JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

نموذج الخنازير لعدوى الأغشية الحيوية والجروح غير المرئية

Published: June 16, 2023
doi:
10.3791/65301
, , , , , ,
1Indiana Center for Regenerative Medicine & Engineering, Indiana University Health Comprehensive Wound Center, Department of Surgery,Indiana University School of Medicine

Summary

تشكل الجروح المزمنة المقاومة للمضادات الحيوية تهديدا كبيرا لنظام الرعاية الصحية. عدوى الأغشية الحيوية عنيدة وعدائية ويمكن أن تسبب نقصا في إغلاق الجرح الوظيفي. أبلغنا عن نموذج خنازير ذي صلة سريريا للجروح المزمنة كاملة السماكة المصابة بالأغشية الحيوية. هذا النموذج قوي للدراسات الميكانيكية وكذلك لاختبار التدخلات.

Abstract

تعد عدوى الأغشية الحيوية الرقيقة مساهما رئيسيا في مزمنة الجرح. يتطلب إنشاء عدوى الأغشية الحيوية التجريبية ذات الصلة سريريا بمشاركة الجهاز المناعي المضيف. لا يمكن أن تحدث التغيرات التكرارية في المضيف والممرض أثناء تكوين مثل هذا الغشاء الحيوي ذي الصلة سريريا إلا في الجسم الحي. يتم التعرف على نموذج جرح الخنازير لمزاياه كنموذج قوي قبل السريرية. هناك العديد من الأساليب المبلغ عنها لدراسة الأغشية الحيوية للجروح. الأنظمة في المختبر وخارج الجسم الحي ناقصة من حيث الاستجابة المناعية للمضيف. تتضمن الدراسات قصيرة المدى في الجسم الحي استجابات حادة ، وبالتالي لا تسمح بنضج الأغشية الحيوية ، كما هو معروف أنه يحدث سريريا. تم الإبلاغ عن أول دراسة طويلة الأجل للغشاء الحيوي لجرح الخنازير في عام 2014. اعترفت الدراسة بأن الجروح المصابة بالأغشية الحيوية قد تغلق على النحو الذي يحدده قياس المستويات ، لكن وظيفة حاجز الجلد في الموقع المصاب قد تفشل في استعادتها. في وقت لاحق ، تم التحقق من صحة هذه الملاحظة سريريا. وهكذا ولد مفهوم إغلاق الجرح الوظيفي. يمكن اعتبار الجروح المغلقة ولكن تعاني من نقص في وظيفة حاجز الجلد على أنها جروح غير مرئية. في هذا العمل ، نسعى إلى الإبلاغ عن التفاصيل المنهجية اللازمة لإعادة إنتاج نموذج الخنازير طويل الأجل لإصابة الحروق الشديدة المصابة بالأغشية الحيوية ، والتي تعتبر ذات صلة سريريا ولها قيمة متعدية. يوفر هذا البروتوكول إرشادات مفصلة حول إنشاء عدوى بيوفيلم للجرح لمدة 8 أسابيع باستخدام P. aeruginosa (PA01). تم إنشاء ثمانية جروح حروق كاملة السماكة بشكل متماثل على ظهر الخنازير البيضاء المحلية ، والتي تم تلقيحها ب (PA01) في اليوم 3 بعد الحرق. بعد ذلك ، تم إجراء تقييمات غير جراحية لالتئام الجروح في نقاط زمنية مختلفة باستخدام تصوير البقع بالليزر (LSI) ، والموجات فوق الصوتية عالية الدقة (HUSD) ، وفقدان الماء عبر البشرة (TEWL). كانت جروح الحروق الملقحة مغطاة بضمادة من أربع طبقات. الأغشية الحيوية ، كما تم تأسيسها وتأكيدها هيكليا من قبل SEM في اليوم 7 بعد التلقيح ، عرضت إغلاق الجرح الوظيفي للخطر. وهذه النتيجة السلبية عرضة للعكس استجابة للتدخلات المناسبة.

Introduction

عدوى الأغشية الحيوية تعقد الحروق والجروح المزمنة وتسبب المزمنة1،2،3،4،5. في علم الأحياء الدقيقة ، تتم دراسة آليات الأغشية الحيوية في المقام الأول ، مع التركيز على الميكروبات 1,6. الدروس المستفادة من هذه الدراسات ذات أهمية قصوى من وجهة نظر العلوم البيولوجية ولكنها قد لا تنطبق بالضرورة على الأغشية الحيوية المسببة للأمراضذات الصلة سريريا 6،7،8. يجب أن تشمل المجاميع الهيكلية للغشاء الحيوي ذات الصلة سريريا العوامل الميكروبية وكذلك العوامل المضيفة8،9،10. تسمح هذه البيئة المكروية بإدراج التفاعلات التكرارية بين المضيف والميكروب ، والتي تعتبر ضرورية لتطوير غشاء حيوي ذي صلة سريريا 7,8. في مثل هذه العملية ، تعد مشاركة الخلايا المناعية والعوامل المنقولة بالدم أمرا بالغ الأهمية11,12. تحدث التفاعلات بين المضيف والميكروب الكامنة وراء الأغشية الحيوية المسببة للأمراض السريرية ، كما تظهر في الجروح المزمنة ، على مدى فترة طويلة من الزمن. وبالتالي، فإن أي نهج تجريبي يهدف إلى تطوير نموذج ذي صلة بالترجمة للعدوى بالأغشية الحيوية يجب أن يأخذ في الحسبان هذه العوامل. لذلك ، سعينا إلى تطوير نموذج عدوى بيوفيلم مزمن للخنازير قابل للتكرار سريريا.

في حين أن الدراسات البشرية تمثل بوضوح أفضل نهج لدراسة نتائج الشفاء ، إلا أنها غالبا ما لا تكون الأنسب لمعالجة الآليات الأساسية والنماذج الميكانيكية الجديدة. تحد المخاوف الأخلاقية من استخدام تصميمات الدراسة التي تتطلب جمع خزعات متعددة من جرح مزمن في نقاط زمنية مختلفة. لذلك ، من الأهمية بمكان أن يكون لديك نموذج حيواني راسخ وقابل للتكرار لتمكين الدراسات الغازية للفحص الشامل لمصير الأغشية الحيوية 7,13. يعتمد اختيار النموذج الحيواني على عدة عوامل ، بما في ذلك الأهمية العلمية / الانتقالية والخدمات اللوجستية. من المسلم به على نطاق واسع أن نظام الخنازير هو النموذج التجريبي الأكثر قيمة من الناحية التحويلية لدراسة جروح الجلد البشري7. وهكذا ، فإن هذا العمل يبلغ عن نموذج خنازير راسخ لإصابة الحروق كاملة السماكة المصابة بالأغشية الحيوية. يستند هذا العمل إلى العديد من المنشورات الأصلية الواردة في الأدبيات2،7،13،14،15،16،17. في هذه الدراسة ، تم اختيار عزل سريري ل Pseudomonas aeruginosa المقاوم للأدوية المتعددة (PA01) لإصابة الجرح. P. aeruginosa هو سبب شائع لالتهابات الجروح2،18،19،20. إنها بكتيريا سالبة الجرام يصعب علاجها بسبب مقاومتها لبعض المضادات الحيوية 11،19،21. لم يتضمن أي من نماذج الأغشية الحيوية للخنازير التي تم الإبلاغ عنها حتى الآن دراسات طويلة الأجل لمدة 8 أسابيع22،23،24،25،26. الجروح المزمنة هي تلك التي تظل مفتوحة لمدة 4 أسابيع أو أكثر14،27،28. لا توجد نماذج بيوفيلم مزمنة أخرى للجروح تم الإبلاغ عنها في الأدبيات. يتناول هذا العمل مفهوم إغلاق الجرح الوظيفي2،7،13،15،17،29.

Protocol

تم إجراء جميع الدراسات على وفقا للبروتوكولات المعتمدة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (IACUC) # 21147. أجريت الدراسة في مركز الموارد الحيوانية المختبرية (LARC) ، جامعة إنديانا. استخدمنا خنزير أبيض محلي (70-80 رطلا) في هذا البروتوكول. 1. التأقلم مع عند وصول الخنازير إلى المنشأة ، قم بإيواء بشكل فردي داخل نفس الغرفة لمدة 3 أيام على الأقل للتأقلم والتفاعل الاجتماعي. إطعام الخنازير اتباع نظام غذائي متوازن. حدد الكمية التي يتم تغذيتها بناء على الوزن ، واتبع توصيات الشركة المصنعة. تأكد من صيام لمدة 6-12 ساعة قبل الإجراء لمنع الغثيان والقيء وشفط سوائل المعدة أثناء التخدير. 2. إعداد غرفة الجراحة جهز آلة التخدير ، وتأكد من أنها جاهزة مع دائرة إعادة التنفس. رتب غرفة الجراحة ، كما هو موضح أدناه (الشكل 1 أ).قم بتغطية طاولة الإجراء بستارة معقمة ، وضع بطانية ماء متداولة تحتها للمساعدة في التنظيم الحراري. قم بإعداد طاولة بها لوازم الحث ومواد التحضير للجراحة. قم بإعداد طاولة مع أجهزة الموقد وصناديق التحكم. قم بإعداد جهاز التصوير، وتأكد من تشغيله. 3. تخدير الخنزير قم بتخدير الخنزير بالحقن العضلي ل TKX (تيلازول 4.4 مجم / كجم ؛ كيتامين 2.2 مجم / كجم ؛ زيلازين 2.2 مجم / كجم) بجرعة 1 مل / 50 رطلا. الحفاظ على الخنزير في غرفة الإجراءات على 1 ٪ -3 ٪ إيزوفلوران تسليمها عن طريق قناع. إدارة المسكنات (قبل الجراحة) للخنازير وفقا لبروتوكول IACUC ؛ وفيما يلي بعض الأمثلة: البوبرينورفين 0.3 مغ/مل، 0.01-0.05 مغ/كغ بالحقن العضلي؛ كاربروفين 50 ملغ / مل ، 4 ملغ / كغ بالحقن العضلي أو SQ. الفنتانيل عبر الجلد 100 ميكروغرام / ساعة وضعت على صيوان الأذن; جابابنتين 300 ملغ كبسولات، 3-10 ملغ/ كغ الفموي.ملاحظة: بالنسبة لجميع إجراءات الحروق والخزعة ، سيتم إعطاء جرعة واحدة من جابابنتين في اليوم السابق للجراحة وسيتم إعطاء جرعة واحدة من كاربروفين في يوم الإجراء. لإجراء الحرق الرئيسي ، سيتم وضع رقعة الفنتانيل ، وسيتم إعطاء 1 جرعة كاملة من البوبرينورفين أثناء التحضير الجراحي. 4. تحريض التخدير تعقيم الأذن بالتناوب 2 ٪ فرك الكلورهيكسيدين والكحول ثلاث مرات على الأقل. أدخل A 22-18 G 1 في قسطرة وريدية في وريد الأذن الهامشي ، وتأكد من تدفق الدم. اغسل القسطرة بالمحلول الملحي ، وأصلح القسطرة بشريط جراحي (الشكل 1 ب). تنبيب الخنزير بأنبوب رغامي بحجم مناسب (7-9 مم) بمجرد تحقيق استرخاء العضلات عن طريق استنشاق التخدير عبر القناع. تحقق من استرخاء العضلات عن طريق فقدان نغمة الفك وملاحظة رد الفعل الجفني.افتح الأنبوب ، واختبر تسرب الكفة باستخدام حقنة من الهواء. أدخل الأنبوب بمساعدة منظار الحنجرة30. قم بنفخ الكفة وتأمين الأنبوب بمجرد تأكيد وضعه بشكل صحيح. ربط الخنزير إلى دائرة إعادة التنفس.ملاحظة: يتم ربط الأنبوب في مكانه فوق الخطم ، ويتم استخدام شاش ملفوف لتثبيته. يتم إجراء تسمع الصدر باستخدام سماعة الطبيب لتأكيد الموضع الصحيح للأنبوب.ملاحظة: أثناء التخدير ، يتم توفير الهواء كل 5-10 دقائق عن طريق إغلاق الصمام المنبثق والضغط على كيس إعادة التنفس حتى يصل مقياس ضغط الضغط إلى 20 مم / زئبق لمنع انخماص الموضعية. مراقبة وعمق التخدير.قم بتوصيل الخنزير بشاشة متعددة المعلمات. ستقوم الشاشة باستمرار بقراءة تشبع الأكسجين (SpO 2) ومعدل النبض وثاني أكسيد الكربون المد والجزر (EtCO2) ومعدل التنفس ودرجة الحرارة. سجل العناصر الحيوية كل 10 دقائق طوال العملية. قم بتقييم عمق التخدير عن طريق اختبار ردود الفعل للألم بقرصة إصبع القدم في الساق الخلفية قبل بدء الجرح.ملاحظة: عند الضرورة ، اضبط مبخر التخدير لإدارة تخدير إضافي ، أو انتظر بضع دقائق. تحقق من ردود الفعل الألم وردود الفعل الجفنية بانتظام طوال الجراحة. 5. إعداد لجرح الحروق افصل الخنزير عن جهاز التخدير ، وانقله إلى طاولة الإجراءات. ضع الخنزير في وضع الاستلقاء القصي ، وتأكد من تأمين جميع الخطوط والأنابيب المتصلة (الشكل 1C). أعد توصيل الخنزير بجهاز التخدير ، وحافظ على O2 عند 0.8-1.5 لتر / دقيقة والإيزوفلوران عند 1٪ -3٪ حتى نهاية الإجراء. تطبيق السوائل الوريدية (LRS) على الخنزير بمعدل تنقيط 8-10 مل/كغ/ساعة. راقب التخدير كما في الخطوة 4.3. 6. إعداد مطهر ووضع علامات على موقع حرق الجلد تحضير منطقة الجرح عن طريق الحلاقة ووضع كريم إزالة الشعر ، كما هو موضح أدناه (الشكل 2).حلق ظهر الخنزير في منطقة بعرض 25 سم تقريبا من العمود الفقري وصولا إلى الإبط على كلا الجانبين باستخدام كليبرز كهربائي. ضعي كريم إزالة الشعر على المنطقة المقطوعة واتركيه لمدة 3-7 دقائق. إزالة كريم جنبا إلى جنب مع الشعر باستخدام مناشف ماصة نظيفة. تحضير موقع الحرقافرك المنطقة المراد جرحها باستخدام مقشر الكلورهيكسيدين المتناوب بنسبة 2٪ وكحول الأيزوبروبيل بنسبة 70٪ ثلاث مرات على الأقل لمدة 5 دقائق تقريبا. تأكد من تطبيق المقشر في نمط عين الثور (بدءا من المركز والانتقال إلى الخارج في دوامة) من قبل أفراد يرتدون قفازات معقمة. ضع علامة على مواقع الجرح باستخدام قالب حرق معقم وعلامة جلدية جراحية (الشكل 2 ب). ضع علامة على ستة إلى ثمانية جروح (2 بوصة × 2 بوصة) بشكل متماثل على الظهر. قم بتغطية المناطق المحيطة بالمواقع المحددة بستارة معقمة لتقليل التلوث (الشكل 2C). 7. حرق إجراء الجرح استخدم جهاز حرق ، مثل موقد مخصص مصنع داخليا يتكون من كتلة 2 بوصة × 2 بوصة من الفولاذ المقاوم للصدأ (الوزن: 352 جم) متصلة بقلم معدني ، وميكروستات إلكتروني ، وميزان إلكتروني (الوزن الإجمالي: 1,714 جم ؛ الشكل 3).اضبط الموقد على درجة الحرارة المطلوبة. اضبط درجة الحرارة المستهدفة للجروح كاملة السماكة عند 150 درجة مئوية (الشكل 3 أ). للقيام بذلك ، اضبط نقطة الضبط (SP) على وحدة التحكم على 150 درجة مئوية. اضبط نقطة الضبط المنخفضة على 145 درجة مئوية ونقطة الضبط العالية على 155 درجة مئوية (الشكل 1 د). قم بإنشاء جرح حرق كامل السماكة يبلغ 2 بوصة × 2 بوصة باستخدام كتل ساخنة من الفولاذ المقاوم للصدأ متصلة بجهاز الحرق ووضعها على الجلد لمدة 60 ثانية (الشكل 3 ب ، ج). أثناء تطبيق الحرق ، استخدم الميزان الإلكتروني لضمان تطبيق ضغط موحد بواسطة الموقد. 8. تقييم وتصوير جروح الحروق التصوير الرقميتخيل الجروح باستخدام كاميرا DSLR وتركيز بؤري قصير للظهر كهربائي (EFS) وعدسة بزاوية عريضة بالموجات فوق الصوتية مقاس 17-55 مم ومصباح يدوي. التقط صورة رقمية للخنزير بالكامل ، بما في ذلك لافتة مع تحديد هوية الخنزير والنقطة الزمنية والتاريخ. بعد ذلك ، التقط صورا لكل جرح على حدة تظهر لافتة بها معرف الخنزير ومعرف الجرح والنقطة الزمنية والمسطرة. احسب مساحة الجرح كنسبة مئوية من حجم الجرح الأصلي في كل نقطة زمنية من التجميع حتى اليوم 56.ملاحظة: في هذا العمل ، تم حساب منطقة الجرح في كل نقطة زمنية (d0 و d7 و d14 و d28 و d56) كنسبة مئوية من منطقة الجرح الأصلية في d0. التصوير بالليزر للبقع (LSI)لتصوير البقع بالليزر، استخدم جهاز تصوير نضح الدم استنادا إلى تقنية تحليل تباين بقع الليزر (LASCA) لتقييم نضح الأوعية الدموية الدقيقة للجرح في الوقت الفعلي. التقط صورا لجميع الجروح في تسجيل واحد. اضبط القيمة المقاسة لمسافة العمل من كاميرا الليزر إلى الجرح بحيث تكون متسقة لتصوير كل جرح (الشكل 4 أ). سجل التروية بسلسلة من الصور التي تم التقاطها على مدى 10-15 ثانية. بعد تصوير الجرح، يتوقف التسجيل مؤقتا، ويستأنف التسجيل بمجرد ضبط الكاميرا للجرح التالي. في كل مرة يتوقف فيها التسجيل مؤقتا ، تتم إضافة علامة لتحديد الجرح. فقدان الماء عبر البشرة (TEWL)قم بقياس TEWL لكل جرح باستخدام وحدة قياسية ومسبار TEWL وبرنامج (الشكل 4B). لكل جرح ، ضع غطاء مسبار نظيف على طرف المسبار ، والذي سيكون ملامسا لأنسجة الجرح. ضع المسبار برفق وبشكل متساو على الجلد ، وابدأ القراءة بالضغط على زر البدء في الوحدة. قم بقياس كل جرح خمس مرات ، أولا في الوسط ثم في كل زاوية. بعد ذلك ، قم بتصدير جميع القراءات إلى جدول بيانات (الشكل 4 ب). الموجات فوق الصوتية التوافقية (HUSD)قم بإجراء رسم خرائط HUSD عن طريق مسح الجرح باستخدام مسبار الموجات فوق الصوتية (الولايات المتحدة) من خط الوسط (العمود الفقري) بدءا من الجلد الطبيعي باتجاه الجانب الجانبي للخنزير حيث يوجد جلد طبيعي مرة أخرى. اتبع نمط المسح هذا لكل جرح في كل من الوضع B ووضع التصوير الإلستوجرافي للأنسجة باستخدام جهاز الموجات فوق الصوتية (الشكل 4C).لمسح الوضع B ، ضع جل الموجات فوق الصوتية المعقم على منطقة الجرح ، وقم بتطبيق البعض على مسبار ML-615 عالي الدقة. أضف تعليقا توضيحيا على كل تسجيل باستخدام ملصق تعريف الجرح. ابدأ التسجيل ، وحرك المسبار ببطء من خط الوسط أسفل الجرح حتى يتم الوصول إلى الجلد الطبيعي على الجانب الآخر.ملاحظة: بعد الانتهاء من المسح الضوئي، يتم حفظ التسجيل وتصديره من الجهاز لتحليله. بالنسبة للتصوير الإلستوجرافي ، قم بتبديل جهاز الموجات فوق الصوتية إلى وضع elasto بالضغط على زر Elasto . امسح الجرح مرة أخرى بنفس الطريقة كما في المسح الضوئي في الوضع B ، مع التأكد من الحفاظ على ضغط موحد للمسبار للسماح لمؤشر لون التصوير الإلستوجرافي (الأشرطة الخضراء) بالبقاء مرئيا طوال التسجيل.ملاحظة: يمكن تحديد الضغط المناسب بواسطة شريط المقياس الموجود على التسجيل ، والذي يظهر باللون الأخضر عند إجراء الاتصال الصحيح (الشكل 4D). قم بتغيير التعليق التوضيحي بعد تصوير كل جرح في كل من الوضع B ووضع elasto (تسجيلان لكل جرح). قم بتغيير التعليق في البرنامج لتضمين معلومات الجرح التالي ، وكرر العملية للجروح اللاحقة. 9. الضمادات وخلع الملابس قم بتغطية جروح الحروق بشكل فردي بضمادات شفافة أو ضمادة الاختبار (الشكل 5 أ ، ب). ضع ضمادة شفافة أكبر على منطقة الجرح بأكملها (الشكل 5 ج). ضع طبقة ثانية من الشاش الملفوف بشكل فضفاض حول جذع الخنزير بالكامل لامتصاص أي إفرازات سائلة تأتي من الجروح. لف الخنزير ذهابا وإيابا من جانبه إلى ظهره قليلا للف مادة الضمادات حول الخنزير. قم بتغطية الشاش بشكل فضفاض بطبقة من الضمادة المرنة المرنة (الشكل 5 د). تأكد من أن الضمادة ليست ضيقة جدا ، لأن تطبيقها بإحكام شديد يمكن أن يقيد التنفس ويضغط على البطن ، مما قد يؤدي إلى هبوط المستقيم أو مضاعفات مختلفة.ملاحظة: الضمادة المرنة قابلة للتمدد ويمكن بسهولة شدها أثناء التطبيق. يمكن أن يساعد سحبها من اللفة والسماح لها بالاستلقاء على حافة الغلاف السابق في منع الإفراط في الشد. قم بتغطية الضمادة المرنة بطبقة أخيرة من 4 في شريط مرن (الشكل 4E). مرة أخرى ، تأكد من أن التطبيق ليس ضيقا جدا ، ولكن تأكد من تثبيت الضمادة من الحافة العلوية والسفلية لمنعها من الانزلاق لأسفل أثناء تحرك الخنزير بعد الإجراء. 10. استعادة ورعاية ما بعد الجراحة الانتعاشتوقف عن استخدام غاز التخدير عند الانتهاء من الجرح وإجراء التصوير والضمادات. اسمح للخنزير بالبقاء على الأكسجين لمدة 5 دقائق على الأقل. انقل الخنزير ، بعد العودة إلى العلبة الأولية ، من طاولة النقل / الرفع إلى حصيرة استعادة الرغوة في القفص. ارفع السقاية الأوتوماتيكية ، وقم بإزالة وحدة التغذية j لمنع إصابة الخنزير أثناء الشفاء. قم بتغطية الخنزير بالبطانيات (بما في ذلك بطانية الهواء الدافئ) في حالة وجود انخفاض حرارة الجسم. مراقبة وتسجيل العناصر الحيوية بما في ذلك درجة الحرارة والنبض ومعدل التنفس و SpO2 كل 10-15 دقيقة. راقب الخنزير باستمرار حتى يتمكن من الحفاظ على الاستلقاء القصي بشكل مستقل. بمجرد استعادة الخنزير بالكامل ، قم بخفض ماء الحلمة ، ومن ثم يمكن أيضا إطعام الخنزير. تقييم الألمقم بإجراء تقييم للألم بعد الجراحة باستخدام نموذج تسجيل الألم المعدل في غلاسكو. تأكد من إكمال تقييمات الألم من قبل المختبر أو موظفي مركز أبحاث المختبر كل 12 ساعة على الأقل لمدة 3-4 أيام بعد الجراحة. يتم تحديد وتيرة تسجيل الألم من قبل الطبيب البيطري المعالج. إذا سجل أعلى من 5 ، فقم بتطبيق تسكين الإنقاذ (البوبرينورفين أو الهيدرومورفون). يجب توفير التسكين عن طريق تطبيق جرعة من البوبرينورفين 0.01-0.05 ملغ/كغ بالحقن العضلي قبل الإجراء، مع إعطاء جرعة ثانية بعد 8-12 ساعة. ضع لصقة فنتانيل (100 ميكروغرام / ساعة) على صيوان الأذن قبل جرح الحرق. يتم حقن كاربروفين 4 ملغ/ كغ بالحقن العضلي أو SQ قبل الإجراء، ثم مرة واحدة يوميا بالحقن العضلي، أو المتر المربع، أو الفموي لمدة يومين أو حسب توجيهات الطبيب البيطري في مركز أبحاث المختبر. يتم إعطاء جابابنتين 3-10 ملغ/كغ عن طريق الفم، مع إعطاء جرعة في اليوم السابق للإجراء، في صباح العملية، في المساء التالي للإجراء، ثم كل 12 ساعة لمدة 3-5 أيام. النظام الغذائيتأكد من استعادة الخنازير ، ثم السماح بحرية الوصول إلى الماء والغذاء وفقا لحصتها القائمة على الوزن مرتين يوميا. توفير إثراء غذائي (الفواكه والخضروات الطازجة ، والفواكه المجمدة ، وأعشاب من الفصيلة الخبازية ، واللبن ، والحلوى ، وما إلى ذلك) ، واستخدامها لإغراء الأكل إذا لوحظ انخفاض الشهية. تغيير الملابسقم بتغيير الضمادات مرة واحدة على الأقل أسبوعيا أو أكثر إذا أصبحت الضمادات متسخة أو لاستيعاب استراتيجيات العلاج. قم بتغيير الضمادات بعد التصوير بينما لا تزال تحت التخدير ، أو قم بتخدير الخنزير باستخدام TKX فقط لتغيير الضمادة. لاستبدال الضمادة ، ابدأ بإزالة الضمادة المتسخة بعناية باستخدام مقص ضمادة Lister أو مقصات الصدمات ، مع الانتباه إلى عدم السماح للجزء الخارجي من الضمادة بالتلامس مع الجروح. نظف المنطقة المحيطة بالجروح إذا لزم الأمر باستخدام 0.9٪ كلوريد الصوديوم على شاش نظيف ، وجفف المنطقة برفق. اتبع خطوات الإجراء الخاصة بالضمادات الموضحة في القسم 9.ملاحظة: إذا تم تطبيق ضمادات تجريبية ، فيمكن تطبيقها قبل تغطية الجروح بضمادة الفيلم الشفاف. تردد التصويرالحصول على التصوير (الصور الرقمية ، LSI ، TEWL ، و HUSD) في نقاط زمنية مختلفة طوال فترة الدراسة. اجمع بيانات التصوير في اليوم -3 (جرح الحروق) واليوم 0 (التلقيح) واليوم 7 واليوم 14 واليوم 28 واليوم 35 واليوم 56 بعد التلقيح. 11. تحضير الأغشية الحيوية والتلقيح إعداد اللقاحقم بإعداد لوحة بداية من مخزون الفريزر الجلسرين من Pseudomonas aeruginosa (PA01) لثقافة نقية للبكتيريا. قم بزراعة P. aeruginosa في أجار Luria-Bertani منخفض الملح (LBA) ، واحتضانه عند 37 درجة مئوية طوال الليل. قم بتلقيح 5 مل من مرق Luria-Bertani قليل الملح (LBB) بمستعمرة P. aeruginosa واحدة في اليوم التالي ، واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع الهز عند 200 دورة في الدقيقة. للحصول على خلايا الطور اللوغاريتمي ، قم بتلقيح 200 ميكرولتر من المزرعة الليلية إلى 5 مل من LBB ، واحتضانها في شاكر عند 200 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة 2.5 ساعة. قم بقياس الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر (OD600) باستخدام مقياس الطيف الضوئي. تحضير التخفيفات التسلسلية حتى 1 × 10−9 باستخدام 100 ميكرولتر من الثقافة في 900 ميكرولتر من LBB المعقم.ملاحظة: بدأنا بعينات غير مخففة وانتهينا ب 1 × 10 7 CFU / mL.حصلنا على مستعمرات قابلة للعد في التخفيف 1 × 107 ، لذلك اعتبرنا هذا التخفيف بمثابة تخفيف النهاية. يوزع 100 ميكرولتر من كل تخفيف على LBA ، ويحتضن طوال الليل عند 37 درجة مئوية. وفقا للبروتوكولات الميكروبيولوجية القياسية ، استخدم التخفيفات التي تظهر مستعمرات قابلة للعد (30-300) لعدد المستعمرات ، واحصل على وحدات تشكيل المستعمرة (CFU). تلقيح الجرحتلقيح 200 ميكرولتر من المزرعة الليلية إلى 5 مل من مرق LB ، واحتضانها في شاكر عند 37 درجة مئوية لمدة 2.5 ساعة. قم بقياس الكثافة البصرية للثقافة النهارية عند 600 نانومتر (OD600). لتلقيح PA01 ، استخدم 3 × 10 8 CFU / مل (يتم تلقيح 250 ميكرولتر من 1 × 108 CFU / mL PA01 لكل جرح). نقل اللقاح إلى منشأة في حاوية بيولوجية. قم بتفريق اللقاح عبر سطح الجروح المكشوفة في اليوم 3 بعد الحرق باستخدام ماصة ، وانتشر بالتساوي باستخدام مفرشة يمكن التخلص منها (الشكل 6). أبق الجروح مفتوحة لمدة 15 دقيقة تقريبا قبل الضمادات.ملاحظة: تتم جميع العمليات الجراحية والتلقيح وخزعات الأنسجة والتصوير والضمادات تحت التخدير العام كما في القسمين 3 و 4. تأكيد إنشاء العدوىملاحظة: للتأكد من أن الجروح قد أصيبت بالعدوى بنجاح بعد التلقيح ، يتم استخدام عدة طرق ، ومقارنة عينات الجرح بالعينات التي تم جمعها من الجلد الطبيعي ؛ فيما يلي بعض الأمثلة.للتحليل القائم على علم الأمراض للعينات التي تم جمعها في نقاط زمنية مختلفة ، استخدم عدد وحدات تكوين المستعمرة لتقدير العدوى (CFU; الشكل 7E، F).جمع 6 مم من أنسجة الجرح عن طريق لكمة خزعة. قم بتسمية ووزن الأنابيب الفارغة ذات القاع المستدير سعة 5 مل. نقل العينات إلى الأنابيب ، ووزن الأنابيب مع العينات. نرد الأنسجة بمشرط على سطح معقم. قم بتنفيذ جميع الخطوات في غطاء BSL2.ملاحظة: للتأكد من أن الأنسجة متجانسة بسهولة ، يجب أن يكون الحجم صغيرا جدا (ولكن لا يقل عن 0.5 مم) ضع العينة في الأنبوب ، وأضف 1 مل من برنامج تلفزيوني. خلط وطحن الأنسجة باستخدام مسبار طحن الأنسجة الصلبة. تمييع تسلسليا (غير مخفف إلى 1 × 10−5) التجانس ، ولوحة 50 ميكرولتر من كل تخفيف في الوسائط الانتقائية (Pseudomonas Isolation Agar ، PIA) وغير الانتقائية (LBA). احتضان جميع التخفيفات تحت الظروف الهوائية عند 37 درجة مئوية لمدة 18-24 ساعة. صور اللوحات مع ظروف الإضاءة المناسبة. حدد الألواح التي تحتوي على 30-300 مستعمرة ، إذا لم تصل أي من اللوحات إلى هذا التركيز ، فاستخدم اللوحة غير المخففة. استخدم ImageJ لحساب أرقام المستعمرات ، وحساب CFU لكل لوحة بضرب متوسط القيمة في عامل التخفيف النهائي. احصل على الصور من العينات التي تم جمعها من اليوم 7 بعد التلقيح والنقاط الزمنية الأخرى باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) لتأكيد وجود الأغشية الحيوية البكتيرية (الشكل 7G).ملاحظة: تم اختيار اليوم 7 بعد التلقيح لأنه يوم إنشاء عدوى الأغشية الحيوية وبداية تليين الحروق ، مما يسمح باختراق موجات الولايات المتحدة ، وبالتالي تصور الأنسجة العميقة. في الشكل 4 ، تحقق من صورة جرح الحرق في اليوم 3 في الولايات المتحدة ، والتي توضح الشار الجلدي السميك الذي يمنع موجات الولايات المتحدة من المرور إلى الأنسجة العميقة. قم بتلطيخ أقسام خزعات الجرح بأجسام مضادة محددة ضد P. aeruginosa لتأكيد وجود بكتيريا معينة ، كما هو موضح في منشور سابق13 (الشكل 7H). إجراء تسلسل الجيل التالي (NGS) ، كما هو منشور في Sinha et al.31. قم بقياس البكتيريا 16srRNA من الجروح المصابة وعينات الجلد الطبيعية غير المصابة التي تم جمعها في نقاط زمنية مختلفة بدءا من اليوم 7 بعد التلقيح حتى نهاية الدراسة. 12. جمع الخزعة اجمع خزعات الأنسجة لتحليلها بعد التصوير في اليوم 7 واليوم 14 واليوم 28 واليوم 56 بعد التلقيح. جمع الخزعات من كل جرح مرة واحدة فقط لتقليل التدخل في عملية الشفاء.ملاحظة: تتم جميع العمليات الجراحية والتلقيح وخزعات الأنسجة والتصوير والضمادات تحت التخدير العام كما في القسمين 3 و 4.تسلل المنطقة المحيطة بالجرح بنسبة 0.5٪ بوبيفاكايين. قم بقص شريط بعرض 3-4 مم من حافة الجرح إلى الأخرى ، مع الحفاظ على هوامش صغيرة من الجلد الطبيعي في كلا الجانبين ، باستخدام مشرط يمكن التخلص منه بشفرة مقاس 10. ضع الشريط في أنبوب مخروطي مكتوب عليه مملوء بنسبة 4٪ فورمالين مخزن للتثبيت.ملاحظة: بالنسبة للتصوير المبكر وإجراءات الخزعة ، سيتم إعطاء جرعة كاملة من البوبرينورفين أثناء التحضير الجراحي. بالنسبة لإجراءات الخزعة المتأخرة ، سيتم إعطاء نصف جرعة من البوبرينورفين أثناء التحضير الجراحي. بعد كل إجراءات الحروق والخزعة ، سيتم إعطاء جابابنتين BID لمدة تصل إلى 7 أيام كما ينصح الطبيب البيطري المعالج. سيتم إعطاء كاربروفين لعدة أيام بعد العملية أو كما ينصح الطبيب البيطري المعالج. قطع خزعة لكمة 6 مم من الجرح (إما من سرير الجرح أو حافة الجرح). جمع من حافة الجرح ، بما في ذلك جزء من الجلد الطبيعي وسرير الجرح ، لأنواع مختلفة من التحليل. قم بإزالة العينة باستخدام ملقط معقم ومقص تشريح. ضع عينة الخزعة في الأنبوب أو الكاسيت المناسب للمعالجة والتحليل. بالنسبة ل CFU و SEM و RNA و FPPE ، احتفظ بالعينات في أنابيب ذات مخزن مؤقت مناسب. على سبيل المثال ، يمكن وضع العينات في OCT في أشرطة للفحص المجهري لالتقاط الليزر (LCM) والكيمياء الهيستولوجية المناعية (IHC). تحقيق الارقاء بعد جمع العينات عن طريق الضغط بلطف على الجرح بشاش معقم. قم بتغطية الجرح بضمادة غير ملتصقة وضمادة كما في القسم 9. 13. القتل الرحيم وجمع الأنسجة قم بتخدير الخنزير في يوم القتل الرحيم باستخدام TKX ، وتخدير الأيزوفلوران. ضع قسطرة وريدية في وريد الأذن الهامشي باتباع الخطوات الموضحة في القسم 3. تنبيب الخنزير باتباع الخطوات الواردة في القسم 4. قم بإزالة الضمادة بمجرد تخدير الخنزير ، ونظف المنطقة المحيطة بالجروح. التصوير الرقمي الكامل ، LSI ، TEWL ، والتصوير HUSD. اجمع العينات من الجروح والجلد الطبيعي باتباع الخطوات الموضحة في القسم 12. بمجرد جمع جميع العينات المطلوبة ، قم بالقتل الرحيم للخنزير بشكل إنساني بينما لا يزال تحت التخدير عن طريق الحقن في الوريد لمحلول القتل الرحيم المتاح تجاريا (بنتوباربيتال الصوديوم). استخدم سماعة الطبيب للتسمع لتأكيد توقف ضربات القلب والتنفس التلقائي. إجراء طريقة ثانوية للقتل الرحيم ، كما هو مطلوب من قبل SOM IACUC ، باستخدام مشرط للحث على استرواح الصدر. نقل جثة الخنزير إلى برميل ، ونقلها إلى الثلاجة ليتم التقاطها لحرقها.

Representative Results

تم استخدام جهاز حرق موحد لإنشاء جروح حروق كاملة السماكة عند 150 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ، مما أدى إلى حرق عميق متجانس مع هامش موحد من الحمامي والالتهاب (الشكل 3 والشكل 7). تلقى كل خنزير ثمانية جروح حروق كاملة السماكة على ظهره ، كما هو موضح في الشكل 3 ج. أظهر التقييم غير الجراحي في الوقت الفعلي لجروح الحروق بواسطة الموجات فوق الصوتية عالية الدقة في الوضع B لتأكيد عمق الجرح وتطور التئام الجروح بمرور الوقت تدمير جميع طبقات الجلد حتى الدهون تحت الجلد (الشكل 4). تم استخدام التصوير بالليزر للبقع (LSI) لمزيد من توصيف نضح الجرح (الشكل 4 أ). أظهرت جروح الحروق غشاء قيحي سميك على سطح الجرح بحلول اليوم 7 بعد التلقيح ، مما يؤكد العدوى وإنشاء الغشاء الحيوي لجرح الحرق (الشكل 7 أ). أظهر القياس الرقمي زيادة في مساحة الجرح في اليوم 3 بعد التلقيح باستخدام PAO1 بسبب الاستجابة الالتهابية في موقع الجرح والهوامش (الشكل 7 أ ، ب). على الرغم من أن منطقة الجرح بدأت في الانكماش بحلول اليوم 14 بعد التلقيح ، فقد لوحظ التئام غير مكتمل إلى ما يقرب من 25٪ من حجم الجرح الأصلي في اليوم 56 ، مما يشير إلى مزمنة الجروح (الشكل 7 ب). تم تأكيد مزمنة الجروح وضعف التئام الجروح من قبل TEWL ، والتي أظهرت فقدان الماء عبر البشرة عالية. عكست نتائج TEWL فقدان وظيفة حاجز الجلد مقارنة بالجلد الطبيعي في جميع النقاط الزمنية المقاسة ، مما يشير إلى ضعف وظيفي في التئام جروح الحروق (الشكل 7 ب). تم تأكيد ذلك أيضا من خلال قمع البروتينات الموصلية الضيقة ZO-1 و 213 وضعف استعادة وظيفة حاجز الجلد ، كما ينعكس في قيم TEWL العالية التي شوهدت في اليوم 35 (منتصف) واليوم 56 (متأخر) على الرغم من إغلاق الجرح البصري (الشكل 7I). تم التحقق من عمق الحرق بشكل أكبر من خلال تلطيخ H& E ، والذي أظهر تشويها ونخرا لجميع طبقات الجلد النسيجية ، كما هو موضح في الشكل 7C. تم التحقق من صحة الأغشية الحيوية الراسخة ل PA01 في اليوم السابع بعد التلقيح بواسطة CFU (الشكل 7E ، F) ، والتصوير SEM (الشكل 7G) ، وتلطيخ التألق المناعي (الشكل 7H). الشكل 1: الإعداد للإجراء . (أ) تحضير الطاولة الجراحية. ب: قنية وريد الأذن للسوائل الوريدية وإعطاء الدواء. (ج) غطاء بطانية حرارية لحماية الخنزير من انخفاض حرارة الجسم أثناء العملية. (د) إعداد الموقد والمؤقت. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2: تعقيم موقع الجراحة ووضع العلامات. أ: قص الشعر وتعقيمه. (ب) وضع علامات على موقع الحرق باستخدام قالب قياسي معقم من ثمانية جرح (كل جرح 2 بوصة × 2 بوصة). (ج) وضع العلامات النهائية باستخدام علامة جلدية معقمة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3: تحريض جرح الحرق . (أ ، ب) موقد قياسي مزود بمقياس ضغط ووحدة تحكم آلية (2 بوصة × 2 بوصة) مطبقة على موقع الجرح المحدد مسبقا. (ج) الظهر كله يظهر جروح الحروق الثمانية كاملة السماكة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 4: تصوير وتقييم جروح الحروق غير الباضعة. (أ) يظهر تصوير البقع بالليزر (LSI) مع التوجيه الصحيح لمؤشر شعاع الليزر إلى مركز الجرح في الصورة اليسرى ؛ تظهر الصورة الموجودة على الجانب الأيمن جهاز LSI وخريطة تروية الأوعية الدموية للجلد في الوقت الفعلي. (ب) يظهر تطبيق مسبار فقدان الماء عبر البشرة (TEWL) على موقع الجرح في خمس نقاط مختلفة (أربع زوايا للجرح والمركز موضح في صورة الزاوية اليمنى السفلية) في الصورة اليسرى ؛ الصورة الموجودة على الجانب الأيمن هي شاشة تمثيلية تم التقاطها في الوقت الفعلي لقياس TEWL. (ج) يظهر على الجانب الأيسر مسح توافقي بالموجات فوق الصوتية لجرح الحرق باستخدام مسبار الموجات فوق الصوتية عالي الدقة 16 ميجاهرتز ؛ تظهر الصورة اليمنى جهاز الموجات فوق الصوتية وتسجيل الشاشة في الوقت الفعلي. (د) الصور الهيكلية (صور الوضع B ، الموجات فوق الصوتية ذات التدرج الرمادي) والصور الميكانيكية الحيوية (التصوير الإلستوجرافي ، الموجات فوق الصوتية الملونة) لموقع جرح الحرق في يوم التلقيح واليوم 7 بعد التلقيح. يشار إلى عمق الجرح بالخط الأصفر المتقطع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 5: تضميد الجروح والضمادات . (أ) تطبيق ضمادة الفيلم الشفاف لكل جرح على حدة. (ب) جميع جروح الحروق الملقحة ظهريا مغطاة بالطبقة الأولى من الضمادة. (ج) توضع ضمادة شفافة أكبر على منطقة الجرح بأكملها. د: وضع الطبقة الثانية من الشاش وطبقة فضفاضة من الضمادة المرنة القابلة للتمدد حول جذع الخنزير بالكامل لامتصاص أي إفرازات سائلة تأتي من الجروح. (ه) تغطية منطقة الجرح بأكملها بطبقة أخيرة من 4 في ضمادة لاصقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 6: التلقيح البكتيري . (أ) إعداد تلقيح الزائفة الزنجارية (PA01) في اليوم 3 بعد الحرق. (ب) التطبيق الموضعي للقاح، باستخدام ماصة باستخدام حجم 500 ميكرولتر لكل جرح. (ج) ينتشر اللقاح على سطح الجرح بالتساوي باستخدام مفرشة معقمة تستخدم لمرة واحدة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 7: تقدم التئام الجروح وتأكيد الأغشية الحيوية . (أ) صور تمثيلية لإغلاق الجرح خلال الجدول الزمني للدراسة. شريط المقياس = 1 سم. (ب) القياس الكمي لمنطقة الجرح وقياسات TEWL خلال الجدول الزمني للدراسة (ن = 6). يتم تمثيل البيانات كمتوسط ± SD. N.S. يشير إلى قيمة TEWL للبشرة العادية. ج: رسم تخطيطي يوضح مواقع خزعة الجرح المختلفة. د. تلطيخ H& E مع تلطيخ ماسون ثلاثي الألوان المقابل له يظهر تشويها ونخرا لجميع طبقات الجلد في اليوم 3 بعد الحرق واليوم 7 بعد التلقيح. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. (ه) صور رقمية تمثيلية للأجار غير الانتقائي (أجار لوريا بيرتاني) والأجار الانتقائي (Pseudomonas Isolation Agar) مع مستعمرات بكتيرية نمت من أنسجة سرير جرح الخنازير. يتيح الوسط الانتقائي العد الدقيق لمستعمرات PA01 فقط. (F) يتم عرض حساب وحدة تشكيل مستعمرة العينة (CFU) من عدد المستعمرات المأخوذة من خزعات الجرح المعالجة في اليوم 7 بعد التلقيح. (ز) صور مجهر إلكتروني ماسح تمثيلي (SEM) لجروح الحروق الملقحة في اليوم 7 بعد التلقيح تظهر الغشاء الحيوي PA01 الذي تم إنشاؤه ، مع صورة مكبرة على الجانب الأيمن. شريط المقياس = 1 ميكرومتر. تشير رؤوس الأسهم الحمراء إلى المواد البوليمرية خارج الخلية (EPS). (ح) تم تصوير P. aeruginosa على جروح الحروق باستخدام الأجسام المضادة المضادة للزائفة (الخضراء) ؛ تظهر صور التألق المناعي لخزعات الجرح بعد التلقيح في اليوم 7 استعمارا شديدا لأنسجة الجرح بواسطة P. aeruginosa. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (I) فسيفساء تمثيلية (شريط المقياس = 200 ميكرومتر) والصور المكبرة المقابلة (شريط المقياس = 50 ميكرومتر) للأقسام الملطخة ب ZO-1 و ZO-2 في اليوم 35 واليوم 56 بعد التلقيح ، مما يدل على انخفاض التعبير عن البروتينات بعد العدوى المستحثة. تم تلطيخ الأجزاء المجمدة المضمنة في OCT (10 ميكرومتر) باستخدام مضاد ZO-1 (أخضر) أو مضاد ZO-2 (أخضر). تم تلطيخ الأقسام باستخدام DAPI. تقدم الرسوم البيانية الشريطية كمية شدة إشارة ZO-1 و ZO-2. وتعرض البيانات كمتوسط ± SD (ن = 3)؛ * p < 0.05 مقارنة بالعفوية. تم إجراء تحليل مان ويتني أو كروسكال واليس أحادي الاتجاه لاختبارات التباين لاختبار الأهمية. الشكل 7H ، تم تعديله من Roy et al.13. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

يقدم هذا التقرير بروتوكولا مفصلا لإعداد نموذج الخنازير لعدوى الأغشية الحيوية المزمنة للجرح للدراسات التجريبية. تم الإبلاغ عن العديد من نماذج الأغشية الحيوية للخنازير سابقا22،23،24،25،26 ، ولكن لا يوجد أي منها نماذج خنازير تتضمن دراسات طويلة الأجل لمدة 8 أسابيع. الجروح المزمنة هي تلك التي تظل مفتوحة لمدة 4 أسابيع أو أكثر14،27،28. لا توجد نماذج بيوفيلم مزمنة أخرى للجروح تم الإبلاغ عنها في الأدبيات. يتناول هذا العمل مفهوم إغلاق الجرح الوظيفي2،7،13،15،17،29. كانت دراسة أجريت في عام 2014 أول من أفاد بأن الجروح المصابة بالأغشية الحيوية قد تغلق دون استعادة وظيفة الحاجز7. تم الإبلاغ عن قياس وظيفة حاجز الجلد في جرح الشفاء باستخدام فقدان الماء عبر البشرة (TEWL) في هذا العمل.

من الناحية التشريحية والفسيولوجية ، فإن جلد الخنزير ، مقارنة بجلد الصغيرة الأخرى ، هو أقرب إلى جلد الإنسان32،33،34. يحتوي كل من جلد الخنزير وجلد الإنسان على بشرة سميكة 33 ، وتتراوح نسبة سمك البشرة إلى الجلد من 10: 1 إلى13: 1 في الخنزير ، وهو ما يمكن مقارنته بالبشر34,35. من الناحية النسيجية والميكانيكية الحيوية ، يظهر جلد البشر والخنازير أوجه تشابه في التلال ، والدهون تحت الجلد ، والكولاجين الجلدي ، وتوزيع الشعر ، والهياكل الملحقة ، وحجم الأوعية الدموية وتوزيعها36،37،38. وظيفيا ، يشترك كل من الخنازير والبشر في أوجه التشابه في تكوين مكونات الدهون والبروتين والكيراتين في طبقة البشرة ، بالإضافة إلى الأنماط المناعية النسيجية المماثلة37,38. يشترك الجهاز المناعي للخنزير ، مقارنة بالحيوان الصغير الآخر ، في أوجه تشابه أعلى مع جهاز المناعة البشري ، مما يعني أن الخنازير هي نموذج مناسب للدراسات حول تفاعلات المضيف التي تعد جزءا لا يتجزأ من تعقيدات الأغشية الحيوية المرضية في التهابات الجروح39. أدى التقييم النقدي للإيجابيات والسلبيات التي تقدمها النماذج الحيوانية المختلفة إلى إجماع على أن الخنازير تمثل نموذجا فعالا لدراسة التئام الجروح34,38. بالإضافة إلى ذلك ، تتطور الخنازير المحلية تلقائيا إلى التهابات بكتيرية مزمنة ، كما لوحظ في البشر10. جهاز الحرق المستخدم لإنشاء الجروح هو جهاز حرق متطور وآلي يوفر طاقة حرارية بناء على درجة حرارة مقروءة من موقع الجلد المستهدف22,40. مثل هذا النهج يحسن صرامة واستنساخ إصابة الحروق. يضيف استخدام العزلات السريرية البشرية للبكتيريا لإصابة جروح الخنازير قيمة كنموذج ما قبل السريرية.

إصابات الحروق معقدة وتسبب العديد من الاضطرابات الجهازية20,41. وبالتالي ، من المهم إنعاش الخنزير بالسوائل الكافية ومنع انخفاض حرارة الجسم أثناء التخدير والانتعاش. يمكن أن تتداخل عدة عوامل مع التئام الجروح ، بما في ذلك التغذية بعد الحرق والسوائل والألم42. لذلك فإن المراقبة الدقيقة لتقييمات التغذية والألم لها أهمية. يمكن أن يكون ألم ما بعد الحرق شديدا ويؤثر على سلوك ونظامه الغذائي. يجب النظر بنشاط في التدخلات لمعالجة المخاوف السلوكية. تسجيل الألم وإدارته بشكل منتظم ومستمر أمر حتمي. يتم تضمين ورقة تقييم الألم الشاملة مع خطة مفصلة للغاية لإدارة الألم في هذا البروتوكول. لتجنب التلوث المتبادل بين الجروح ، يجب إيلاء اهتمام خاص لتطبيق الطبقة الأولى من الضمادة على كل جرح على حدة. يجب توخي الحذر الشديد في التعامل مع جميع المواد الخطرة بيولوجيا وعند إجراء التطهير الشامل للمعدات والأدوات وغرفة الجراحة بأكملها. يمنع تطبيق طبقات متعددة من الضمادة الخنزير من تعريض الجروح أثناء مجهوده لفرك أو خدش الحكة مرة أخرى.

لم يتعرض الخنزير في النموذج الحالي للخطر بسبب الاضطرابات الأيضية الكامنة (مثل مرض السكري) ، وبالتالي ، كان التأثير قيد الدراسة هو مجرد تأثير عدوى الأغشية الحيوية البكتيرية على التئام الجروح. ومع ذلك ، فإن النموذج يفسح المجال لتحريض مرض السكري (باستخدام الستربتوزوتوسين على سبيل المثال) ويمكن استخدامه لدراسة عدوى الأغشية الحيوية فيما يتعلق باضطراب التمثيل الغذائي الأساسي. القيد الآخر للنموذج هو إعداد العدوى الخاضعة للرقابة باستخدام P. aeruginosa ، وهي بكتيريا. من المتوقع أن تنمو النباتات الدقيقة الطبيعية للخنزير في الجرح ويمكن أن تؤثر على الشفاء. من الضروري إجراء مزيد من التحليل باستخدام NGS أو التقنيات المتقدمة الأخرى لتحديد المحتوى الميكروبي للجرح. يمكن أيضا تطبيق النموذج الحالي على العدوى المختلطة مع الأنواع الميكروبية المختلفة (على سبيل المثال ، الفطرية والفيروسية ، وما إلى ذلك). هذا عنصر مهم ، حيث من المحتمل أن تكون الجروح ذات الصلة سريريا مليئة بالميكروبات المختلطة ، مما قد يؤثر على التئام الجروح بشكل مختلف.

هناك العديد من المزايا المحتملة في هذا النموذج ، بما في ذلك التشابه مع التعقيد والعواقب طويلة الأجل للجروح المزمنة البشرية ، وعملية الحرق الآلية والقابلة للتكرار ، واستخدام الأنواع البكتيرية المعزولة سريريا. يمثل استخدام طرق تصوير متعددة غير جراحية نهجا قويا لجمع البيانات الفسيولوجية المفيدة التي تميز الجرح. أخيرا ، يعد تقييم التئام الجروح الوظيفي عن طريق استعادة وظيفة حاجز الجلد بناء على TEWL أمرا بالغ الأهمية. في الختام ، يظهر في هذا العمل بروتوكول قوي وبسيط ومفصل وسهل الاستخدام لتطوير إصابة حروق شديدة مصابة بالأغشية الحيوية باستخدام نظام نموذج الخنازير.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نود أن نشكر مركز موارد المختبر (LARC) ، جامعة إنديانا ، على دعمهم والرعاية البيطرية للحيوانات أثناء الدراسة. تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة NR015676 و NR013898 و DK125835 ومنحة وزارة الدفاع W81XWH-11-2-0142. بالإضافة إلى ذلك ، استفاد هذا العمل من جوائز المعاهد الوطنية للصحة التالية: GM077185 و GM069589 و DK076566 و AI097511 و NS42617.

Materials

Sedation
Ketamine Zoetis 10004027 100mg/ml
Telazol Zoetis 106-111 100mg/ml
Xylazine Pivetal 04606-6750-02 100mg/ml Anased
3ml syringe w/ 20g needle Covidien-Monoject 8881513033
Winged infusion set 21g Jorgensen Labs J0454B
Anesthetic
Isoflurane Pivetal 21295097
Surgery
Hair clippers Wahl 8787-450A
Nair Church and Dwight Co. Inc 70506572
Chlorhexidine Solution First Priority Inc. 179925722
70% Isopropyl Alcohol Uline S-17474
0.9% Saline Solution ICU Medical  RL-7282
Non-woven gauze Pivetal 21295051
Paper tape McKesson 455531
2" Elastic tape Pivetal 21300869
18-22g Intravenous Angiocath SurVet (01)14806017512306
Spay hook Jorgensen Labs J0112A
Sterile lube McKesson 16-8942
Laryngoscope Jorgensen Labs J0449S
Roll gauze Pivetal 21295032
Endotracheal tube (7-9mm) Covidien 86112 Shiley Hi-Lo Oral Nasal Tracheal Tube Cuffed
15gtt/ml IV administration set ICU Medical 12672-28
LRS 1000ml bag ICU Medical 07953-09
Three Quarter Drape Sheet McKesson 16-i80-12110G
Analgesia
Buprenorphine RX Generics 42023-0179-05 0.3mg/ml
Fentanyl Transdermal
Carprofen 21294548 Pivetal 50mg/ml Levafen
Bandaging
Transparent film dressing 26×30 Genadyne Biotechnologies A4-S00F5
Film dressing 4 x 4-3/4 Frame Style McKesson 886408
Vetrap 3M 1410BK BULK
Elastic tape 4" Pivetal 21300931
Kerlix Roll Gauze Cardinal Health 3324
Imaging
Canon EOS 80D Canon 1263C004
Speedlight 600EX II-RT Canon 1177C002
EFS 17-55mm Ultrasonic Canon 1242B002
GE Logiq E9 GE 5197104-2
ML6-15 Probe GE 5199103
PeriCamPSI Perimed 90-00070
DermaLab Cortex Technologies Inc 4608D78
Biopsy/Tissue Collection
6mm punch biopsy Integra Lifesciences 33-36
bupivicaine 0.5% Auromedics Pharma 55150017030
Size 10 Disposable Scalpel McKesson 16-63810
Dissection scissors Pivetal 21294806
Rat tooth thumb tissue forceps Aesculap BD512R
Non-adherent Dressing Covidien 2132 Telfa
50ml Conical tube Falcon 352070
Eppendorf/microcentrifuge tube Fisherbrand 02-681-320
OCT Cassette
Non Woven Gauze 4×4 Pivetal 21295051
Inoculum
Low salt LB agar Invitrogen 22700-025
Low salt LB broth Fisher scientific BP1427-500
Petri plate Falcon REF-351029
Polyprophyline round bottom tubes (14 ml) Falcon REF-352059
Pseudomonas Agar Base (Dehydrated) Thermo Scientific OXCM0559B
LB Agar, powder (Lennox L agar) Thermo Fisher Scientific (Life Technologies) 22700025
Gibco™ DPBS, calcium, magnesium Gibco 14040133
Euthanasia
18-22g Intravenous Angiocath SurVet (01)14806017512306
Fatal Plus Vortech Pharmaceuticals 9373
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goodwine, J., et al. Pyruvate-depleting conditions induce biofilm dispersion and enhance the efficacy of antibiotics in killing biofilms in vitro and in vivo. Scientific Reports. 9 (1), 3763 (2019).
  2. Sen, C. K., Roy, S., Mathew-Steiner, S. S., Gordillo, G. M. Biofilm management in wound care. Plastic and Reconstructive Surgery. 148 (2), 275-288 (2021).
  3. Church, D., Elsayed, S., Reid, O., Winston, B., Lindsay, R. Burn wound infections. Clinical Microbiology Reviews. 19 (2), 403-434 (2006).
  4. Nguyen, T. T., Gilpin, D. A., Meyer, N. A., Herndon, D. N. Current treatment of severely burned patients. Annals of Surgery. 223 (1), 14-25 (1996).
  5. Eriksson, E., et al. Chronic wounds: Treatment consensus. Wound Repair and Regeneration. 30 (2), 156-171 (2022).
  6. Lebeaux, D., Chauhan, A., Rendueles, O., Beloin, C. From in vitro to in vivo models of bacterial biofilm-related infections. Pathogens. 2 (2), 288-356 (2013).
  7. Ganesh, K., et al. Chronic wound biofilm model. Advances in Wound Care. 4 (7), 382-388 (2015).
  8. Bjarnsholt, T., et al. The in vivo biofilm. Trends in Microbiology. 21 (9), 466-474 (2013).
  9. Stewart, P. S. Biophysics of biofilm infection. Pathogens and Disease. 70 (3), 212-218 (2014).
  10. Jensen, L. K., Johansen, A. S. B., Jensen, H. E. Porcine models of biofilm infections with focus on pathomorphology. Frontiers in Microbiology. 8, 1961 (2017).
  11. Mah, T. F., O’Toole, G. A. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends in Microbiology. 9 (1), 34-39 (2001).
  12. Gonzalez, J. F., Hahn, M. M., Gunn, J. S. Chronic biofilm-based infections: Skewing of the immune response. Pathogens and Disease. 76 (3), 023 (2018).
  13. Roy, S., et al. Mixed-species biofilm compromises wound healing by disrupting epidermal barrier function. Journal of Pathology. 233 (4), 331-343 (2014).
  14. Sen, C. K. Human wound and its burden: Updated 2020. Compendium of Estimates. Advances in Wound Care. 10 (5), 281-292 (2021).
  15. Barki, K. G., et al. Electric field based dressing disrupts mixed-species bacterial biofilm infection and restores functional wound healing. Annals of Surgery. 269 (4), 756-766 (2019).
  16. Dusane, D. H., et al. Electroceutical treatment of Pseudomonas aeruginosa biofilms. Scientific Reports. 9 (1), 2008 (2019).
  17. Roy, S., et al. Staphylococcus aureus biofilm infection compromises wound healing by causing deficiencies in granulation tissue collagen. Annals of Surgery. 271 (6), 1174-1185 (2020).
  18. Ghanbari, A., et al. Inoculation density and nutrient level determine the formation of mushroom-shaped structures in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Scientific Reports. 6, 32097 (2016).
  19. Yin, R., Cheng, J., Wang, J., Li, P., Lin, J. Treatment of Pseudomonas aeruginosa infectious biofilms: Challenges and strategies. Frontiers in Microbiology. 13, 955286 (2022).
  20. Norbury, W., Herndon, D. N., Tanksley, J., Jeschke, M. G., Finnerty, C. Infection in burns. Surgical Infections. 17 (2), 250-255 (2016).
  21. Nitz, F., et al. Molecular detection of drug-resistance genes of bla(OXA-23)-bla(OXA-51) and mcr-1 in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa. Microorganisms. 9 (4), 786 (2021).
  22. Davis, S. C., et al. Microscopic and physiologic evidence for biofilm-associated wound colonization in vivo. Wound Repair and Regeneration. 16 (1), 23-29 (2008).
  23. Breuing, K., Kaplan, S., Liu, P., Onderdonk, A. B., Eriksson, E. Wound fluid bacterial levels exceed tissue bacterial counts in controlled porcine partial-thickness burn infections. Plastic and Reconstructive Surgery. 111 (2), 781-788 (2003).
  24. Nusbaum, A. G., et al. Effective method to remove wound bacteria: Comparison of various debridement modalities in an in vivo porcine model. Journal of Surgical Research. 176 (2), 701-707 (2012).
  25. Hirsch, T., et al. Enhanced susceptibility to infections in a diabetic wound healing model. BMC Surgery. 8, 5 (2008).
  26. Roche, E. D., et al. Increasing the presence of biofilm and healing delay in a porcine model of MRSA-infected wounds. Wound Repair and Regeneration. 20 (4), 537-543 (2012).
  27. Hartoch, R. S., McManus, J. G., Knapp, S., Buettner, M. F. Emergency management of chronic wounds. Emergency Medical Clinics of North America. 25 (1), 203-221 (2007).
  28. Mustoe, T. Understanding chronic wounds: a unifying hypothesis on their pathogenesis and implications for therapy. American Journal of Surgery. 187 (5), 65-70 (2004).
  29. Bhattacharya, M., et al. Staphylococcus aureus biofilms release leukocidins to elicit extracellular trap formation and evade neutrophil-mediated killing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (28), 7416-7421 (2018).
  30. Chum, H., Pacharinsak, C. Endotracheal intubation in swine. Lab Animal. 41 (11), 309-311 (2012).
  31. Sinha, M., et al. Pseudomonas aeruginosa theft biofilm require host lipids of cutaneous wound. Annals of Surgery. 277 (3), e634-e647 (2023).
  32. Fan, G. Y., et al. Severe burn injury in a swine model for clinical dressing assessment. Journal of Visualized Experiments. (141), e57942 (2018).
  33. Sullivan, T. P., Eaglstein, W. H., Davis, S. C., Mertz, P. The pig as a model for human wound healing. Wound Repair and Regeneration. 9 (2), 66-76 (2001).
  34. Meyer, W., Schwarz, R., Neurand, K. The skin of domestic mammals as a model for the human skin, with special reference to the domestic pig. Current Problems in Dermatology. 7, 39-52 (1978).
  35. Vardaxis, N. J., Brans, T. A., Boon, M. E., Kreis, R. W., Marres, L. M. Confocal laser scanning microscopy of porcine skin: implications for human wound healing studies. Journal of Anatomy. 190, 601-611 (1997).
  36. Heinrich, W., Lange, P. M., Stirtz, T., Iancu, C., Heidemann, E. Isolation and characterization of the large cyanogen bromide peptides from the alpha1- and alpha2-chains of pig skin collagen. FEBS Letters. 16 (1), 63-67 (1971).
  37. Marcarian, H. Q., Calhoun, M. L. Microscopic anatomy of the integument of adult swine. American Journal of Veterinary Research. 27 (118), 765-772 (1966).
  38. Sullivan, T. P., Eaglstein, W. H., Davis, S. C., Mertz, P. The pig as a model for human wound healing. Wound Repair and Regeneration. 9 (2), 66-76 (2001).
  39. Dawson, H. D., et al. Structural and functional annotation of the porcine immunome. BMC Genomics. 14, 332 (2013).
  40. Kim, J. Y., Dunham, D. M., Supp, D. M., Sen, C. K., Powell, H. M. Novel burn device for rapid, reproducible burn wound generation. Burns. 42 (2), 384-391 (2016).
  41. Nielson, C. B., Duethman, N. C., Howard, J. M., Moncure, M., Wood, J. G. Burns: Pathophysiology of systemic complications and current management. Journal of Burn Care and Research. 38 (1), e469-e481 (2017).
  42. Rowan, M. P., et al. Burn wound healing and treatment: Review and advancements. Critical Care. 19 (1), 243 (2015).

Tags

Swine ModelBiofilm InfectionWound ChronicityPreclinical ModelClinically Isolated PathogensWound Biofilm FormationHost-microbe InteractionsBiofilm AggregatesWound Barrier FunctionTransepidermal Water LossIn Vivo StudiesHost Immune ResponseBiofilm Maturation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
El Masry, M., Bhasme, P., Mathew-Steiner, S. S., Smith, J., Smeenge, T., Roy, S., Sen, C. K. Swine Model of Biofilm Infection and Invisible Wounds. J. Vis. Exp. (196), e65301, doi:10.3791/65301 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image