Les plaies chroniques résistantes aux antibiotiques constituent une menace majeure pour le système de santé. Les infections par biofilm sont tenaces et hostiles et peuvent entraîner une fermeture fonctionnelle déficiente de la plaie. Nous rapportons un modèle porcin cliniquement pertinent de plaies chroniques de pleine épaisseur infectées par un biofilm. Ce modèle est puissant pour les études mécanistiques ainsi que pour tester des interventions.
L’infection par biofilm est un contributeur majeur à la chronicité des plaies. L’établissement d’une infection expérimentale du biofilm de la plaie cliniquement pertinente nécessite l’implication du système immunitaire de l’hôte. Les changements itératifs de l’hôte et de l’agent pathogène lors de la formation d’un tel biofilm cliniquement pertinent ne peuvent se produire qu’in vivo. Le modèle de plaie porcine est reconnu pour ses avantages en tant que modèle préclinique puissant. Il existe plusieurs approches rapportées pour étudier les biofilms des plaies. Les systèmes in vitro et ex vivo sont déficients en termes de réponse immunitaire de l’hôte. Les études in vivo à court terme impliquent des réponses aiguës et, par conséquent, ne permettent pas la maturation du biofilm, comme on sait que cela se produit cliniquement. La première étude à long terme sur le biofilm des plaies porcines a été publiée en 2014. L’étude a reconnu que les plaies infectées par le biofilm peuvent se refermer comme déterminé par la planimétrie, mais que la fonction de barrière cutanée du site affecté peut ne pas être restaurée. Plus tard, cette observation a été validée cliniquement. C’est ainsi qu’est né le concept de fermeture fonctionnelle des plaies. Les plaies fermées mais déficientes dans la fonction de barrière cutanée peuvent être considérées comme des plaies invisibles. Dans ce travail, nous cherchons à rapporter les détails méthodologiques nécessaires pour reproduire le modèle porcin à long terme de brûlures graves infectées par un biofilm, qui est cliniquement pertinent et a une valeur translationnelle. Ce protocole fournit des conseils détaillés sur l’établissement d’une infection par biofilm de la plaie de 8 semaines à l’aide de P. aeruginosa (PA01). Huit brûlures sur toute l’épaisseur ont été créées symétriquement sur le dos de porcs blancs domestiques, qui ont été inoculés avec (PA01) au jour 3 après la combustion ; Par la suite, des évaluations non invasives de la cicatrisation des plaies ont été effectuées à différents moments à l’aide de l’imagerie par taches laser (LSI), des ultrasons à haute résolution (HUSD) et de la perte d’eau transépidermique (TEWL). Les brûlures inoculées ont été recouvertes d’un pansement à quatre couches. Les biofilms, tels qu’établis et confirmés structurellement par MEB au jour 7 après l’inoculation, ont compromis la fermeture fonctionnelle de la plaie. Un tel résultat défavorable est susceptible d’être renversé en réponse à des interventions appropriées.
L’infection par biofilm complique les brûlures et les plaies chroniques et provoque une chronicité 1,2,3,4,5. En microbiologie, les mécanismes du biofilm sont principalement étudiés, avec un accent particulier sur les microbes 1,6. Les leçons tirées de ces études sont d’une importance capitale du point de vue de la science biologique, mais ne sont pas nécessairement applicables aux biofilms pathogènes cliniquement pertinents 6,7,8. Les agrégats structurels de biofilm cliniquement pertinents doivent inclure les facteurs microbiens ainsi que les facteurs de l’hôte 8,9,10. Un tel microenvironnement permet d’inclure des interactions itératives hôte-microbe, qui sont essentielles au développement d’un biofilm cliniquement pertinent 7,8. Dans un tel processus, la participation des cellules immunitaires et des facteurs transmissibles par le sang est essentielle11,12. Les interactions hôte-microbe sous-jacentes aux biofilms pathogènes cliniques, telles qu’elles sont observées dans les plaies chroniques, se produisent sur une longue période de temps. Ainsi, toute approche expérimentale visant à développer un modèle d’infection par biofilm pertinent sur le plan translationnel doit tenir compte de ces facteurs. Nous avons donc cherché à développer un modèle d’infection chronique par biofilm porcin cliniquement reproductible.
Bien que les études humaines représentent clairement la meilleure approche pour étudier les résultats de la guérison, elles ne sont souvent pas les mieux adaptées pour aborder les mécanismes sous-jacents et les nouveaux paradigmes mécanistes. Des préoccupations éthiques limitent l’utilisation de modèles d’étude exigeant la collecte de plusieurs biopsies d’une plaie chronique à différents moments. Il est donc essentiel de disposer d’un modèle animal bien établi et reproductible pour permettre des études invasives pour l’examen approfondi du devenir du biofilm 7,13. Le choix d’un modèle animal dépend de plusieurs facteurs, notamment de la pertinence scientifique/translationnelle et de la logistique. Le système porcin est largement reconnu comme étant le modèle expérimental le plus précieux sur le plan translationnel pour étudier les plaies cutanées humaines7. Ainsi, ce travail fait état d’un modèle porcin établi de brûlures sur toute l’épaisseur infectées par un biofilm. Ce travail est basé sur plusieurs publications originales rapportées dans la littérature 2,7,13,14,15,16,17. Dans cette étude, un isolat clinique de Pseudomonas aeruginosa (PA01) multirésistant a été choisi pour infecter la plaie. P. aeruginosa est une cause fréquente d’infections des plaies 2,18,19,20. Il s’agit d’une bactérie à Gram négatif qui peut être difficile à traiter en raison de sa résistance à certains antibiotiques11,19,21. Aucun des modèles de biofilm porcin rapportés jusqu’à présent n’impliquait d’études à long terme de 8 semaines 22,23,24,25,26. Les plaies chroniques sont celles qui restent ouvertes pendant 4 semaines ou plus 14,27,28. Il n’y a pas d’autres modèles de biofilm de plaie chronique rapportés dans la littérature. Ce travail aborde la notion de fermeture fonctionnelle de la plaie 2,7,13,15,17,29.
Ce rapport fournit un protocole détaillé pour la mise en place d’un modèle porcin d’infection chronique du biofilm de la plaie pour les études expérimentales. Plusieurs modèles de biofilm porcin ont déjà été rapportés 22,23,24,25,26, mais aucun d’entre eux n’est un modèle porcin impliquant des études à long terme de 8 semaines. Les plaies chroniques sont celles qui restent ouvertes pendant 4 semaines ou plus 14,27,28. Il n’y a pas d’autres modèles de biofilm de plaie chronique rapportés dans la littérature. Ce travail aborde la notion de fermeture fonctionnelle de la plaie 2,7,13,15,17,29. Une étude menée en 2014 a été la première à rapporter que les plaies infectées par le biofilm peuvent se refermer sans la restauration de la fonction barrière7. La mesure de la fonction de barrière cutanée dans la plaie cicatrisante à l’aide de la perte d’eau transépidermique (TEWL) est rapportée dans ce travail.
Anatomiquement et physiologiquement, la peau du porc, comparée à celle d’autres petits animaux, est plus proche de la peau humaine32,33,34. La peau du porc et celle de l’homme ont un épiderme épais 33, et le rapport d’épaisseur dermo-épidermique varie de 10 :1 à13 :1 chez le porc, ce qui est comparable à l’homme34,35. Histologiquement et biomécaniquement, la peau des humains et des porcs présente des similitudes dans les crêtes de rete, la graisse sous-cutanée, le collagène dermique, la distribution des cheveux, les structures annexielles et la taille et la distribution des vaisseaux sanguins36,37,38. Sur le plan fonctionnel, les porcs et les humains partagent des similitudes dans la composition des composants lipidiques, protéiques et kératiniques de la couche épidermique, ainsi que des profils immunohistologiques comparables37,38. Le système immunitaire porcin, comparé à celui d’autres petits animaux, partage des similitudes plus élevées avec le système immunitaire humain, ce qui signifie que les porcs sont un modèle approprié pour les études sur les interactions avec l’hôte qui font partie intégrante des complexités du biofilm pathologique dans les infections des plaies39. L’évaluation critique des avantages et des inconvénients offerts par divers modèles animaux a conduit au consensus sur le fait que les porcs représentent un modèle efficace pour étudier la cicatrisation des plaies34,38. De plus, les porcs domestiques développent spontanément des infections bactériennes chroniques, comme cela a été observé chez l’homme10. Le dispositif de brûlure utilisé pour créer les plaies est un dispositif de brûlure avancé et automatisé qui fournit de l’énergie thermique en fonction d’une température lue à partir du site cutané ciblé22,40. Une telle approche améliore la rigueur et la reproductibilité de la brûlure. L’utilisation d’isolats cliniques humains de bactéries pour infecter les plaies de porc ajoute de la valeur en tant que modèle préclinique.
Les brûlures sont complexes et causent plusieurs perturbations systémiques20,41. Ainsi, il est important de réanimer le porc avec des liquides adéquats et de prévenir l’hypothermie pendant l’anesthésie et la récupération. Plusieurs facteurs peuvent interférer avec la cicatrisation de la plaie, notamment la nutrition post-brûlure, les liquides et la douleur42. Il est donc important de surveiller de près l’évaluation de la nutrition et de la douleur. La douleur post-brûlure peut être intense et influencer le comportement et l’alimentation de l’animal. Les interventions visant à résoudre les problèmes de comportement doivent être activement envisagées. Il est impératif d’évaluer et de gérer la douleur de façon régulière et continue. Une fiche d’évaluation complète de la douleur avec un plan de gestion de la douleur très détaillé est incluse dans ce protocole. Pour éviter la contamination croisée entre les plaies, une attention particulière doit être portée à l’application de la première couche du pansement sur chaque plaie séparément. Des précautions critiques doivent être prises lors de la manipulation de toutes les matières biologiques dangereuses et lors de la désinfection complète de l’équipement, des outils et de l’ensemble de la salle d’opération. L’application de plusieurs couches de pansement empêche le porc d’exposer les plaies pendant son effort pour frotter ou gratter le dos qui démange.
Le porc dans le modèle actuel n’était pas compromis par des troubles métaboliques sous-jacents (par exemple, le diabète) et, par conséquent, l’effet étudié était purement l’impact de l’infection du biofilm bactérien sur la cicatrisation des plaies. Cependant, le modèle se prête à l’induction du diabète (en utilisant la streptozotocine par exemple) et pourrait être utilisé pour étudier l’infection par le biofilm en relation avec un trouble métabolique sous-jacent. L’autre limite du modèle est le cadre d’infection contrôlée à l’aide de P. aeruginosa, une bactérie. On s’attend à ce que la microflore cutanée normale du porc se développe également dans la plaie et puisse avoir un impact sur la cicatrisation. Une analyse plus approfondie à l’aide de NGS ou d’autres techniques avancées pour délimiter le contenu microbien de la plaie est nécessaire. Le modèle actuel pourrait également être appliqué à des infections mixtes avec différentes espèces microbiennes (p. ex., fongiques, virales, etc.). Il s’agit d’un élément important, car les plaies cliniquement pertinentes sont susceptibles d’être peuplées de microbes mixtes, ce qui peut avoir un impact différentiel sur la cicatrisation des plaies.
Ce modèle présente de nombreux avantages potentiels, notamment la similitude avec la complexité et les séquelles à long terme des plaies chroniques humaines, le processus de brûlure automatisé et reproductible et l’utilisation d’espèces bactériennes cliniquement isolées. L’utilisation de multiples modalités d’imagerie non invasives représente une approche puissante pour recueillir des données physiologiques utiles caractérisant la plaie. Enfin, l’évaluation de la cicatrisation fonctionnelle des plaies via la restauration de la fonction barrière cutanée sur la base de la TEWL est essentielle. En conclusion, un protocole robuste, simple, détaillé et facile à utiliser pour développer une brûlure grave infectée par un biofilm à l’aide d’un système modèle porcin est présenté dans ce travail.
The authors have nothing to disclose.
Nous tenons à remercier le Laboratory Animal Resource Center (LARC) de l’Université de l’Indiana pour son soutien et les soins vétérinaires prodigués aux animaux pendant l’étude. Ce travail a été en partie soutenu par les subventions NR015676, NR013898 et DK125835 des National Institutes of Health et par la subvention W81XWH-11-2-0142 du ministère de la Défense. De plus, ce travail a bénéficié des prix suivants des National Institutes of Health : GM077185, GM069589, DK076566, AI097511 et NS42617.
Sedation | |||
Ketamine | Zoetis | 10004027 | 100mg/ml |
Telazol | Zoetis | 106-111 | 100mg/ml |
Xylazine | Pivetal | 04606-6750-02 | 100mg/ml Anased |
3ml syringe w/ 20g needle | Covidien-Monoject | 8881513033 | |
Winged infusion set 21g | Jorgensen Labs | J0454B | |
Anesthetic | |||
Isoflurane | Pivetal | 21295097 | |
Surgery | |||
Hair clippers | Wahl | 8787-450A | |
Nair | Church and Dwight Co. Inc | 70506572 | |
Chlorhexidine Solution | First Priority Inc. | 179925722 | |
70% Isopropyl Alcohol | Uline | S-17474 | |
0.9% Saline Solution | ICU Medical | RL-7282 | |
Non-woven gauze | Pivetal | 21295051 | |
Paper tape | McKesson | 455531 | |
2" Elastic tape | Pivetal | 21300869 | |
18-22g Intravenous Angiocath | SurVet | (01)14806017512306 | |
Spay hook | Jorgensen Labs | J0112A | |
Sterile lube | McKesson | 16-8942 | |
Laryngoscope | Jorgensen Labs | J0449S | |
Roll gauze | Pivetal | 21295032 | |
Endotracheal tube (7-9mm) | Covidien | 86112 | Shiley Hi-Lo Oral Nasal Tracheal Tube Cuffed |
15gtt/ml IV administration set | ICU Medical | 12672-28 | |
LRS 1000ml bag | ICU Medical | 07953-09 | |
Three Quarter Drape Sheet | McKesson | 16-i80-12110G | |
Analgesia | |||
Buprenorphine | RX Generics | 42023-0179-05 | 0.3mg/ml |
Fentanyl Transdermal | |||
Carprofen | 21294548 | Pivetal | 50mg/ml Levafen |
Bandaging | |||
Transparent film dressing 26×30 | Genadyne Biotechnologies | A4-S00F5 | |
Film dressing 4 x 4-3/4 Frame Style | McKesson | 886408 | |
Vetrap | 3M | 1410BK BULK | |
Elastic tape 4" | Pivetal | 21300931 | |
Kerlix Roll Gauze | Cardinal Health | 3324 | |
Imaging | |||
Canon EOS 80D | Canon | 1263C004 | |
Speedlight 600EX II-RT | Canon | 1177C002 | |
EFS 17-55mm Ultrasonic | Canon | 1242B002 | |
GE Logiq E9 | GE | 5197104-2 | |
ML6-15 Probe | GE | 5199103 | |
PeriCamPSI | Perimed | 90-00070 | |
DermaLab | Cortex Technologies Inc | 4608D78 | |
Biopsy/Tissue Collection | |||
6mm punch biopsy | Integra Lifesciences | 33-36 | |
bupivicaine 0.5% | Auromedics Pharma | 55150017030 | |
Size 10 Disposable Scalpel | McKesson | 16-63810 | |
Dissection scissors | Pivetal | 21294806 | |
Rat tooth thumb tissue forceps | Aesculap | BD512R | |
Non-adherent Dressing | Covidien | 2132 | Telfa |
50ml Conical tube | Falcon | 352070 | |
Eppendorf/microcentrifuge tube | Fisherbrand | 02-681-320 | |
OCT Cassette | |||
Non Woven Gauze 4×4 | Pivetal | 21295051 | |
Inoculum | |||
Low salt LB agar | Invitrogen | 22700-025 | |
Low salt LB broth | Fisher scientific | BP1427-500 | |
Petri plate | Falcon | REF-351029 | |
Polyprophyline round bottom tubes (14 ml) | Falcon | REF-352059 | |
Pseudomonas Agar Base (Dehydrated) | Thermo Scientific | OXCM0559B | |
LB Agar, powder (Lennox L agar) | Thermo Fisher Scientific (Life Technologies) | 22700025 | |
Gibco™ DPBS, calcium, magnesium | Gibco | 14040133 | |
Euthanasia | |||
18-22g Intravenous Angiocath | SurVet | (01)14806017512306 | |
Fatal Plus | Vortech Pharmaceuticals | 9373 |