Dit rapport biedt protocollen voor assemblage, celkweek en assays op het μSiM-platform voor de constructie van bloed-hersenbarrièremodellen.
De microSiM (μSiM) is een op membraan gebaseerd kweekplatform voor het modelleren van de bloed-hersenbarrière (BBB). In tegenstelling tot conventionele op membranen gebaseerde platforms, biedt de μSiM experimentalisten nieuwe mogelijkheden, waaronder beeldvorming van levende cellen, ongehinderde paracriene signalering tussen ‘bloed’- en ‘hersen’-kamers, en de mogelijkheid om immunofluorescentie direct in beeld te brengen zonder de noodzaak van extractie/hermontage van membranen. Hier demonstreren we het basisgebruik van het platform om monocultuur (endotheelcellen) en co-cultuur (endotheelcellen en pericyten) modellen van de BBB op te zetten met behulp van ultradunne nanoporeuze siliciumnitridemembranen. We tonen compatibiliteit aan met zowel primaire celculturen als humane geïnduceerde pluripotente stamcelculturen (hiPSC). We bieden methoden voor kwalitatieve analyse van BBB-modellen via immunofluorescentiekleuring en demonstreren het gebruik van de μSiM voor de kwantitatieve beoordeling van de barrièrefunctie in een permeabiliteitstest van kleine moleculen. De aangeboden methoden moeten gebruikers in staat stellen hun barrièremodellen op het platform vast te stellen, waardoor het gebruik van weefselchiptechnologie voor het bestuderen van menselijke weefsels wordt bevorderd.
Levende weefsels worden gecompartimenteerd door gespecialiseerde cellen die barrières creëren en in stand houden en reguleren welke cellen en moleculen van het ene compartiment naar het andere worden getransporteerd. De onjuiste regulatie van barrièrefuncties kan de bron zijn van zowel acute ziekten als chronische ziekten. De bloed-hersenbarrière (BBB) is de meest beperkende weefselbarrière in het menselijklichaam1. Disfunctie van de BBB ligt ten grondslag aan een breed scala aan ziekten van het centrale zenuwstelsel (CZS), waaronder de ziekte van Alzheimer2, de ziekte van Parkinson3,4 en multiple sclerose 5,6. Letsel aan de BBB is ook gekoppeld aan langdurige cognitieve stoornissen als gevolg van acute aandoeningen, zoals sepsis7, COVID-198 en postoperatief delirium9. De ontwikkeling van geneesmiddelen met het potentieel om hersenaandoeningen te behandelen is frustrerend moeilijk geweest vanwege de uitdaging om opzettelijk de BBB te doorbreken om bioactieve moleculen af te leveren aan doelen in de hersenen10. Om deze redenen zijn methoden om de BBB-functie in vitro te bestuderen van het grootste belang voor het begrip en de behandeling van ziekten van het CZS.
De basismethoden voor het meten van de barrièrefunctie in vitro omvatten het aanbrengen van een monolaag of cocultuur op een semi-permeabel membraan en het meten van de weerstand die cellen geven aan diffusie van kleine moleculen of kleine elektrische stromen11,12,13,14. Hoewel de opkomst van microfysiologische systemen (MPS) een overvloed aan keuzes heeft opgeleverd voor het modelleren van de BBB in 3D15,16, maakt de diversiteit aan systeemgeometrieën het moeilijk om permeabiliteitsmetingen tussen MPS of gevestigde literatuurwaarden te vergelijken. Het vaststellen van betrouwbare basiswaarden is vooral belangrijk in BBB-onderzoek waar, vanwege de uitgebreide barrièreregulatie door vasculaire endotheelcellen in de hersenen, in vitro permeabiliteitswaarden sterk worden onderzocht12,17,18. Om deze redenen zullen permeabiliteitsmetingen over monolagen op 2D-membranen de komende jaren een hoofdbestanddeel blijven van BBB-studies. Dit geldt voor andere weefselbarrières, waaronder epitheliale barrières, waar absolute waarden van baseline permeabiliteit worden gebruikt om in vitro modellen te valideren en te vergelijken 19,20,21.
Met het doel om een waardevol nieuw hulpmiddel voor de BBB-onderzoeksgemeenschap tot stand te brengen, hebben we de afgelopen 5 jaar 22 en 23,24,25,26 het microapparaatmet een siliconm embrane (μSiM)-platform geïntroduceerd voor gebruik bij het modelleren van barrièreweefsel. Het faciliterende kenmerk van het platform is een ultradun (<100 nm dik) membraan met honderden miljoenen nanoporiën 27,28 of een mix van nanoporiën en microporiën29. De vrijstaande membraanchips worden geproduceerd op een silicium ‘chip’ van 300 μm die de ultradunne structurenstabiliseert 30 en het mogelijk maakt om ze met een pincet te hanteren voor de assemblage van het apparaat. Vanwege hun ultradunne aard hebben de membranen een permeabiliteit die twee ordes van grootte hoger is dan die van conventionele spoorgeëtste membranen die worden gebruikt in commerciële membraankweekapparaten31,32. In de praktijk betekent dit dat de hinder van het membraan voor de diffusie van moleculen kleiner dan de nanoporiën (<60 nm) verwaarloosbaar is33. Voor cellulaire barrières zullen dus alleen de cellen en de matrices die ze afzetten de snelheid bepalen van het transport van kleine moleculen van de apicale naar basale compartimenten die door het membraan worden gescheiden34. Het ontwerp van het apparaat en de ultradunne aard van de membranen bieden ook veel voordelen voor optische microscopie. Deze omvatten 1) de mogelijkheid om levende culturen te volgen met behulp van fasecontrast of helderveldbeeldvorming, 2) de mogelijkheid om fluorescerend te kleuren en in situ te beelden zonder de noodzaak om het membraan te extraheren en over te brengen naar een dekglas, en 3) het feit dat de membranen dunner zijn dan confocale ‘plakjes’, zodat directe co-culturen een meer natuurlijke afstand tussen celtypen hebben dan kan worden bereikt met 6-10 μm dikke spoorgeëtste membranen.
Onlangs hebben we het platform doorontwikkeld naar een modulair formaat om snelle montage34 en maatwerk35,36 mogelijk te maken. We hebben het modulaire formaat gebruikt om apparaatcomponenten te distribueren tussen onze bio-engineering en samenwerkende hersenbarrièrelaboratoria. Vervolgens ontwikkelden we gezamenlijk protocollen voor apparaatassemblage, monocultuur en co-cultuur, immunofluorescerende kleuring en permeabiliteit van kleine moleculen en toonden we aan dat deze methoden reproduceerbaar waren tussen laboratoria. Met behulp van deze protocollen toonden we ook aan dat het modulaire platform een gevalideerde BBB ondersteunt die is ontwikkeld met behulp van de uitgebreide endotheelkweekmethode (EECM) voor het creëren van microvasculaire-achtige endotheelcellen (BMEC) in de hersenen uit door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC’s)37. Het doel van dit rapport is om deze methoden nader te bekijken en met behulp van de bijbehorende video een bredere acceptatie van het platform in de BBB-community mogelijk te maken.
Hoewel membraanchips zijn ontworpen voor stabiliteit, kunnen ze barsten of breken als ze tijdens de montage verkeerd worden behandeld. Het is dus van cruciaal belang om de chip in de inkepingen van het chippincet vast te pakken en voorzichtig in de armatuur te plaatsen. Bij het hanteren van de apparaten in het algemeen moet extra voorzorgsmaatregelen worden genomen om de apparaten niet te stoten of te laten vallen. Tijdens het verlijmen van de membraanchip op armatuur A1 moet de chip plat en gecentreerd op de pilaar van armatuur A1 worden gelegd om te voorkomen dat het membraan scheurt tijdens de verlijming aan component 1. Verder moet elk contact met de blootgestelde PSA-lagen worden vermeden na het verwijderen van beschermende maskers. Bij het hanteren van component 2 na het verwijderen van de beschermende maskers, is het raadzaam om het langs de rand van het onderdeel te houden en een pincet te gebruiken om de driehoekige hoek vast te pakken die PSA-vrij is.
Hoewel celkweekprotocollen werden beschreven voor mogelijke BBB-modellen, kan het BMEC/pericyte co-cultuurmodel van de BBB dat hier wordt beschreven voldoende of onvoldoende zijn, afhankelijk van de fysiologische context en interessante vragen. Het transport van immuuncellen vindt bijvoorbeeld grotendeels plaats in de postcapillaire venulen van de hersenen41,42. In deze regio’s scheidt een perivasculaire ruimte de BMEC/perocytenbarrière van de gliale limieten die door astrocyten zijn vastgesteld. In postcapillaire venulen bestaat de neurovasculaire eenheid (NVU) dus uit twee fysiek gescheiden barrières in serie, en astrocytaire eindvoeten maken geen rechtstreeks contact met de BMEC/pericyte bloedbarrière, die goed wordt weergegeven door het huidige model. Als het doel een NVU-model is dat rekening houdt met de impact van door astrocyten uitgescheiden factoren op de bloedbarrière, kan een astrocytencompartiment aan het apparaat worden toegevoegd dat oplosbare factoruitwisseling door de perivasculaire ruimte mogelijk maakt. Dit voorbeeld werd eerder geïllustreerd34 en zou kunnen worden uitgebreid met andere cellen zoals microglia en neuronen in een 3D ‘hersen’-compartiment. De modulaire architectuur van het platform maakt het mogelijk om eenvoudige assemblagestrategieën te gebruiken om deze herconfiguraties te realiseren, zodat het platform zo eenvoudig of complex is als nodig is om de hypothesen aan te pakken. Elke opstelling van de celkweek; moet echter worden geoptimaliseerd voor nieuwe cellijnen en multiculturen. Vanwege de eigenschappen van de siliciumnitridemembranen kan het bijvoorbeeld nodig zijn om coatingoplossingen aan te passen in vergelijking met weefselkweekplaten. De opname van fibronectine helpt meestal bij celhechting en overleving. Verder zouden gebruikers endotheelcellen en pericyten in tegengestelde richtingen kunnen kweken. In dit geval kan het nodig zijn om bijvoorbeeld de manier waarop de permeabiliteitsmetingen worden uitgevoerd en geïnterpreteerd aan te passen. Het geven van stappen voor dit soort cultuur valt echter buiten het bestek van dit document.
Een andere uitdaging die men kan tegenkomen tijdens celkweek is de snelle verdamping van media, aangezien de apparaten gevoeliger kunnen zijn voor veranderingen in de omgeving in vergelijking met standaard weefselkweekplaten en kolven. Als er overmatige verdamping wordt waargenomen of de celgroei wordt vertraagd, moeten alle kritische incubatorparameters worden gemeten om nauwkeurige instellingen te garanderen. Er kan meer water worden toegevoegd aan de weefseldop of het kleine petrischaaltje dat in de celkweekkamer is geplaatst, of media moeten vaker worden verwisseld. Verder kunnen luchtbellen het onderste kanaal binnendringen en vast komen te zitten in de greppel voor greppel-neerwaartse apparaten. Hoewel ze kunnen worden verwijderd, is het het gemakkelijkst om in de eerste plaats geen bubbels toe te voegen. Om dit te doen, is het belangrijk om te controleren of er geen luchtbellen in de pipetpunt of lucht aan het uiteinde van de pipetpunt zitten voordat u het pipetteermedium in de onderste kamer brengt. Verder kan mediaverdamping in het kanaal leiden tot een opening tussen het mediaoppervlak en de bovenkant van de poort. Een kleine hoeveelheid media kan in de ene poort worden gepipetteerd totdat de media het oppervlak van de tegenoverliggende poort bereikt, waarna de media in die tegenoverliggende poort kunnen worden uitgewisseld. Hoewel hECSR- en E6 + 10% FBS-media niet in het waterbad mogen worden opgewarmd, kunnen andere media worden voorverwarmd om de vorming van luchtbellen te verminderen. Als er toch een luchtbel in de onderste kamer komt, kan deze worden verwijderd door snel 100 μL door het kanaal te pipetteren. Deze methode kan echter leiden tot verontreiniging tussen kamers of media die over het oppervlak van het apparaat worden gemorst. Het kan ook de cellagen verstoren. Als alternatief kunnen de media eerst uit het kanaal worden verwijderd en vervolgens opnieuw worden geïntroduceerd met een volume van 50 μL. Als u echter eerst de media verwijdert, kan dit leiden tot meer luchtbelvorming in het kanaal. Als een luchtbel zich niet direct onder het membraangebied bevindt, kan deze in het kanaal worden achtergelaten zonder effecten op de celkweek.
Aanhechting en groei van pericyten, zoals aangetoond in figuur 2, kan een uitdaging zijn. Het gebruik van een geoptimaliseerde zaaidichtheid is essentieel voor de vorming van een laag met een fysiologisch relevante pericyt-endotheelcelverhouding. Verder, omdat de pericyten gevoelig zijn voor afschuiving, moeten alle media-uitwisselingen in het kanaal zeer langzaam worden gedaan om de cellen te beschermen. Voor BPLC-kweek kan een verbeterde hechting worden bereikt door de onderste kamer te coaten met 800 μg/ml collageen type IV of 100 μg/ml fibronectine.
Immunocytochemie in apparaten die hier worden beschreven, maakt kwalitatieve analyse van de gezondheid en functie van cellen mogelijk. Methoden voor kleuring in weefselkweekplaten of andere platforms moeten direct naar het platform kunnen worden vertaald. Voor celkweek in alleen de bovenste kamer kan PBS na fixatie in de onderste kamer worden toegevoegd en voor de resterende stappen worden gelaten, waarbij blokkering en kleuring alleen in de bovenste kamer worden gedaan. Dit minimaliseert de risico’s op het breken van de vliezen of het krijgen van luchtbellen in de onderste kamer. Voor co-cultuur kleuring raden we aan om beide kamers in alle stappen te gebruiken. Het is belangrijk op te merken dat de viscositeit van het fixeermiddel en PBS verschilt van die van media. Het kan dus gemakkelijker zijn om luchtbellen in de onderste kamer toe te voegen en er moet extra aandacht aan worden besteed om pipetpunten aan het uiteinde van de tip op lucht te controleren voordat u in de onderste kamer pipettert.
Het protocol dat is beschreven voor de permeabiliteitstest van kleine moleculen maakt een functionele en kwantitatieve beoordeling mogelijk van de barrièrefunctie van de endotheelcellen die in het μSiM-apparaat zijn gekweekt. Een probleem dat zich tijdens deze test kan voordoen, is het aanzuigen van luchtbellen in de pipet tijdens het nemen van monsters uit het onderste kanaal bij protocolstap 4.1.7.4. Om dit probleem te voorkomen, is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de punt in de poort is verzegeld voordat u begint met het verzamelen van monsters en dat het monster niet te snel mag worden afgenomen. Als dat het probleem niet oplost, kan de grootte van de gebruikte tips te klein of te groot zijn om in de poorten te passen; gebruik de tips in de materiaaltabel. Als er onverwacht hoge permeabiliteitswaarden worden gemeten ondanks een gezond ogende confluente monolaag, moet de integriteit van de monolaag tijdens de monsterafname worden gecontroleerd op verstoring. We raden aan om de monolaag altijd direct na het afnemen van het monster onder de microscoop te controleren. Als de monolaag nog intact en gezond lijkt, kan het monster worden gefixeerd en kunnen biologische markers van barrièrefunctie worden beoordeeld, bijvoorbeeld via immunokleuring van de junctie-eiwitten. Omgekeerd is het belangrijk om ervoor te zorgen dat 50 μL media uit het onderste kanaal wordt bemonsterd zonder luchtbellen als er onverwacht lage permeabiliteitswaarden worden gemeten. Als er medium uit de bemonsteringspoort komt zodra de punt van het reservoir is geplaatst, moet dat medium worden opgevangen voordat de pipet in de bemonsteringspoort wordt geplaatst, aangezien het grootste deel van het fluorescerende kleine molecuul aanwezig zal zijn in het initiële volume van 10 μl dat uit het onderste kanaal wordt bemonsterd. Door cirkels rond de poorten te tekenen met een hydrofobe pen of een hydrofobe tape met een gat rond de poort te plaatsen, wordt voorkomen dat passief verpompte media zich verspreiden. Als er tijdens de bemonstering belletjes worden opgezogen of als het volledige monster van 50 μl niet wordt verwijderd, mag het monster niet worden gebruikt. Als alternatief kan het exacte volume worden bepaald en gebruikt in de permeabiliteitsberekening; dit mag echter alleen worden gedaan als het verwijderde volume ≥40 μL is, wat overeenkomt met ~98-99% kleurstofterugwinning34.
The authors have nothing to disclose.
J.L.M., B.E., T.R.G., M.C.M., P.K., M.T., K.C. en L.W. werden gefinancierd door NIH-subsidie R33 HL154249. J.L.M. werd gefinancierd door R44 GM137651. M.M. werd gefinancierd door de Schmidt Program Award Del Monte Institute for Neuroscience, University of Rochester. MT werd gefinancierd door RF1 AG079138. K.C. werd gefinancierd door de International Foundation for Ethical Research.
Antibodies | |||
CD31 Polyclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-32321 | |
Claudin-5 mouse IgG antibody, 4C3C2 | Thermo Fisher Scientific | 35-2500 | |
Goat α-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11001 | |
Goat α-Rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A11011 | |
Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
NG2, mouse IgG2a, 9.2.27 | Millipore | MAB2029 | |
Occludin mouse IgG antibody, OC-3F10 | Thermo Fisher Scientific | 33-1500 | |
PDGFRβ, rabbit IgG antibody, 28E1 | Cell Signaling Technology | 3169 | |
VE-cadherin mouse IgG2B Clone # 123413 | R&D Systems | MAB9381 | |
ZO-1 rabbit IgG antibody, polyclonal | Thermo Fisher Scientific | 40-2200 | |
Chemicals, peptides, and recombinant proteins | |||
100% Methanol | VWR | 101443-718 | Can be substituted with similar products |
16% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Can be substituted with similar products |
Accutase | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
Acetic acid | Sigma-Aldrich | 695092 | |
B27 supplement | Thermo Fischer Scientific | 17504044 | |
bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 | |
Collagen IV from human placenta | Sigma-Aldrich | C5533 | |
Collagen, Type I solution from rat tail | Sigma-Aldrich | C3867-1VL | Can be substituted with similar products |
DMEM/Ham’s F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
Essential 6 medium | Thermo Fisher Scientific | A1516401 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Peak Serum | PS-FB1 | |
Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141 | |
Fibronectin human protein, plasma | ThermoFisher Scientific | 33016015 | Can be substituted with similar products |
hESFM | Thermo Fisher Scientific | 11111044 | |
Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma-Aldrich | 861502 | |
Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific | 500627 | Can be substituted with similar products |
PBS without calcium, magnesium | Cytiva | SH30256.01 | Can be substituted with similar products |
Pericyte Medium | ScienCell | 1201 | Use complete kit (includes supplements) |
Poly-L-Lysine, 10 mg/mL | ScienCell | 0413 | |
Triton X-100 | JT Baker | X198-05 | Can be substituted with similar products |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Invitrogen™ | 10977015 | Can be substituted with similar products |
Experimental models: Cell lines | |||
Blood-brain barrier hCMEC/D3 cell line | Sigma-Aldrich | SCC066 | |
Human brain vascular pericytes | ScienCell | 1200 | |
iPS(IMR90)-4 human induced pluripotent stem cells | WiCell | RRID:CVCL_C437 | |
Glassware and Plasticware | |||
150 mm TC-treated Cell Culture Dish with 20 mm Grid | Falcon | 353025 | |
Clamps | VWR | MFLX06832-10 | |
Corning tissue culture plates (6-well) | Corning | 3506 | |
Flat 96-well non-binding microplates | Greiner Bio-One | 655900 | |
Microscope Slide Device Holder | SiMPore | USIM-SB | Dimensions compatible with micropscope slide holders |
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fischer Scientific | 339651 | |
Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fischer Scientific | 339653 | Tube caps can be filled with water for cell culture |
P20-200 pipette tips | VWR | 76322-516 | Alternate brands may not seal as effectively into ports |
Transwell filters (12 well, 12 mm, 0.4 μm pore size, PC) | CoStar | 3401 | |
Instruments | |||
10X Objective (For Andor) | Nikon Instruments Inc. | MRD00105 | Air; WD: 4 mm; NA 0.45 |
10X Objective (For Nikon) | Nikon Instruments Inc. | MRP40102 | Air; WD: 6.2 mm; NA 0.25 |
40X Objective (LWD) (For Andor) | Nikon Instruments Inc. | MRD77410 | Water immersion; WD: 590-610 mm; NA 1.15 |
Andor Spinning Disc Confocal microscope | Oxford Instruments, Andor | ||
Nikon Eclipse Ts2 Phase Contrast Microscope | Nikon Instruments Inc. | Can be substituted with similar products | |
TECAN Infinite M200 | TECAN | Can be substituted with similar products | |
Other | |||
Advanced PAP Pen | Millipore Sigma | Z672548 | 2 mm tip is recommended |
Assembly kit with fixtures | SiMPore | USIM-JIGSET | Including fixure A1, A2, B1, and B2 |
Camera Adapter for Microscopes | AmScope | CA-CAN-SLR Canon SLR / D-SLR | Φ23.2 – Φ30 adapter fits Nikon Eclipse Ts2 |
Canon EOS Rebel SL3 DSLR Camera | Canon | EOS 250D, BH #CAEDRSL3B, MFR #3453C001 | Can be substituted with similar products |
Cell strainer, 40 µm | Millipore Sigma (Corning) | CLS431750 | |
Component 1 | SiMPore | USIM-C1 | |
Component 2 | SiMPore | USIM-C2 | |
Membrane chips | SiMPore | NPSN100-1L | Other chips formats are available |
SMD handling tweezer double angle | Techni-Tool | 758TW003 | "Chip Tweezers" |
Stainless steel precision type GG tweezer | Techni-Tool | 758TW534 | "Straight Tweezers" |
Software | |||
Fiji | ImageJ | For image processing | |
Fusion | Oxford Instruments, Andor | Instructions for version 2.3.0.44 | |
i-control | TECAN | Instructions for version 2.0 | |
Imaris | Oxford Instruments | For image processing. Instructions for version 9.9.0 |