使用 MicroSiM （μSiM） 屏障组织平台对血脑屏障进行建模

1. μSiM器件组装 注意：此方法描述设备的组装。膜片有沟槽面和平面，可沟槽上下组装。沟槽装置最常用于细胞培养。 在无菌环境（即生物安全罩）中，准备所有组装材料，包括组装夹具、组件、膜片和镊子。 使用片式镊子将膜片放在夹具 A1 的中心。对于沟槽式器件，芯片的平面朝下，沟槽区域朝上，反 之亦然 。注意： 以下组装步骤以沟槽下装置为例ample，该装置允许在顶部腔室中具有平坦的生长区域。 将组件 1 粘接到芯片上。首先，用直镊子撕下组件 1 两侧的蓝色保护层，并将其放入夹具 A1 中，顶部腔室朝下。轻轻向下按压组件 1，直到压敏胶 （PSA） 接触芯片。 将夹具 A2 放在夹具 A1 上，并在不同的角落施加牢固的压力，以确保芯片和组件紧密配合。注意： 一定不要取下 PSA 层。与蓝色保护层相比，它是一种透明且更坚硬的层。 用芯片将组件 2 与组件 1 粘合。首先，用直镊子抓住组件 2 的一个角并将其从片材上剥离，以准备组件 2。然后，抓住组分 2 的非 PSA“三角形”区域，一起去除组分 2 的厚透明保护层和蓝色层，露出 PSA 表面。将组件 2 放在夹具 B1 中，PSA 面朝上。 将组件 1 与膜芯片一起放入夹具 B1 中，顶部腔室朝上。 将夹具 B2 放在组件 1 上，并在夹具 B2 的不同角落施加牢固的压力。 将组装好的装置从夹具中取出，用直镊子压出装置底部的任何气泡，并密封通道的边缘，避免与膜区域接触。在用于细胞培养之前，对新组装的设备进行紫外线 （UV） 灭菌 20 分钟。 2. 细胞培养 注：此方法描述了平台上原代和hiPSC衍生培养物的方案。这些方法描述了在装置的顶部腔室中进行内皮细胞单一培养，以及在沟槽组装装置的底部腔室中与周细胞和内皮细胞在顶部腔室中共培养的周细胞和内皮细胞。有关腔室尺寸和体积，请参见 表 1。这些是最常见的格式;但是，可以根据用户需求使用其他细胞培养布局。 细胞培养室制备按照第 1 节中详述的协议组装设备。 将设备放入无菌软管夹中amps.在细胞培养之前，通过将夹子浸泡在乙醇中≥20分钟来对夹子进行灭菌。每次实验后重新消毒以备重复使用。 在大型无菌培养皿中培养装置。为了获得额外的湿度，添加一个小培养皿或装满无菌水的 50 mL 锥形管盖。 用 100 μL 无菌水清洗设备的顶部腔室两次。对于底室细胞培养，用 20 μL 无菌水洗涤底室。 hCMEC/D3 细胞系 （BBB） 单培养根据第2.1节准备细胞培养室。 用25μg/ cm 2的胶原I和5μg/cm 2的人纤连蛋白混合在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中涂覆顶部腔室。让它在37°C静置1-2小时或在4°C下过夜。 除去包衣溶液，向上腔室中加入 100 μL 预热的生长因子耗尽内皮培养基（测定培养基），向下腔室中加入 20 μL。为了制备测定培养基，混合 100 mL 内皮基础培养基 + 400 μL 人成纤维细胞生长因子 + 40 μL 氢化可的松 + 100 μL 硫酸庆大霉素 + 2 mL 胎牛血清。 根据制造商的方案传代 hCMEC/D3 细胞;胰蛋白酶消化细胞在37°C培养箱中3-5分钟，然后通过加入预热的内皮培养基停止胰蛋白酶消化。将细胞悬浮液转移到离心管中，并在室温下以200×g离心5分钟。将细胞沉淀重悬于测定培养基中，并以 40,000-60,000 个细胞/cm2 的密度将细胞接种在顶部腔室中。将装置在37°C下用5%二氧化碳（CO 2）孵育2-4小时，以促进细胞粘附。例如，要在 0.37 cm 2 芯片上达到 40,000 个细胞/cm2，向顶部腔室中加入 100 μL 浓度为 150,000 个细胞/mL 的细胞溶液。注：我们根据 Hudecz 等人 38 培养和传代 hCMEC/D3，使用改良的内皮生长培养基-2 （EGM-2） 配方进行细胞维持，并在传代培养后使用生长因子还原的“测定培养基”进行测定。其他培养基配方应与设备兼容，但如果用户遇到 hCMEC/D3 存活问题，我们推荐使用 Hudecz 等人 38 的培养基配方。 细胞粘附2-4小时后，在两个腔室中与新鲜的测定培养基交换以除去死的或未附着的细胞。 将装置保持在37°C和5%CO 2，每2-3天在两个腔室中交换测定培养基，直到实验。检测通常在培养 2 周后进行。 hiPSC衍生的EECM-BMEC样细胞单培养根据第2.1节准备细胞培养室。 通过将 5 mL 的 0.5 mg/mL 乙酸加入 5 mg 胶原 IV 中以制备 1 mg/mL 溶液，从人胎盘溶液制备胶原 IV。让溶液在4°C下静置≥4小时以完全复溶。该溶液在4°C下稳定2周。 用 100 μL 4：1：5 比例的胶原 IV、牛纤连蛋白和无菌水涂覆顶部腔室。在37°C下涂覆2-4小时。 除去包衣溶液，向顶部腔室加入 100 μL 室温 hECSR，向下腔室加入 20 μL。 根据 Nishihara 等人 37 传代 EECM-BMEC 样细胞;向细胞中加入细胞分离酶混合物，并转移到37°C培养箱中5-8分钟。移液细胞溶液以使其单一化，并在离心管中加入4倍体积的内皮培养基。在室温下以200× g 离心5分钟;将细胞重悬于hECSR中，并以40,000个细胞/ cm2的密度在顶部腔室中接种。将设备在37°C下用5%CO 2孵育2-4 小时以促进细胞粘附。例如，要达到 40,000 个细胞/cm2，添加 100 μL 细胞溶液，浓度为 150,000 个细胞/mL。 细胞粘附2-4小时后，在两个腔室中与新鲜的hECSR交换以除去死的或未附着的细胞。 将装置保持在37°C和5%CO 2，每1-2天在两个腔室中交换hECSR，直到实验。检测通常在培养的第 6 天进行。 hCMEC/D3 和原代人脑血管周细胞 （HBVP） 共培养在设备组装之前，用混合在PBS中的2μg/cm 2 聚-L-赖氨酸（PLL）涂覆膜芯片。将 50-80 μL PLL 以液滴形式施加到最终设备组件中朝下的一侧。在37°C下1-2小时或在4°C下过夜完成涂层过程。 去除涂层溶液。用无菌超纯水清洗膜片并使其干燥。 按照上文第1节详述的方案组装设备，PLL涂层面朝下，并根据第2.1节准备细胞培养室。 根据第 2.2.2 节涂覆顶部腔室。 向顶部腔室中加入 50 μL 预热的周细胞培养基，向下部通道加入 20 μL。 根据制造商的方案传代HBVP;胰蛋白酶消化细胞在37°C培养箱中3-5分钟，然后通过加入预热的周细胞培养基停止胰蛋白酶消化。将细胞悬液转移到离心管中，并在室温下以200× g 离心5分钟。将细胞沉淀重悬于周细胞培养基中，并以14,000-25,000个细胞/ cm2的密度将细胞接种在底部腔室中。反转设备，但保持与顶部腔室的空气接口，以促进气体交换。注意： 反转过程中所需的空气接口可以通过将设备放入软管夹内后翻转来实现amp 并在翻转之前向下推所有角落，或者将设备倒置在平行的丙烯酸或硅胶条上，间隔足够远以保持顶部腔室畅通无阻。可能需要针对每个用户优化播种密度。要达到 14,000 个细胞/cm2，加入 20 μL 细胞悬液，浓度为 ~590,000 个细胞/mL。请注意，将 20 μL 移液到底部腔室以避免气泡，但使用 10 μL 的底部腔室体积计算密度。 将细胞在37°C下用5%CO 2在倒置位置孵育2-4 小时，以促进细胞粘附。 细胞粘附2-4小时后，将装置直立翻转，并在两个腔室中与新鲜的周细胞培养基交换，以除去死亡或未附着的细胞。 周细胞接种后，按照步骤2.2.4-2.2.5在顶部腔室中接种hCMEC / D3s。将两个腔室切换到测定培养基。 将装置保持在37°C和5%CO 2，每1-2天在两个腔室中交换测定培养基，直到实验。原代细胞共培养通常在测定前维持 6-8 天。注意：如果将 HBVP 单一培养物与 hCMEC/D3 单一培养物或 hCMEC/D3 和 HBVP 共培养物进行比较，则在接种 HBVP 后 2-3 天将周细胞培养基与测定培养基交换。 hiPSC 衍生的 EECM-BMEC 样细胞和脑周细胞样细胞 （BPLC） 共培养根据第2.1节准备细胞培养室，并按照步骤2.3.2-2.3.3涂覆顶部室。 除去包衣溶液，向顶部腔室中加入 50 μL 室温 Essential 6 培养基 + 10% 胎牛血清 （E6 + 10% FBS）。 根据 Gastfriend 等人 39 通过 BPLC;向细胞中加入细胞分离酶混合物，并转移到37°C培养箱中5-15分钟，直到~90%的细胞变圆。移液细胞溶液以单异化并在 50 mL 离心管中加入 4 倍体积的 DMEM/F12，使用 40 μm 细胞过滤器过滤并完全单异细胞。转移到 15 mL 离心管中，在室温下以 200 × g 离心 5 分钟，将细胞沉淀重悬于 E6 + 10% FBS 中，并以 14,000-25,000 个细胞/cm2 的密度将细胞接种在底部腔室中。反转设备，但与顶部腔室保持空气接口，以促进气体交换。注意： 反转过程中所需的空气接口可以通过在将设备放入软管夹内后翻转来实现amps 并在翻转之前向下推所有角，或者将设备倒置在平行的丙烯酸或硅胶条上，间隔足够远以保持顶部腔室畅通无阻。可能需要针对每个用户优化播种密度。要达到 14,000 个细胞/cm2，加入 20 μL 细胞悬液，浓度为 ~590,000 个细胞/mL。请注意，将 20 μL 移液到底部腔室以避免气泡，但使用 10 μL 的底部腔室体积计算密度。 将细胞在37°C下用5%CO 2在倒置位置孵育2-4 小时，以促进细胞粘附。 细胞粘附2-4小时后，将装置直立翻转，并在两个腔室中与新鲜的E6 + 10S交换，以除去死的或未附着的细胞。 周细胞接种后一天，按照步骤2.3.5-2.3.6在顶部腔室中接种EECM-BMEC样细胞。将两个腔室切换到 hECSR。 将装置保持在37°C，含5%CO 2，每1-2天在两个腔室中更换测定培养基，直到实验。在测定之前，BPLC 的 hiPSC 衍生共培养通常维持 7 天，EECM-BMEC 样细胞维持 6 天。注意：如果将BPLC单培养物与EECM-BMEC单一培养物或EECM-BMEC和BPLC共培养物进行比较，则在接种BPLC后1天将E6 + 10S与hECSR交换。 3. 免疫细胞化学 注：该方法描述了在膜的顶部和/或底部培养的细胞的免疫细胞化学染色和成像方案。本实验的目的是确定应在 BBB 中发现的关键蛋白质的存在和位置，例如粘附和紧密连接蛋白以及细胞身份蛋白。替代染色和活体染色方法也与该平台兼容。 设备上的固定和染色将一抗放在冰上解冻。 在室温下制备 4% 多聚甲醛 （PFA） 溶液（例如，将 16% PFA 稀释在其体积的 3 倍 PBS 中）或在 -20 °C 下冷却 100% 甲醇。 根据 表 2 创建适当的封闭解决方案。储存在冰上。注意：可能需要涡旋溶液才能完全溶解Triton X-100。 通过将 20 μL 固定剂（例如 PFA 或甲醇）移液到底部腔室中，将 50 μL 移液到顶部腔室中来固定细胞。将设备在室温下孵育 10 分钟（PFA）或 2 分钟（甲醇）。 将 20 μL PBS 移液到底部腔室，将 100 μL 移液到顶部腔室中，洗涤 3 x 5 分钟。 在室温下封闭30分钟，将20μL封闭溶液加入底部腔室，将50μL封闭溶液加入顶部腔室。检查底部腔室中是否有气泡。 根据 表2，通过在封闭溶液中稀释抗体来制备一抗溶液。储存在冰上。 通过向底部腔室中加入 20 μL 一抗溶液并用 50 μL 一抗溶液替换顶部腔室的体积，用一抗染色。检查底部腔室中是否有气泡。在室温下孵育1小时或在4°C下孵育过夜。 将 20 μL PBS 移液到底部腔室，将 100 μL 移液到顶部腔室中，洗涤 3 x 5 分钟。 根据 表2，通过在封闭溶液中稀释抗体来制备二抗溶液。存放在避光的冰上。 通过向底部腔室中加入 20 μL 二抗溶液并用 50 μL 二抗溶液替换顶部腔室的体积，用二抗染色。检查底部腔室中是否有气泡。在室温下避光孵育1小时。 将 20 μL PBS 移液到底部腔室，将 100 μL 移液到顶部腔室中，洗涤 3 x 5 分钟。 制备核染色溶液。在 PBS 中以 1：10,000 的比例稀释 Hoechst。向底部腔室中加入 20 μL 核染色溶液，并用 50 μL 核染色溶液替换顶部腔室的体积。检查底部腔室中是否有气泡。在室温下避光孵育 3 分钟。 通过向底部腔室中加入 20 μL PBS 并用 100 μL PBS 替换顶部腔室的体积来去除污渍。立即对设备进行成像或将它们储存在4°C下，培养皿包裹在封口膜中并避光，直到准备好成像。 共聚焦成像注：本节介绍使用具有长工作距离 （LWD） 40 倍物镜（水，WD 590-610，数值孔径 1.15）的倒置转盘共聚焦显微镜对设备进行成像。有关工作距离和镜头兼容性，请参阅 McCloskey 等人 34 中的补充材料。整个膜区域的图像也使用10倍物镜拍摄，以确保40倍图像能够代表整个区域。这些通常是在宽场拍摄的。打开显微镜并打开成像软件。 使用 共聚焦成像模式，根据二抗和核染色的特性设置通道。优化激光功率和曝光时间，确保信号高于背景并减少成像伪影。对于赫斯特核染色，使用激发 405，发射 450/50 带通 （BP），曝光时间 500 ms，激光功率 50%。对于使用偶联 Alexa Fluor （AF） 488 的二抗的标记物，请使用激发 488、发射 525/50BP、500 ms 曝光时间和 50% 激光功率。对于使用偶联 AF568 的二抗的标记物，请使用激发 561、发射 600/50BP、500 ms 曝光时间和 100% 激光功率。 将设备放入显微镜载玻片装置支架中，顶部腔室朝上，并使用显微镜载玻片支架将其置于显微镜中。打开 直播 并选择核染色的通道。使用低物镜找到膜，确保透明氮化硅膜区域居中，因为光线不会穿过蓝色固体硅胶区域。一旦设备正确居中并找到细胞层，切换到 40 倍物镜，润湿物镜，并使用核染色剂作为引导聚焦在膜区域。 打开 z-stack 成像并将扫描模式设置为开始/结束。设置步长或计数。使用显微镜上的粗调旋钮，将扫描起点设置为内皮细胞层的顶部，以核染色剂为引导，扫描端位于周细胞层的底部，以核染色剂为引导。检查所有通道，确保在成像场中捕获所有内容。注意：我们通常使用自动步进，即~0.2μm切片。 设置图像名称并按 获取 开始成像。根据需要在不同区域重复上述步骤。 使用 ImageJ40 或 Imaris 处理共聚焦图像。要在Imaris中进行处理，请将图像文件拖到程序中打开。选择顶部菜单栏上的 “剖面 ”以查看 x-y 平面的 2D 图像以及 x-z 和 y-z 平面的相应视图。选择顶部菜单栏上的“ 3D 视图 ”以查看 3D 图像。单击图像并拖动它进行旋转。在顶部菜单栏上选择 快照 以拍摄图像。 4. 小分子渗透率的取样测定 注：本节介绍一种定量测量细胞培养物屏障特性的方法。该实验的目的是检测穿过细胞层并进入平台底部腔室的荧光小分子的浓度。然后使用这些数据来计算细胞通透性。 取样技术按照第 1 节中详述的方案组装设备，并按照第 2 节所述培养所需的细胞系。包括一个额外的设备，用作无电池涂层控制设备，以测量系统渗透率。注意：建议每种条件至少进行三次技术重复;然而，只需要一个涂层对照的复制品。 在开始采样测定之前，用新鲜培养基替换底部腔室的培养基。在显微镜下检查每个装置中内皮单层的汇合度。注意细胞单层中的任何间隙，因为这会影响染料向底部腔室的扩散。注意：健康的内皮培养物应 100% 汇合。 在细胞培养基中制备荧光小分子溶液（例如，150μg/ mL Lucifer Yellow，457 Da）。制备过量体积的荧光小分子溶液，用于制备标准溶液，作为参考，计算从底部通道采样的荧光小分子的浓度。注：我们建议制备 400 μL 过量溶液，用作荧光小分子浓度最高的标准溶液。 用 100 μL 荧光小分子溶液替换顶部孔中的培养基。注意： 我们建议使用疏水笔在采样口周围画圆圈，等到疏水性墨水完全干燥后再添加荧光染料溶液。这样可以防止介质从步骤 4.1.7 中采样端口周围的底部通道扩散。我们建议错开将荧光小分子溶液加入顶部孔中 – 等待 2 分钟后再将荧光溶液添加到下一个设备中，或以 3 个为一组（同时将溶液添加到三个设备中，等待 5 分钟以添加下一个三个设备）。 将设备在37°C，5%CO2 下孵育1小时。 在上一步的1小时长孵育期间，通过从步骤4.1.3中制备的荧光小分子溶液进行2倍连续稀释来制备标准溶液。将 50 μL 每种溶液移液到平底黑色 96 孔板中，一式三份。使用空白细胞培养基作为基线标准溶液。注：为了制备标准溶液，我们建议以最终体积为200μL进行11次连续稀释，并使用细胞培养基作为空白来测量基线荧光强度。将步骤4.1.3制备的过量荧光小分子溶液转移至含有200μL培养基的试管中，充分混合，并将200μL该溶液转移到含有200μL培养基的下一个试管中。重复 1：2 稀释，直到总共有 10 个试管。在96孔板（B1，C1，D1）中一式三份地将50μL最浓缩的标准溶液移入第1列中，将第2个最浓缩 的溶液移入第2列（B2，C2，D2）中，依此类推。对于板中的第 12 列，移液 50 μL 空白培养基，一式三份（B12、C12、D12）。 执行以下步骤，从底部通道取样荧光小分子溶液。从孔中取出荧光小分子溶液以停止扩散过程。 将装有 50 μL 培养基的吸头放入上端口以用作储液器，方法是将装有 50 μL 的吸头插入端口，提起设备，并在握住顶部的同时轻轻弹出吸头以稳定。放下设备。确保移液器吸头中没有气泡或移液器吸头没有空气，以免在采样过程中将气泡添加到底部腔室中。 将 50 μL 培养基加入顶部孔中，以防止在采样过程中破坏细胞单层。 为了从底部通道取样溶液，将带有空移液器吸头的移液器推至其第一个阻力，将吸头插入取样口，然后从底部通道反向移出 50 μL 溶液。直接转移到含有标准溶液的平底黑色 96 孔板中。注意：我们建议在采样后立即在显微镜下检查细胞单层。从底部通道抽取培养基偶尔会导致顶部孔中的细胞层破裂，这可能会导致渗透率测量不一致。在 4.1.7 中的各个步骤中快速工作将有助于防止这种情况。 使用所用荧光小分子的适当激发和发射波长参数测量酶标仪中的荧光强度。对于 Lucifer Yellow，使用 428 nm 激发和 536 nm 发射，以获得最佳增益。从板的顶部测量荧光。将板加入酶标仪，突出显示带有样品的孔（包括标准曲线），然后选择 开始 读取孔。 渗透率值的计算（模板见 补充文件 1 ）从所有测得的荧光强度值中减去空白培养基的平均荧光强度值。 使用公式（1）计算系统磁导率 Ps：（一）其中 [A]A 是从底部通道收集的荧光小分子的浓度，V 是采样并添加到板中的体积 （0.050 mL），[A]L 是添加到顶部孔中的荧光小分子的浓度（例如 0.15 mg/mL），t 是孵育时间（以 s 或 min 为单位，具体取决于所需的单位）， S为膜表面积（0.014cm2）。使用通过绘制荧光强度输出和标准溶液已知浓度的标准曲线获得的方程计算[A]A 。通过将实验样品的荧光强度值（y）插入方程式中来计算实验样品的浓度（x）。注意：使用标准曲线的线性部分。我们建议从显微镜下拍摄的膜图像测量膜表面积，因为膜面积可能因批号而异，如果它们与涂层对照不同，可能会显着影响计算出的渗透率值。 使用公式（2）计算细胞单层 Pe的渗透率：（二）其中，PS 是在步骤 4.2.2 中计算的系统磁导率，PC 是无细胞涂层控制装置的系统磁导率值。