Questo rapporto fornisce protocolli per l’assemblaggio, la coltura cellulare e i saggi sulla piattaforma μSiM per la costruzione di modelli di barriera emato-encefalica.
Il microSiM (μSiM) è una piattaforma di coltura basata su membrana per la modellazione della barriera emato-encefalica (BBB). A differenza delle piattaforme convenzionali basate su membrana, μSiM offre agli sperimentatori nuove capacità, tra cui l’imaging di cellule vive, la segnalazione paracrina senza ostacoli tra le camere “sangue” e “cervello” e la capacità di visualizzare direttamente l’immunofluorescenza senza la necessità di estrarre/rimontare le membrane. Qui dimostriamo l’uso di base della piattaforma per stabilire modelli di monocoltura (cellule endoteliali) e co-coltura (cellule endoteliali e periciti) della BBB utilizzando membrane nanoporose ultrasottili di nitruro di silicio. Dimostriamo la compatibilità sia con colture cellulari primarie che con colture di cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC). Forniamo metodi per l’analisi qualitativa di modelli di BBB tramite colorazione in immunofluorescenza e dimostriamo l’uso del μSiM per la valutazione quantitativa della funzione di barriera in un saggio di permeabilità a piccole molecole. I metodi forniti dovrebbero consentire agli utenti di stabilire i loro modelli di barriera sulla piattaforma, promuovendo l’uso della tecnologia dei chip tissutali per lo studio dei tessuti umani.
I tessuti viventi sono compartimentati da cellule specializzate che creano e mantengono barriere e regolano quali cellule e molecole vengono trasportate da un compartimento all’altro. L’impropria regolazione delle funzioni di barriera può essere la fonte sia di malattie acute che di malattie croniche. La barriera emato-encefalica (BBB) è la barriera tissutale più restrittiva del corpo umano1. La disfunzione della BBB è alla base di un’ampia gamma di malattie del sistema nervoso centrale (SNC), tra cui il morbo di Alzheimer2, il morbo di Parkinson3,4 e la sclerosi multipla 5,6. La lesione della BBB è anche legata al deterioramento cognitivo a lungo termine come risultato di disturbi acuti, come la sepsi7, il COVID-198 e il delirio postoperatorio9. Lo sviluppo di farmaci con il potenziale per il trattamento dei disturbi cerebrali è stato frustrantemente difficile a causa della sfida di violare intenzionalmente la BBB per fornire molecole bioattive ai bersagli nel cervello10. Per questi motivi, i metodi per studiare la funzione della BBB in vitro sono di fondamentale importanza per la comprensione e il trattamento delle malattie del SNC.
I metodi di base per misurare la funzione di barriera in vitro prevedono la creazione di un monostrato o di una co-coltura su una membrana semipermeabile e la misurazione della resistenza impartita dalle cellule alla diffusione di piccole molecole o a piccole correnti elettriche11,12,13,14. Mentre l’emergere dei sistemi microfisiologici (MPS) ha prodotto un’abbondanza di scelte per modellare la BBB in 3D15,16, la diversità delle geometrie del sistema rende difficile confrontare le misurazioni di permeabilità tra MPS o con i valori stabiliti in letteratura. La definizione di valori basali affidabili è particolarmente importante nella ricerca sulla BBB dove, a causa dell’ampia regolazione della barriera da parte delle cellule endoteliali vascolari cerebrali, i valori di permeabilità in vitro sono altamente esaminati12,17,18. Per questi motivi, le misurazioni della permeabilità attraverso i monostrati stabiliti su membrane 2D rimarranno un punto fermo negli studi sulla BBB per gli anni a venire. Ciò vale per altre barriere tissutali, comprese le barriere epiteliali, in cui i valori assoluti di permeabilità basale vengono utilizzati per convalidare e confrontare i modelli in vitro 19,20,21.
Con l’obiettivo di creare un nuovo strumento prezioso per la comunità di ricerca sulla BBB, negli ultimi 5 anni abbiamo introdotto 22 eavanzato 23,24,25,26 il microdispositivo dotato di una piattaforma di embrane di licon membrane (μSiM) per l’uso nella modellazione dei tessuti di barriera. La caratteristica abilitante della piattaforma è una membrana ultrasottile (<100 nm di spessore) con centinaia di milioni di nanopori 27,28 o una miscela di nanopori e micropori29. I chip a membrana autoportanti sono prodotti su un “chip” di silicio da 300 μm che stabilizza le strutture ultrasottili30 e consente loro di essere maneggiate con pinzette per l’assemblaggio del dispositivo. A causa della loro natura ultrasottile, le membrane hanno una permeabilità di due ordini di grandezza superiore a quella delle membrane convenzionali incise su traccia utilizzate nei dispositivi commerciali di coltura a membrana31,32. In pratica, ciò significa che l’ostacolo della membrana alla diffusione di molecole più piccole dei nanopori (<60 nm) è trascurabile33. Pertanto, per le barriere cellulari, solo le cellule e le matrici che depositano determineranno la velocità di trasporto di piccole molecole dai compartimenti apicali a quelli basali che sono separati dalla membrana34. Il design del dispositivo e la natura ultrasottile delle membrane offrono anche molti vantaggi per la microscopia ottica. Questi includono 1) la capacità di seguire colture vive utilizzando il contrasto di fase o l’imaging in campo chiaro, 2) la capacità di colorare e visualizzare immagini fluorescenti in situ senza la necessità di estrarre e trasferire la membrana in un vetro di copertura e 3) il fatto che le membrane sono più sottili delle “fette” confocali in modo che le co-colture dirette abbiano una spaziatura più naturale tra i tipi di cellule rispetto a quella che può essere ottenuta con membrane incise in traccia spesse 6-10 μm.
Più recentemente, abbiamo avanzato la piattaforma a un formato modulare per facilitare l’assemblaggio rapido34 e la personalizzazione35,36. Abbiamo sfruttato il formato modulare per distribuire i componenti del dispositivo tra i nostri laboratori di bioingegneria e i laboratori di barriera cerebrale che collaborano. Abbiamo quindi sviluppato congiuntamente protocolli per l’assemblaggio del dispositivo, la monocoltura e la co-coltura, la colorazione immunofluorescente e la permeabilità a piccole molecole e abbiamo dimostrato che questi metodi erano riproducibili tra i laboratori. Utilizzando questi protocolli, abbiamo anche dimostrato che la piattaforma modulare supporta una BBB convalidata sviluppata utilizzando il metodo di coltura endoteliale estesa (EECM) per la creazione di cellule endoteliali simili a microvascolari cerebrali (BMEC) da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSCs)37. Lo scopo del presente rapporto è quello di esaminare questi metodi in modo più dettagliato e, con l’aiuto del video di accompagnamento, facilitare una più ampia adozione della piattaforma nella comunità BBB.
Sebbene i trucioli della membrana siano stati progettati per la stabilità, possono rompersi o rompersi se maneggiati in modo errato durante l’assemblaggio. Pertanto, è fondamentale afferrare il chip nelle tacche della pinzetta per chip e posizionarlo delicatamente nell’attrezzatura. Quando si maneggiano i dispositivi in generale, è necessario prendere ulteriori precauzioni per non urtare o far cadere i dispositivi. Durante l’incollaggio del chip della membrana al dispositivo A1, il chip deve essere posato in piano e centrato sul pilastro del dispositivo A1 per evitare la rottura della membrana durante l’incollaggio al componente 1. Inoltre, qualsiasi contatto con gli strati di PSA esposti deve essere evitato dopo aver rimosso le maschere protettive. Quando si maneggia il componente 2 dopo la rimozione delle maschere protettive, si consiglia di tenerlo lungo il bordo del componente e di utilizzare una pinzetta per afferrare l’angolo triangolare privo di PSA.
Mentre i protocolli di coltura cellulare sono stati descritti per possibili modelli di BBB, il modello di co-coltura BMEC/periciti della BBB qui descritto può essere sufficiente o insufficiente a seconda del contesto fisiologico e delle domande di interesse. Ad esempio, il traffico di cellule immunitarie si verifica in gran parte nelle venule postcapillari del cervello41,42. In queste regioni, uno spazio perivascolare separa la barriera BMEC/pericita dai limitans gliali stabiliti dagli astrociti. Pertanto, nelle venule postcapillari, l’unità neurovascolare (NVU) comprende due barriere fisicamente separate in serie e le estremità astrocitarie non entrano direttamente in contatto con la barriera emato-pericitica/BMEC, che è ben rappresentata dal modello attuale. Se l’obiettivo è un modello NVU che tenga conto dell’impatto dei fattori secreti dagli astrociti sulla barriera ematologica, è possibile aggiungere al dispositivo un compartimento astrocitario che consenta lo scambio di fattori solubili attraverso lo spazio perivascolare. Questo esempio è stato illustrato in precedenza 34 e potrebbe essere esteso per includere altre cellule come la microglia e i neuroni in un compartimento “cerebrale”3D. L’architettura modulare della piattaforma consente di utilizzare semplici strategie di assemblaggio per ottenere queste riconfigurazioni, in modo che la piattaforma sia semplice o complessa quanto necessario per affrontare le ipotesi a portata di mano. Ogni configurazione di coltura cellulare; tuttavia, deve essere ottimizzato per nuove linee cellulari e multi-colture. Ad esempio, a causa delle proprietà delle membrane in nitruro di silicio, potrebbe essere necessario adattare le soluzioni di rivestimento rispetto alle piastre di coltura tissutale. L’inclusione di fibronectina in genere aiuta l’attaccamento cellulare e la sopravvivenza. Inoltre, gli utenti potrebbero coltivare cellule endoteliali e periciti in direzioni opposte. In questo caso, potrebbe essere necessario modificare, ad esempio, il modo in cui vengono effettuate e interpretate le misure di permeabilità. Fornire passaggi per questo tipo di cultura, tuttavia, esula dallo scopo di questo documento.
Un’altra sfida che si può incontrare durante la coltura cellulare è la rapida evaporazione dei terreni, poiché i dispositivi possono essere più sensibili alle alterazioni dell’ambiente rispetto alle piastre e ai flaconi standard per la coltura dei tessuti. Se si osserva un’evaporazione eccessiva o una crescita cellulare rallentata, è necessario misurare tutti i parametri critici dell’incubatore per garantire impostazioni accurate. È possibile aggiungere più acqua al cappuccio del tessuto o alla piccola capsula di Petri posta all’interno della camera di coltura cellulare, oppure i terreni devono essere scambiati più frequentemente. Inoltre, le bolle possono entrare nel canale inferiore e rimanere bloccate nella trincea per i dispositivi di trincea. Sebbene possano essere rimossi, è più facile evitare di aggiungere bolle in primo luogo. A tale scopo, è importante verificare che non vi siano bolle nel puntale della pipetta o aria all’estremità del puntale della pipetta prima di pipettare il terreno nella camera inferiore. Inoltre, l’evaporazione del fluido nel canale può portare a uno spazio tra la superficie del supporto e la parte superiore della porta. È possibile pipettare un piccolo volume di supporti in una porta fino a quando non raggiunge la superficie della porta opposta, dopodiché il supporto può essere sostituito in quella porta opposta. Mentre i terreni hECSR ed E6 + 10% FBS non devono essere riscaldati a bagnomaria, altri terreni possono essere preriscaldati per ridurre la formazione di bolle. Se una bolla penetra nella camera inferiore, può essere rimossa pipettando rapidamente 100 μL attraverso il canale. Tuttavia, questo metodo può portare alla contaminazione tra le camere o alla fuoriuscita di fluidi sulla superficie del dispositivo. Può anche distruggere gli strati cellulari. In alternativa, il mezzo può essere prima rimosso dal canale e poi reintrodotto con un volume di 50 μL. Rimuovere prima il supporto, tuttavia, può causare una maggiore formazione di bolle nel canale. Se una bolla non si trova direttamente sotto l’area della membrana, può essere lasciata nel canale senza effetti sulla coltura cellulare.
L’attaccamento e la crescita dei periciti, come dimostrato nella Figura 2, possono essere impegnativi. L’utilizzo di una densità di semina ottimizzata è essenziale per la formazione di uno strato con un rapporto periciti-cellule endoteliali fisiologicamente rilevante. Inoltre, poiché i periciti sono sensibili al taglio, tutti gli scambi di terreni nel canale dovrebbero essere eseguiti molto lentamente per proteggere le cellule. Per la coltura BPLC, è possibile ottenere un migliore attaccamento rivestendo la camera inferiore con 800 μg/mL di collagene di tipo IV o 100 μg/mL di fibronectina.
L’immunocitochimica nei dispositivi qui descritti consente un’analisi qualitativa della salute e della funzione cellulare. I metodi per la colorazione nelle piastre di coltura tissutale o in altre piattaforme devono essere direttamente traducibili nella piattaforma. Per la coltura cellulare solo nella camera superiore, dopo la fissazione, il PBS può essere aggiunto nella camera inferiore e lasciato per i passaggi rimanenti, con il blocco e la colorazione eseguiti solo nella camera superiore. In questo modo si riducono al minimo i rischi di rottura delle membrane o di formazione di bolle nella camera inferiore. Per la colorazione in co-coltura, si consiglia di utilizzare entrambe le camere in tutte le fasi. È importante notare che la viscosità del fissativo e del PBS è diversa da quella del fluido. Pertanto, può essere più facile aggiungere bolle nella camera inferiore ed è necessario prestare particolare attenzione a controllare la presenza di aria nei puntali delle pipette all’estremità del puntale prima di pipettare nella camera inferiore.
Il protocollo descritto per il saggio di permeabilità a piccole molecole consente una valutazione funzionale e quantitativa della funzione di barriera delle cellule endoteliali coltivate nel dispositivo μSiM. Un problema che può essere riscontrato durante questo test è l’aspirazione di bolle d’aria nella pipetta durante la raccolta del campione dal canale inferiore nella fase 4.1.7.4 del protocollo. Per evitare questo problema, è importante assicurarsi che la punta sia sigillata nella porta prima di iniziare la raccolta del campione e che il campione non venga prelevato troppo velocemente. Se ciò non risolve il problema, la dimensione delle punte utilizzate potrebbe essere troppo piccola o troppo grande per adattarsi alle porte; utilizzare i suggerimenti elencati nella Tabella dei materiali. Se vengono misurati valori di permeabilità inaspettatamente elevati nonostante un monostrato confluente dall’aspetto sano, l’integrità del monostrato deve essere verificata per rilevare eventuali interruzioni durante la raccolta del campione. Si consiglia di controllare sempre il monostrato al microscopio subito dopo la raccolta del campione. Se il monostrato sembra ancora intatto e sano, il campione può essere fissato e i marcatori biologici della funzione di barriera possono essere valutati, ad esempio, tramite immunocolorazione delle proteine giunzionali. Al contrario, se vengono misurati valori di permeabilità inaspettatamente bassi, è importante assicurarsi che 50 μL di terreno vengano campionati dal canale inferiore senza bolle d’aria. Se il terreno fuoriesce dalla porta di campionamento non appena viene posizionato il puntale del serbatoio, tale terreno deve essere raccolto prima di inserire la pipetta nella porta di campionamento, poiché la maggior parte della piccola molecola fluorescente sarà presente nel volume iniziale di 10 μL campionato dal canale inferiore. Disegnando cerchi intorno alle porte utilizzando una penna idrofobica o posizionando un nastro idrofobico con un foro intorno alla porta si evita che i fluidi pompati passivamente si diffondano. Se durante il campionamento vengono prelevate delle bolle o se l’intero campione da 50 μL non viene rimosso, il campione non deve essere utilizzato. In alternativa, il volume esatto può essere determinato e utilizzato nel calcolo della permeabilità; tuttavia, questo dovrebbe essere fatto solo se il volume rimosso è ≥40 μL, che corrisponde a ~98-99% di recupero del colorante34.
The authors have nothing to disclose.
J.L.M., B.E., T.R.G., M.C.M., P.K., M.T., K.C. e L.W. sono stati finanziati dalla sovvenzione NIH R33 HL154249. J.L.M. è stato finanziato da R44 GM137651. M.M. è stato finanziato dallo Schmidt Program Award Del Monte Institute for Neuroscience, Università di Rochester. M.T. è stata finanziata da RF1 AG079138. K.C. è stato finanziato dalla Fondazione Internazionale per la Ricerca Etica.
Antibodies | |||
CD31 Polyclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-32321 | |
Claudin-5 mouse IgG antibody, 4C3C2 | Thermo Fisher Scientific | 35-2500 | |
Goat α-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11001 | |
Goat α-Rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A11011 | |
Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
NG2, mouse IgG2a, 9.2.27 | Millipore | MAB2029 | |
Occludin mouse IgG antibody, OC-3F10 | Thermo Fisher Scientific | 33-1500 | |
PDGFRβ, rabbit IgG antibody, 28E1 | Cell Signaling Technology | 3169 | |
VE-cadherin mouse IgG2B Clone # 123413 | R&D Systems | MAB9381 | |
ZO-1 rabbit IgG antibody, polyclonal | Thermo Fisher Scientific | 40-2200 | |
Chemicals, peptides, and recombinant proteins | |||
100% Methanol | VWR | 101443-718 | Can be substituted with similar products |
16% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Can be substituted with similar products |
Accutase | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
Acetic acid | Sigma-Aldrich | 695092 | |
B27 supplement | Thermo Fischer Scientific | 17504044 | |
bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 | |
Collagen IV from human placenta | Sigma-Aldrich | C5533 | |
Collagen, Type I solution from rat tail | Sigma-Aldrich | C3867-1VL | Can be substituted with similar products |
DMEM/Ham’s F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
Essential 6 medium | Thermo Fisher Scientific | A1516401 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Peak Serum | PS-FB1 | |
Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141 | |
Fibronectin human protein, plasma | ThermoFisher Scientific | 33016015 | Can be substituted with similar products |
hESFM | Thermo Fisher Scientific | 11111044 | |
Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma-Aldrich | 861502 | |
Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific | 500627 | Can be substituted with similar products |
PBS without calcium, magnesium | Cytiva | SH30256.01 | Can be substituted with similar products |
Pericyte Medium | ScienCell | 1201 | Use complete kit (includes supplements) |
Poly-L-Lysine, 10 mg/mL | ScienCell | 0413 | |
Triton X-100 | JT Baker | X198-05 | Can be substituted with similar products |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Invitrogen™ | 10977015 | Can be substituted with similar products |
Experimental models: Cell lines | |||
Blood-brain barrier hCMEC/D3 cell line | Sigma-Aldrich | SCC066 | |
Human brain vascular pericytes | ScienCell | 1200 | |
iPS(IMR90)-4 human induced pluripotent stem cells | WiCell | RRID:CVCL_C437 | |
Glassware and Plasticware | |||
150 mm TC-treated Cell Culture Dish with 20 mm Grid | Falcon | 353025 | |
Clamps | VWR | MFLX06832-10 | |
Corning tissue culture plates (6-well) | Corning | 3506 | |
Flat 96-well non-binding microplates | Greiner Bio-One | 655900 | |
Microscope Slide Device Holder | SiMPore | USIM-SB | Dimensions compatible with micropscope slide holders |
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fischer Scientific | 339651 | |
Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fischer Scientific | 339653 | Tube caps can be filled with water for cell culture |
P20-200 pipette tips | VWR | 76322-516 | Alternate brands may not seal as effectively into ports |
Transwell filters (12 well, 12 mm, 0.4 μm pore size, PC) | CoStar | 3401 | |
Instruments | |||
10X Objective (For Andor) | Nikon Instruments Inc. | MRD00105 | Air; WD: 4 mm; NA 0.45 |
10X Objective (For Nikon) | Nikon Instruments Inc. | MRP40102 | Air; WD: 6.2 mm; NA 0.25 |
40X Objective (LWD) (For Andor) | Nikon Instruments Inc. | MRD77410 | Water immersion; WD: 590-610 mm; NA 1.15 |
Andor Spinning Disc Confocal microscope | Oxford Instruments, Andor | ||
Nikon Eclipse Ts2 Phase Contrast Microscope | Nikon Instruments Inc. | Can be substituted with similar products | |
TECAN Infinite M200 | TECAN | Can be substituted with similar products | |
Other | |||
Advanced PAP Pen | Millipore Sigma | Z672548 | 2 mm tip is recommended |
Assembly kit with fixtures | SiMPore | USIM-JIGSET | Including fixure A1, A2, B1, and B2 |
Camera Adapter for Microscopes | AmScope | CA-CAN-SLR Canon SLR / D-SLR | Φ23.2 – Φ30 adapter fits Nikon Eclipse Ts2 |
Canon EOS Rebel SL3 DSLR Camera | Canon | EOS 250D, BH #CAEDRSL3B, MFR #3453C001 | Can be substituted with similar products |
Cell strainer, 40 µm | Millipore Sigma (Corning) | CLS431750 | |
Component 1 | SiMPore | USIM-C1 | |
Component 2 | SiMPore | USIM-C2 | |
Membrane chips | SiMPore | NPSN100-1L | Other chips formats are available |
SMD handling tweezer double angle | Techni-Tool | 758TW003 | "Chip Tweezers" |
Stainless steel precision type GG tweezer | Techni-Tool | 758TW534 | "Straight Tweezers" |
Software | |||
Fiji | ImageJ | For image processing | |
Fusion | Oxford Instruments, Andor | Instructions for version 2.3.0.44 | |
i-control | TECAN | Instructions for version 2.0 | |
Imaris | Oxford Instruments | For image processing. Instructions for version 9.9.0 |