שיטה משופרת למדידת פרופילי הידרציה של אבקה ב- Arabidopsis thaliana מתוארת כאן. השיטה החדשה מציעה רזולוציה גבוהה יותר, אינה פולשנית וניתנת לשחזור רב. הפרוטוקול מהווה כלי חדש לניתוח עדין יותר של התהליכים המווסתים את השלבים המוקדמים של ההאבקה.
רבייה מינית בצמחים פורחים דורשת אינטראקציה ראשונית בין גרגר האבקה לבין פני השטח הסטיגמטיים, שם נוצר דיאלוג מולקולרי בין השותפים המקיימים אינטראקציה. מחקרים במגוון מינים גילו כי סדרה של נקודות ביקורת מולקולריות מווסתות את האינטראקציה בין אבקה לסטיגמה כדי להבטיח שרק אבקה תואמת, בדרך כלל תוך ספציפית, תצליח להשפיע על ההפריה. במינים בעלי “סטיגמה יבשה”, כמו צמח המודל Arabidopsis thaliana, מחסום התאימות הפרזיגוטי הראשון לאחר האבקה הוא ביסוס הידרציה של אבקנים.
שלב זה של האבקה מווסת באופן הדוק, שבו אותות מגרגרי האבקה מעוררים שחרור מים מהצלקת, ובכך מאפשרים הידרציה של אבקה. היכולת למדוד במדויק ולעקוב אחר הידרציה של אבקה לאורך זמן היא המפתח לתכנון ניסויים המכוונים להבנת הוויסות של שלב קריטי זה ברבייה. פרוטוקולים שפורסמו משתמשים לעתים קרובות בפרחים שנכרתו מצמח האם, נשמרים על מדיה נוזלית או מוצקה, ומואבקים בתפזורת.
מאמר זה מתאר בדיקה ביולוגית לא פולשנית של האבקה in vivo המאפשרת מעקב הידרציה דקה אחר דקה אחר גרגרי אבקה בודדים של A. thaliana ברזולוציה גבוהה. הבדיקה ניתנת לשחזור ברמה גבוהה, מסוגלת לזהות וריאציות עדינות מאוד של פרופילי הידרציה של אבקה, ולכן מתאימה לניתוח מוטנטים המשפיעים על מסלולים המווסתים את ההאבקה. למרות שהפרוטוקול ארוך יותר מאלה המתוארים עבור האבקות בתפזורת, הדיוק ויכולת השחזור שהוא מספק, יחד עם אופיו in vivo , הופכים אותו לאידיאלי לדיסקציה מפורטת של פנוטיפים של האבקה.
רבייה מינית מוצלחת באנגיוספרם מסתמכת בדרך כלל על העברת גרגרי אבקה תוך-ספציפיים מהגחלת אל הצלקת, בתוך או בין פרטים (כלומר האבקה). העברה זו של גרגרי אבקה לפרח פתוח מתווכת בדרך כלל על ידי מאביקים או גורמים אביוטיים; ככזה, זה גם גורם לעתים קרובות לשקיעת אבקה הטרוספציפית בתנאים טבעיים. למעט כמה יוצאים מן הכלל, התקדמות ההאבקה על ידי אבקה הטרוספציפית היא חיסרון אבולוציוני, ומפחיתה את כושר הרבייה באמצעות הזדמנויות הזדווגות אבודות, כאשר רוב צאצאי הכלאיים הנוצרים כתוצאה מכך אינם מתפתחים כראוי או שהם סטריליים1. לפיכך, התפתחו מנגנונים לחסימת האבקה על ידי אבקה הטרוספציפית “לא תואמת”2. זיהוי מהיר של אבקה תואמת הוא אפוא התהליך החשוב ביותר בשלבים המוקדמים של רבייה מינית בצמחים פורחים רבים.
במשפחת Brassicaceae, שבה הסטיגמות הן מהסוג ה”יבש”, סדרה של נקודות ביקורת מולקולריות פועלות במספר שלבים בתהליך הרבייה המווסתות את ההאבקה, כך שרק אבקה תואמת מצליחה. הידרציה של אבקה היא אחד מנקודות הביקורת החשובות ביותר (איור 1), מאחר שאבקה שאינה מצליחה להתייבש אינה יכולה להתקדם כדי לייצר צינור אבקה ולאחר מכן לספק זרע לגמטופיט הנקבה. לעתים קרובות, דגנים לא תואמים אינם עוברים את מחסום ההאבקה הראשון, ולכן אינם מקבלים גישה למים סטיגמטיים3. בקרב בני משפחת Brassicaceae, זיהוי האבקה מתרחש במהירות, כאשר התאימות נוצרת תוך דקות מחיבור גרגרי האבקה לפיסטיל 4,5. בשנים האחרונות חלה התקדמות רבה, וכעת אנו מתחילים להבין את המנגנונים המולקולריים המווסתים נקודות ביקורת האבקה מרכזיות.
איור 1: סקירה כללית של אירועי מפתח במהלך האבקה תואמת. שלבים אלה, כגון הידרציה של אבקנים ונביטה של צינור אבקה, הם גם “מחסומים” של האבקה שיש לנווט בהצלחה כדי ליצור האבקה תואמת. התרשים מייצג סטיגמה מסוג ‘יבש’, האופיינית למינים ממשפחת Brassicaceae 2,20. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
מחקר חלוצי על מערכת אי-התאימות העצמית של Brassica (SI), שבה אבקה “עצמית” מוכרת ונדחית, ביסס את הפרדיגמה לזיהוי אבקה-סטיגמה ב- Brassicaceae 6,7,8,9,10. SI בברסיקה ובקרוביו מתווך על ידי חלבוני “זיהוי” השוכנים על פני השטח של האבקה ובקרום הפלזמה הסטיגמטי, שבעת אינטראקציה מובילים לדחיית אבקה. דחיית אבקה SI פועלת על ידי שיבוש של מערכת תאימות אבקה-סטיגמה בסיסית, אשר, כאשר מופעל במלואו על ידי תפיסה של אבקה תואמת, מוביל להפרשה ממוקדת על ידי הצלקת, ובכך מניע הידרציה אבקה (לסקירות של מנגנון תאימות אבקה, ראה11,12). בדוגמה של SI, הליגנד הנישא על האבקה הוא חלבון קטן עשיר בציסטאין, S-locus cysteine עשיר (SCR/SP11), והקולטן הסטיגמטי הוא קולטן S-locus receptor kinase (SRK).
לאחרונה, ב- Arabidopsis thaliana, קבוצה נוספת של חלבונים קטנים עשירים בציסטאין הנישאים באבקה, קבוצת חלבון מעיל אבקה B (ב- PCP-Bs), נמצאו כרגולטורים חשובים של קבלת אבקה באמצעות הפעלת הידרציה של אבקה13. קולטנים סטיגמטיים של ה- At PCP-Bsוהיבטים של מסלול הרגולציה במורד הזרם תוארו לאחרונהגם 14,15. באופן מעניין, מחקרים מוטציוניים של גנים המקודדים מתווכי איתות סטיגמטיים פוטנציאליים הנישאים על אבקה (כולל ב– PCP-Bs) לא הצליחו לייצר צמחים שיש להם חסימה מוחלטת למחסום הידרציית האבקה. עובדה זו מצביעה על כך שגורמים רבים אחרים, שעדיין לא התגלו, ממלאים תפקיד בוויסות הידרציית האבקנים. בהתבסס על השיטה שתוארה לראשונה על ידי Wang et al.13, כאן אנו מתארים ביו-אסאי משופר ברזולוציה גבוהה in vivo המתאים לזיהוי פגמים עדינים בהידרציה של אבקה בקווי A. thaliana מוטנטיים מועמדים.
עבור צמחים פורחים, השלבים המוקדמים מאוד של רבייה מינית הם ללא ספק החשובים ביותר. ברמת האינטראקציה אבקה-סטיגמה, מתקבלות החלטות מולקולריות הקובעות את “ההתאמה” של השותפים המקיימים אינטראקציה. החלטות כאלה, אם מתקבלות נכון, מונעות בזבוז משאבים שעלול להשפיע על כושר הרבייה21. לפיכך, מתן היתר רק לאבקה תואמת כדי להשפיע על ההפריה הוא מרכיב חשוב אחד בשמירה על גנוטיפים מותאמים היטב, ובכך ההצלחה האבולוציונית של מינים. מחקר שנערך עם צמח המודל A. thaliana היה בעל ערך רב בהעמקת ההבנה שלנו של תהליך זה. מספר מחקרים בעשורים האחרונים חשפו את נוכחותם של גורמים במעטפת האבקה הפועלים ב”מחסום” התאימות הראשון, שבו האבקה מקבלת גישה למים סטיגמטיים כדי לאפשר הידרציה של אבקה13. למרות התובנות הראשונות הללו לגבי המנגנונים המווסתים את תאימות האבקה-סטיגמה, עדיין קיימים פערים רבים בהבנתנו את התהליך הזה. נכון להיום, אף מוטציה של ליגנדים הנישאים באבקה או קולטנים סטיגמטיים הידועים כמשפיעים על הידרציית אבקה אינה יכולה לחסום לחלוטין האבקה תואמת, דבר המצביע על נוכחותם של קובעי הידרמינציה אבקניים אחרים שלא התגלו. על ידי היכולת להתבונן בקלות בפנוטיפ של עניין, bioassay הידרציה אבקה המתואר כאן הוא אחת הטכניקות הפשוטות ביותר לחקור מוטנטים פוטנציאליים המווסתים האבקה.
מתודולוגיות קיימות למדידת הידרציה של אבקנים משתמשות בדרך כלל בהאבקה בתפזורת ומדווחות על פחות נקודות זמן 14,22,23, ולכן עלולות להחמיץ פנוטיפים חשובים של פרופיל הידרציה עדינה. לדוגמה, המחקר של וואנג ועמיתיו 13, יחד עם עבודה על מוטנטים אחרים של חלבון פרווה אבקה במעבדה שלנו (תצפיות שלא פורסמו), חשפו הבדלים מסקרנים בפרופילי הידרציה בין מוטנטים. הבדלים עדינים כאלה עשויים להכיל רמזים חשובים למנגנוני הבקרה העומדים בבסיס האבקה תואמת.
השיטה המתוארת כאן מתמקדת ברכישת מספר קטן יחסית של מדידות בין קווי צמחים מוטנטיים ו-WT, בדגש על דיוק מתודולוגי לצמצום השונות בתוך מערכי הנתונים. בעוד ששיטה זו ניתנת לשחזור גבוה (כפי שמוצג באיור 7), בהנחה שהטמפרטורה והלחות נשלטות כראוי, חשוב לאסוף נתוני הידרציה עבור מספר כמעט שווה של WT ואבקה מוטנטית באותו יום כדי להפחית עוד יותר את פוטנציאל השונות. לאחר מכן ניתן לאגד נתונים על פני ימים שונים במידת הצורך. בנוסף, בחירת מתקני הבקרה המתאימים של WT חיונית לפרשנות נכונה של תוצאות ההידרציה. עבור מקבל האבקה, אותו קו צמחי צריך לשמש לקבלת בקרת WT וגרגירי אבקה מוטנטיים.
לדוגמה, אנו משתמשים בקו הצמחים הסטריליים הזכרי pA9-barnase, שמוצג גם בפרוטוקול הווידיאו, כמקבל האבקה הן עבור אבקה מסוג WT (בקרה) והן עבור אבקה מוטנטית (ניסיונית) בעת חקירת קווי מוטציות של אבקני T-DNA (כמו מוטציית KD המתוארת באיור 8). יש להימנע מערבוב של נתונים מקו סטרילי גברי שכזה, שאין צורך לסרס, עם זה שנאסף מקו בקרה המסולק ידנית, שכן סטיגמות אלה צפויות להתנהג אחרת. כמו כן, יש להשתמש בקווים מוטנטיים מסולקים בשילוב עם קו WT (בקרה) מקולקל במידת האפשר. אותה זהירות צריכה להיות מיושמת גם כאשר בוחנים את הרקע הגנטי של הצמחים הנחקרים. בעוד שרוב אוספי מוטנטי T-DNA הפופולריים נוצרו ברקע Col-0, אחרים, כגון אוסף FLAG מהמכון הלאומי לאגרונומיה (INRA), זמינים ברקע הגנטי Wassilewskija (WS)24,25. במקרים כאלה, מומלץ להשתמש בקווי הצמחים WT של האקוטיפ המתאים כבקרות.
למרות שכאן התמקדנו בהידרציה של אבקה במהלך 10 הדקות הראשונות של אינטראקציית אבקה-סטיגמה, שיטה זו יכולה להיות מותאמת גם כדי להקיף פרופילי הידרציה המכסים פרק זמן ארוך יותר. מאפיין מרכזי של הפרוטוקול הוא שהפרחים נשארים מחוברים לצמח האב הפרוטוקולים שפורסמו בדרך כלל דורשים כריתה של הפיסטיל ומיקום במדיה כדי לקיים את הרקמה למשך הניסוי14,18,26. למרות שאין ראיות ישירות המצביעות על כך שגישת semi in vivo כזו משפיעה על הידרציה של אבקה או אכן משנה את ויסות in vivo של תהליך זה, ניתן להעלות על הדעת כי כריתת הפרחים מצמח האב עשויה להשפיע על האבקה. לפיכך, פרוטוקול זה משיג סביבת in vivo אמיתית לחקר האינטראקציה אבקה-סטיגמה, שבה נשמרת שלמותו המבנית של הצמח.
העברת גרגרי אבקה בודדים לפפילות סטיגמטיות “בתוליות” היא ללא ספק אחת הפעולות המאתגרות ביותר המתוארות בפרוטוקול זה. אין זה נדיר להעביר אשכולות של גרגרי אבקה בטעות. אולם ניתן להפחית במידה ניכרת את הסיכוי שזה יקרה על-ידי הבטחה שרק שכבה אחת של אבקה נמצאת על המלקחיים (איור 3A) (או אפילו רק גרגר אבקה יחיד; איור 5), ו/או על-ידי שימוש בגרגרי אבקה שכבר מכוונים, כך שהם “בולטים” מאחרים בקצה המלקחיים. מצאנו כי מפעיל מנוסה יכול להשלים בהצלחה העברה של אבקה בודדת לתא פפילה סטיגמטי בתוך כ -3 דקות ולהקליט נתונים עבור עד חמישה גרגרי אבקה על פני תקופה של 1 שעות. כך, במשך תקופה של 2-4 ימים, ניתן לצבור מספיק נתונים לניתוח סטטיסטי משמעותי של קווי הצמחים הנחקרים.
טעויות אנוש הן המקור הגדול ביותר לשונות בניתוח מערכי נתונים הנגזרים ממחקרים המשתמשים בפרוטוקול זה. לדוגמה, ההגדרה של “גבול האבקה” במהלך ניתוח תמונה מסתכמת בשיקול דעתו של החוקר הבודד. לפיכך, קיים פוטנציאל שמדידות שנעשות על ידי חוקרים שונים, אפילו על אותו מערך נתונים, עשויות ליצור שונות. במידת האפשר, חוקר יחיד צריך לבצע את המדידות כדי למזער טעויות דגימה. בנוסף, צימוד של WT ומערכי נתונים מוטנטיים על ידי אותו אופרטור שולל את ההגדרה הסובייקטיבית הפוטנציאלית של “גבול האבקה” והשונות הבין-אופרטיבית.
לסיכום, מתוארת שיטה מתוחכמת אך מדויקת למדידת פרופילי הידרציה של אבקנים באורגניזם המודל A. thaliana . הוכחנו כי, על ידי שימוש בפרוטוקול זה, ניתן להשיג בקלות נתוני הידרציה עקביים ביותר של אבקה עבור A. thaliana . שלוש קבוצות נתונים בלתי תלויות עבור האבקות WT שנרכשו בימים שונים הראו סטיות קטנות עקביות של <3% בכל נקודות הזמן (איור 7 וטבלה משלימה S1). למרות שהביו-אסאה המוצגת כאן מעט מורכבת יותר מרוב הפרוטוקולים הקיימים, הרזולוציה של הנתונים המופקים עדיפה ומתאימה לזיהוי ואפיון מוטנטים חדשים המשפיעים על מסלולים המווסתים האבקה תואמת.
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה נתמך על ידי אוניברסיטת באת’ (אוניברסיטת באת’, בריטניה, BA2 7AY) מלגות לתואר שני ל Y.-L.L. ואיור 1 של L.W. נוצר עם BioRender.com (https://biorender.com/).
A9-barnase line | University of Bath | Courtsey of Prof. Rod Scott | Male sterile Arabidopsis thaliana wildtype equivalent line of the ecotype Columbia-0 |
Dumont Tweezer, Dumont #5 Inox 11cm | Fisher | Dumont 500342 | Tweezer uses for transfer of pollen grain |
GraphPad Prsim (version 8.0.2) | Dotmatics | Prism | Comprehensive data analysis, graphing and statistics software |
JMP (version 17) | JMP Statistical Discovery LLC | JMP 17 | Statistical analysis software |
Levington F2S seed & modular compost (with sand) | Levington | LEV75F2SMS | General-purpose compost for plant growth |
Micromanipulator | Singer instrument Co. LTD. | Singer Micromanipulator | Micromanipulator to aid transfer of pollen grain |
Nikon Digit sight DS-U1 | Nikon | DS-U1 | Microscope camera (coupletd to SMZ1500) |
Nikon Eclipse TE2000-S Inverted Microscope | Nikon | TE2000-S | Inverted microscope |
Nikon SMZ1500 Stereomicroscope | Nikon | SMZ1500 | Stereomicroscope |
Nikon DS-Fi3 microscope camera | Nikon | DS-Fi3 | Microscope camera (coupletd to TE2000-S) |
Nikon NIS-Elements Basic Research | Nikon | NIS-Elements BR | Image accquisition and analysis software (for DS-Fi3) |
Nikon NIS-Elements F | Nikon | NIS-Elements F | Image accquisition and analysis software (for DS-U1) |
WT Col-0 plant line | NASC | N700000 | Wildtype Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 |