine Biofilminfektion erschwert Verbrennungen und chronische Wunden und verursacht eine Chronifizierung 1,2,3,4,5. In der Mikrobiologie werden vor allem Biofilmmechanismen untersucht, wobei der Schwerpunkt auf den Mikrobenliegt 1,6. Die aus diesen Studien gewonnenen Erkenntnisse sind aus biowissenschaftlicher Sicht von größter Bedeutung, müssen aber nicht unbedingt auf klinisch relevante pathogene Biofilme anwendbar sein 6,7,8. Klinisch relevante Biofilm-Strukturaggregate sollten sowohl mikrobielle als auch Wirtsfaktorenenthalten 8,9,10. Eine solche Mikroumgebung ermöglicht die Einbeziehung iterativer Wirt-Mikroben-Interaktionen, die für die Entwicklung eines klinisch relevanten Biofilms entscheidend sind 7,8. Bei einem solchen Prozess ist die Beteiligung von Immunzellen und durch Blut übertragenen Faktoren von entscheidender Bedeutung11,12. Die Wirt-Mikroben-Interaktionen, die klinisch pathogenen Biofilmen zugrunde liegen, wie sie bei chronischen Wunden beobachtet werden, treten über einen langen Zeitraum auf. Daher muss jeder experimentelle Ansatz, der darauf abzielt, ein translational relevantes Modell der Biofilminfektion zu entwickeln, diese Faktoren berücksichtigen. Daher haben wir versucht, ein klinisch reproduzierbares Modell für chronische Biofilminfektionen bei Schweinen zu entwickeln.
Während Studien am Menschen eindeutig den besten Ansatz zur Untersuchung von Heilungsergebnissen darstellen, sind sie oft nicht am besten geeignet, um die zugrunde liegenden Mechanismen und neuen mechanistischen Paradigmen zu untersuchen. Ethische Bedenken schränken die Verwendung von Studiendesigns ein, die die Entnahme mehrerer Biopsien aus einer chronischen Wunde zu verschiedenen Zeitpunkten erfordern. Es ist daher von entscheidender Bedeutung, über ein gut etabliertes und reproduzierbares Tiermodell zu verfügen, um invasive Studien zur gründlichen Untersuchung des Biofilm-Verbleibs zu ermöglichen 7,13. Die Auswahl eines Tiermodells hängt von mehreren Faktoren ab, darunter die wissenschaftliche/translationale Relevanz und die Logistik. Das porcine System gilt weithin als das translational wertvollste experimentelle Modell zur Untersuchung menschlicher Hautwunden7. So wird in dieser Arbeit ein etabliertes Schweinemodell für Biofilm-infizierte Verbrennungen in voller Dicke vorgestellt. Diese Arbeit basiert auf mehreren Originalpublikationen, die inder Literatur 2,7,13,14,15,16,17 veröffentlicht wurden. In dieser Studie wurde ein klinisches Isolat von multiresistentem Pseudomonas aeruginosa (PA01) ausgewählt, um die Wunde zu infizieren. P. aeruginosa ist eine häufige Ursache für Wundinfektionen 2,18,19,20. Es handelt sich um ein gramnegatives Bakterium, das aufgrund seiner Resistenz gegen einige Antibiotika schwer zu behandeln sein kann11,19,21. Keines der bisher berichteten Biofilmmodelle von Schweinen umfasste 8-wöchige Langzeitstudien 22,23,24,25,26. Chronische Wunden sind solche, die 4 Wochen oder länger offen bleiben 14,27,28. In der Literatur gibt es keine anderen Biofilmmodelle für chronische Wunde. Diese Arbeit befasst sich mit dem Begriff des funktionellen Wundverschlusses 2,7,13,15,17,29.
Dieser Bericht enthält ein detailliertes Protokoll für die Erstellung eines Schweinemodells für chronische Wundbiofilminfektionen für experimentelle Studien. Mehrere Schweine-Biofilm-Modelle wurden zuvor beschrieben 22,23,24,25,26, aber keines davon sind Schweinemodelle mit 8-wöchigen Langzeitstudien. Chronische Wunden sind solche, die 4 Wochen oder länger offen bleiben 14,27,28. In der Literatur gibt es keine anderen Biofilmmodelle für chronische Wunde. Diese Arbeit befasst sich mit dem Begriff des funktionellen Wundverschlusses 2,7,13,15,17,29. Eine Studie aus dem Jahr 2014 war die erste, die berichtete, dass sich mit Biofilm infizierte Wunden schließen können, ohne dass die Barrierefunktion wiederhergestellt wird7. In dieser Arbeit wird über die Messung der Hautbarrierefunktion in der heilenden Wunde mittels transepidermalem Wasserverlust (TEWL) berichtet.
Anatomisch und physiologisch ist die Schweinehaut im Vergleich zur Haut anderer Kleintiere der menschlichen Haut näher 32,33,34. Sowohl die Haut von Schweinen als auch von Menschen hat eine dicke Epidermis 33, und das Verhältnis von dermaler und epidermaler Dicke liegt beim Schwein zwischen 10:1 und13:1, was mit dem des Menschen vergleichbar ist34,35. Histologisch und biomechanisch zeigt die Haut von Menschen und Schweinen Ähnlichkeiten in den Rete-Leisten, dem subdermalen Fett, dem dermalen Kollagen, der Haarverteilung, den Adnexstrukturen sowie der Größe und Verteilung der Blutgefäße36,37,38. Funktionell weisen sowohl Schweine als auch Menschen Ähnlichkeiten in der Zusammensetzung der Lipid-, Protein- und Keratinkomponenten der Epidermisschicht sowie vergleichbare immunhistologische Muster auf37,38. Das Immunsystem von Schweinen weist im Vergleich zu anderen Kleintieren größere Ähnlichkeiten mit dem menschlichen Immunsystem auf, was bedeutet, dass Schweine ein geeignetes Modell für Studien zu den Wirtsinteraktionen sind, die für die Komplexität des pathologischen Biofilms bei Wundinfektionen von wesentlicher Bedeutung sind39. Die kritische Abwägung der Vor- und Nachteile verschiedener Tiermodelle hat zu dem Konsens geführt, dass Schweine ein effizientes Modell zur Untersuchung der Wundheilung darstellen34,38. Darüber hinaus entwickeln Hausschweine spontan chronische bakterielle Infektionen, wie sie beim Menschen beobachtet werden10. Die Verbrennungsvorrichtung, die zur Erzeugung der Wunden verwendet wird, ist eine fortschrittliche und automatisierte Verbrennungsvorrichtung, die Wärmeenergie auf der Grundlage einer Temperatur abgibt, die von der Zielhautstelle22,40 ausgelesen wird. Ein solcher Ansatz verbessert die Strenge und Reproduzierbarkeit der Brandverletzung. Die Verwendung von humanen klinischen Bakterienisolaten zur Infektion der Schweinewunden stellt einen Mehrwert als präklinisches Modell dar.
Brandverletzungen sind komplex und verursachen mehrere systemische Störungen20,41. Daher ist es wichtig, das Schwein mit ausreichender Flüssigkeit wiederzubeleben und eine Unterkühlung während der Narkose und Genesung zu verhindern. Mehrere Faktoren können die Wundheilung beeinträchtigen, darunter die Ernährung nach der Verbrennung, Flüssigkeiten und Schmerzen42. Daher ist eine engmaschige Überwachung der Ernährungs- und Schmerzbeurteilungen von Bedeutung. Schmerzen nach Verbrennungen können stark sein und das Verhalten und die Ernährung des Tieres beeinflussen. Interventionen zur Bewältigung von Verhaltensproblemen müssen aktiv in Betracht gezogen werden. Eine regelmäßige und kontinuierliche Schmerzbewertung und -behandlung ist unerlässlich. Ein gründlicher Schmerzbeurteilungsbogen mit einem sehr detaillierten Schmerzbehandlungsplan ist in diesem Protokoll enthalten. Um eine Kreuzkontamination zwischen den Wunden zu vermeiden, sollte besonders darauf geachtet werden, die erste Schicht des Verbandes auf jede Wunde separat aufzutragen. Beim Umgang mit allen biogefährlichen Stoffen und bei der gründlichen Desinfektion der Geräte, Werkzeuge und des gesamten Operationssaals ist besondere Vorsicht geboten. Das Auftragen mehrerer Schichten des Verbandes verhindert, dass das Schwein die Wunden freilegt, während es versucht, den juckenden Rücken zu reiben oder zu kratzen.
Das Schwein im aktuellen Modell war nicht durch zugrunde liegende Stoffwechselstörungen (z. B. Diabetes) beeinträchtigt, und daher war der untersuchte Effekt ausschließlich der Einfluss der bakteriellen Biofilminfektion auf die Wundheilung. Das Modell eignet sich jedoch für die Induktion von Diabetes (z. B. mit Streptozotocin) und könnte verwendet werden, um Biofilminfektionen in Bezug auf eine zugrunde liegende Stoffwechselstörung zu untersuchen. Die andere Einschränkung des Modells ist die kontrollierte Infektion mit dem Bakterium P. aeruginosa. Es wird erwartet, dass auch die normale Hautflora des Schweins in der Wunde wächst und die Heilung beeinträchtigen könnte. Eine weitere Analyse mit NGS oder anderen fortschrittlichen Techniken zur Abgrenzung des mikrobiellen Inhalts der Wunde ist erforderlich. Das aktuelle Modell könnte auch auf Mischinfektionen mit unterschiedlichen mikrobiellen Spezies (z.B. Pilze, Viren etc.) angewendet werden. Dies ist ein wichtiges Element, da klinisch relevante Wunden wahrscheinlich von gemischten Mikroben besiedelt werden, was die Wundheilung unterschiedlich beeinflussen kann.
Dieses Modell bietet viele potenzielle Vorteile, darunter die Ähnlichkeit mit der Komplexität und den Langzeitfolgen chronischer Wunden beim Menschen, der automatisierte und reproduzierbare Verbrennungsprozess und die Verwendung klinisch isolierter Bakterienarten. Die Verwendung mehrerer nicht-invasiver Bildgebungsmodalitäten stellt einen leistungsstarken Ansatz dar, um nützliche physiologische Daten zur Charakterisierung der Wunde zu sammeln. Schließlich ist die Beurteilung der funktionellen Wundheilung über die Wiederherstellung der Hautbarrierefunktion auf Basis von TEWL entscheidend. Zusammenfassend wird in dieser Arbeit ein robustes, einfaches, detailliertes und leicht anzuwendendes Protokoll zur Entwicklung einer Biofilm-infizierten schweren Verbrennungsverletzung unter Verwendung eines porcinen Modellsystems gezeigt.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken dem Laboratory Animal Resource Center (LARC) der Indiana University für die Unterstützung und die tierärztliche Betreuung der Tiere während der Studie. Diese Arbeit wurde teilweise durch die National Institutes of Health Grants NR015676, NR013898 und DK125835 und den Zuschuss W81XWH-11-2-0142 des Verteidigungsministeriums unterstützt. Darüber hinaus profitierte diese Arbeit von den folgenden Auszeichnungen der National Institutes of Health: GM077185, GM069589, DK076566, AI097511 und NS42617.
Sedation | |||
Ketamine | Zoetis | 10004027 | 100mg/ml |
Telazol | Zoetis | 106-111 | 100mg/ml |
Xylazine | Pivetal | 04606-6750-02 | 100mg/ml Anased |
3ml syringe w/ 20g needle | Covidien-Monoject | 8881513033 | |
Winged infusion set 21g | Jorgensen Labs | J0454B | |
Anesthetic | |||
Isoflurane | Pivetal | 21295097 | |
Surgery | |||
Hair clippers | Wahl | 8787-450A | |
Nair | Church and Dwight Co. Inc | 70506572 | |
Chlorhexidine Solution | First Priority Inc. | 179925722 | |
70% Isopropyl Alcohol | Uline | S-17474 | |
0.9% Saline Solution | ICU Medical | RL-7282 | |
Non-woven gauze | Pivetal | 21295051 | |
Paper tape | McKesson | 455531 | |
2" Elastic tape | Pivetal | 21300869 | |
18-22g Intravenous Angiocath | SurVet | (01)14806017512306 | |
Spay hook | Jorgensen Labs | J0112A | |
Sterile lube | McKesson | 16-8942 | |
Laryngoscope | Jorgensen Labs | J0449S | |
Roll gauze | Pivetal | 21295032 | |
Endotracheal tube (7-9mm) | Covidien | 86112 | Shiley Hi-Lo Oral Nasal Tracheal Tube Cuffed |
15gtt/ml IV administration set | ICU Medical | 12672-28 | |
LRS 1000ml bag | ICU Medical | 07953-09 | |
Three Quarter Drape Sheet | McKesson | 16-i80-12110G | |
Analgesia | |||
Buprenorphine | RX Generics | 42023-0179-05 | 0.3mg/ml |
Fentanyl Transdermal | |||
Carprofen | 21294548 | Pivetal | 50mg/ml Levafen |
Bandaging | |||
Transparent film dressing 26×30 | Genadyne Biotechnologies | A4-S00F5 | |
Film dressing 4 x 4-3/4 Frame Style | McKesson | 886408 | |
Vetrap | 3M | 1410BK BULK | |
Elastic tape 4" | Pivetal | 21300931 | |
Kerlix Roll Gauze | Cardinal Health | 3324 | |
Imaging | |||
Canon EOS 80D | Canon | 1263C004 | |
Speedlight 600EX II-RT | Canon | 1177C002 | |
EFS 17-55mm Ultrasonic | Canon | 1242B002 | |
GE Logiq E9 | GE | 5197104-2 | |
ML6-15 Probe | GE | 5199103 | |
PeriCamPSI | Perimed | 90-00070 | |
DermaLab | Cortex Technologies Inc | 4608D78 | |
Biopsy/Tissue Collection | |||
6mm punch biopsy | Integra Lifesciences | 33-36 | |
bupivicaine 0.5% | Auromedics Pharma | 55150017030 | |
Size 10 Disposable Scalpel | McKesson | 16-63810 | |
Dissection scissors | Pivetal | 21294806 | |
Rat tooth thumb tissue forceps | Aesculap | BD512R | |
Non-adherent Dressing | Covidien | 2132 | Telfa |
50ml Conical tube | Falcon | 352070 | |
Eppendorf/microcentrifuge tube | Fisherbrand | 02-681-320 | |
OCT Cassette | |||
Non Woven Gauze 4×4 | Pivetal | 21295051 | |
Inoculum | |||
Low salt LB agar | Invitrogen | 22700-025 | |
Low salt LB broth | Fisher scientific | BP1427-500 | |
Petri plate | Falcon | REF-351029 | |
Polyprophyline round bottom tubes (14 ml) | Falcon | REF-352059 | |
Pseudomonas Agar Base (Dehydrated) | Thermo Scientific | OXCM0559B | |
LB Agar, powder (Lennox L agar) | Thermo Fisher Scientific (Life Technologies) | 22700025 | |
Gibco™ DPBS, calcium, magnesium | Gibco | 14040133 | |
Euthanasia | |||
18-22g Intravenous Angiocath | SurVet | (01)14806017512306 | |
Fatal Plus | Vortech Pharmaceuticals | 9373 |