蛍光および共焦点イメージングのためのトウモロコシ葉原基の横断切片および展開されたマウント全体を調製するための改善された方法

1.トウモロコシの葉の発達のステージングと実験の設計 植物の成長と葉の発達の段階実験に使用する植物の年齢と発達段階を決定し、葉の発達の詳細な病期分類を実行します。注:病期分類は、実験で使用される突然変異株またはトランスジェニック株と同じ遺伝的背景を持つ植物に対して実行することをお勧めします。SAMは、遺伝的背景と成長条件に応じて、20〜25 DAGの間に新しい葉の生産を停止します。このため、ここで説明する方法は、7〜14 DAGのトウモロコシ苗に最適です。 適切な植物ケアプロトコル35に従って、温室または成長チャンバーでトウモロコシ植物を育てます。 土壌表面の下の茎である中胚軸を切って、小さなナイフまたはハサミで目的の年齢またはV段階の植物を収集します(図1A)。苗の横にある土に切削工具を慎重に挿入し、45°の角度で根元までスライドさせて中胚軸を切ります。 苗を土から持ち上げ、植物にしがみついている可能性のある残りの汚れや土の粒子をほこりで取り除きます。子葉鞘、若い苗の新芽を覆っている保護鞘を手で取り除きます。 各植物について、Vステージ、葉の数、および渦巻きから出てくる最後の葉の長さを記録します。後で参照できるように植物の写真を撮ります。 古い葉を一枚ずつ取り除きます。これを行うには、中胚軸または茎の残骸で植物を保持し、鞘の基部から各葉を切り取り、歯科用プローブを使用して円を描くように鞘をそっと広げます(図1B)。注意: 周囲の葉をすばやく削除する方法については、手順2.1を参照してください。 約2倍の倍率の実体顕微鏡下で、サンプルが乾燥しないように、湿ったワイプでシュートの頂点の残りの部分を注意深く解剖します。SAM、P1、およびP2が見えるまで、針を曲げた歯科用プローブまたは細い鉗子のペアを使用して、各葉の原基をそっと切除して広げます(図1D)。各プラストクロンの外観と測定値を記録します。注: 補足ファイル1のトウモロコシ苗の葉発達病期分類の例を参照してください。 実験の計画注:実験を慎重に計画すると、効率を向上させることができます。たとえば、横断面解析では、特定のプラストクロンまたは領域をイメージングするときに切断するおおよその位置を決定することで、解剖時間を短縮できます。 図2 は、標準化されたサンプリングの例を示しています。さらに、FPまたは蛍光プローブの特性に基づいてイメージングパラメータを最適化することで、実験の効率を向上させることができます。ステージング情報をガイドとして利用して、特定のプラストクロン、原基領域、および組織に実験を集中させます。FPまたはその他の目的の蛍光プローブを使用して、いくつかのサンプルについて以下のセクション2および/または3に従ってください。注:https://www.maizegdb.org/data_center/stock で利用可能なトウモロコシFPマーカーline36-42シードストックを参照してください。 適切な検出器またはフィルター、励起および発光波長、ピンホールサイズ、その他の設定など、各FPレポーターまたはプローブに最適な画像取得パラメーターを決定します。設定を保存して、各実験の動作条件を再現します。注:発育中の葉の共焦点レーザー走査顕微鏡の技術ガイドラインについては、LinhおよびScarpella30 を参照してください。 FPレポーター43の半減期やその他の特性に基づいて撮影時間を計画する。注:実験を計画する際には、新鮮な植物サンプルがこの期間中に乾燥と細胞の変化を受けるため、解剖とイメージングの間の時間も考慮する必要があります。 図2:トウモロコシ葉原基の横断面分析のためのサンプリングスキーム。 (A、左)7 DAGトウモロコシ苗の近位シュート、P7で露出した4番目の葉(L4)を示す。破線は、原基に沿った0.5mmから10mmまでの7つのサンプリングポイントを示しています。 (A、右)葉の原基の概略図、および各プラストクロンの投影サイズと位置:P7(白);P6(マゼンタ);P5(青);P4(緑);そしてP3をSAM(黄色)まで。(B-H)Aに示すサンプリング点を表す横断面の蛍光画像で、10 mm(B)から0.5 mm(H)まで。原基は、(A)のプラストクロンの配色に従って擬似着色されています。切片は、自己蛍光用のロングパス発光UVフィルターを使用して落射蛍光顕微鏡で画像化されました。スケールバー = 200 μm (B-H)。この図は、RobilとMcSteen24の許可を得て変更および複製されています。略語:DAG =発芽後の日数。P =プラストクロン;SAM =頂端分裂組織を撃ちます。†=葉の鞘または適切な前結紮;* =頂端分裂組織を撃つ。** = ステム。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 2. トウモロコシ葉原基の横断面のイメージング 周囲の古い葉を取り除き、葉の原基を測定する手順1.1.3-1.1.4(図1A)で説明されているように、土壌表面の下の中胚軸で小さなナイフまたはハサミで慎重に切断して苗を収集します。 使用する正しいワイヤーストリッパーの穴のサイズと、シュートに沿ってカットを行う場所を決定します。穴がターゲット原基に収まるのに十分な大きさであることを確認してください。 シュートのより遠位の部分で切断を開始し、原基の先端が露出するまで徐々に基部に向かって作業します。 カットするには、あごをシュートに向けてワイヤーストリッパーを持ちます。選択した穴にシュートを配置し、ストリッパーハンドルを一緒に絞って葉の渦巻きを切ります。注意: ターゲット原基を誤って切断しないように、シュートの中心をワイヤーストリッパーの穴に注意深く合わせます。より大きな植物の場合は、ストリッパーを使用する前に、周囲の葉の一部を手で手動で取り除くことをお勧めします。注意: ワイヤーストリッパーには鋭い顎があり、慎重に使用しないと切り傷やその他の怪我を引き起こす可能性があります。 ハンドルを一緒に握り続けながら、ストリッパーをシュートからスライドさせて葉の上部を整えます。原基のターゲット領域が周囲の葉で覆われたままであることを確認します(補足図S1C、D)。注意: 上部の葉をトリミングした後、シュートには原基の先端が露出したままになります(カットの位置と使用するワイヤーストリッパー穴のサイズに応じて、P5、P6、またはP7。 図1E)。この原基は、若い原基の大きさと段階を推定するための基準として役立ちます。P6は、そのサイズ範囲とピン状の形態により、トウモロコシの苗に使用するための最も実用的なリファレンスです。 定規を使用して、原基の先端からシュートの根元までの長さを測定します。測定値を記録します。注:原基の基部に数ミリメートルの茎があるため、原基の長さはわずかに過大評価されます(図2A)。 葉の原基のフリーハンドセクショニングとイメージング約0.8倍の倍率の実体顕微鏡下で、ガラスのまな板やその他の傷のつきにくい材料などの滑らかな表面にシュートをしっかりと保持します。かみそりの刃またはメスを使用して、原基の長さに沿った目的のポイントでシュートの薄い部分(0.25〜0.8 mm)を切断します。 ターゲット領域の少し上に最初のカットを作成して、シュートの遠位部分を破棄し、次にターゲット領域の周りの薄い切片を取得します。きれいにカットするには、ブレードをシュートに対して垂直に持ち、滑らかで均一な動きで内側にスライドさせます。注:より大きな原基(P6またはP7)には、数ミリメートルの断面化の余裕がある場合があります。ただし、より小さな原基(P5以前)の場合、これらの原基はシュートの基部の最初の数ミリメートル以内に積み重ねられるため、1 mmはサンプリングに大きな違いをもたらす可能性があります( 図2A、F-Hを参照)。より細かい断面化には、両刃のかみそりの刃を使用することをお勧めします。注意: かみそりの刃やメスを使用するときは、偶発的な切り傷や怪我を防ぐために注意してください。 葉の鞘が刃を簡単に鈍らせる可能性があるため、かみそりの刃を定期的に交換してください。サンプルが乾くのを防ぐために、切片作成の各ラウンドの後に湿ったワイプでシュートを覆います。 リーフセクションをきれいなスライドガラス(75 mm x 25 mm)に取り付け、ピペットを使用して水滴(または50%グリセロール)をセクションに直接塗布し、カバースリップ(22 mm x 22 mm)を上に置きます。 蛍光色素を使用する場合は、色素溶液を切片に塗布し、カバーガラスを上に置き、必要に応じてインキュベートします。注意: 染料の種類によっては、次のステップに進む前に、リーフセクションを処理するための追加の手順が必要になる場合があります。これらの参考文献44、45、46、47は、植物細胞イメージングにおける蛍光色素の一般的な詳細および使用を提供する。核染色蛍光色素である5-エチニル-2′-デオキシウリジン(EdU)は、トウモロコシの葉の原基48の横断面に効果的に使用されています。対照的に、フェイマオ4-64(FM 4-64)やヨウ化プロピジウムなどの原形質膜染色色素は、満足のいく結果をもたらさない(図3A-D)。 スライドを落射蛍光または共焦点レーザー走査型顕微鏡のステージに置き、必要に応じて焦点と設定を調整して蛍光色素30を視覚化します。選択したトウモロコシFPレポーターラインに使用される照明および画像取得設定については、 表1 を参照してください。注:厚い切片は、高レベルのバックグラウンド自家蛍光を生成する可能性があります。この問題を軽減するのに役立ついくつかのイメージングおよび標本調製戦略を検討してください30,49(表2を参照)。注意: 目の損傷のリスクを減らすために、強力な光源やレーザーを扱うときは注意を払い、保護眼鏡を着用してください。 異なる倍率および検出チャネル(明視野照明を含む)でのリーフセクションを介した画像30。4倍の倍率を使用して横断面全体を画像化し、20倍または40倍の倍率を使用して特定の組織を画像化します。落射蛍光イメージングの高倍率での露光時間を短縮して、サンプルを急速な光退色から保護します(表1を参照)。 セクション全体または特定の関心領域(ROI)の画像をキャプチャします。必要に応じて、異なる焦点深度30で撮像された一連の画像であるzスタックを取得する。 zスタックを取得するには、まず試験片の上下の位置を決定し、次にこれらの位置間でキャプチャする必要がある光学セクションの数を決定します。光学セクションが少ないほど、各セクション間の距離である Z ステップ サイズが大きくなります。FPの特性と使用する倍率に応じて、トウモロコシの葉の原基の横断面をイメージングするために、1〜12μmのzステップサイズで3〜25の光学セクションをキャプチャします。注意: zスタックを平坦化するには、顕微鏡ソフトウェアまたはImageJ / FIJI34を使用して実行できる適切なボリュームレンダリング技術50を使用します(手順4.1および4.2を参照)。 すべての画像ファイルとそれに関連するメタデータ (使用可能な場合) を保存します。 表1:選択したトウモロコシFPレポーターの蛍光および共焦点イメージングに使用される照明および画像取得設定。 略語:FP =蛍光タンパク質;TRITC = テトラメチルローダミン;FITC = フルオレセインイソチオシアネート;WLL = 白色光レーザー;Arイオン=アルゴンイオンレーザー;HyD = ハイブリッド検出器;AU = エアリーユニット;Hz =ヘルツ、毎秒のスキャンライン。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。 3.トウモロコシの葉の原基の展開されたマウント全体のイメージング 原基を解剖し、ナノテープでスライドガラスを準備する手順1.1.3-1.1.4(図1A)で説明されているように、土壌表面の下の中胚軸で小さなナイフまたはハサミで慎重に切断して苗を収集します。 植物を解剖する前に、透明な両面ナノテープ(補足図S1H)でスライドガラス(75 mm x 25 mm)を準備します。長方形のナノテープを切り取り、きれいなスライドガラスの中央に貼り付けます。テープの上面にある保護プラスチックフィルムは剥がさないでください。メモ: 画像化するサンプルのサイズに応じて、使用するテープのサイズを決定します( 補足図S1I、Jの特大サンプルの例を参照)。ナノテープは、アクリルまたはポリウレタンゲル材料のいずれかで入手可能です。両方のタイプは、蛍光および共焦点イメージングに有効である24。テープの変色を防ぐため、暗い容器に保管して、長時間光にさらされないように保護してください。 手順2.1で説明するように、ワイヤーストリッパーで古い葉の上部を取り除くことにより、シュートの解剖を開始します。 中胚軸でシュートを持ち、歯のプローブで周囲の葉を慎重に取り除き、原基を抽出します。これを行うには、苗条の根元から葉を取り除き、関心のある原基が露出するまで一度に1つずつ広げます。 あるいは、ワイヤーストリッパーを使用して、シュートの基底領域に切り込みを入れることにより、葉の原基を直接抽出します(補足図S1E-G)。注:この方法では、原基がスナップするリスクが高くなります。 原基の取り付けとイメージング。テープから保護フィルムをはがします。露出した原基をテープの上に置きます。かみそりの刃を使用して基部で原基を切り、基底茎と胚軸を捨てます(図1F)。 針を曲げた歯科用プローブ(先端直径0.25〜0.6 mm)を使用して原基を広げます。3 mm未満の原基(P3から初期P4)には、マイクロプローブ(先端直径0.15〜0.2 mm)を使用します。 針先を表面に平行に配置し、外側の基底縁を広げて、テープにそっと押し付けます。 よりスムーズに巻き戻すには、針の先端を100%グリセロールに浸して、葉の内面(軸方向)を滑らかにします。 外側の縁がテープに付着した状態で、針先を葉の長軸に平行に合わせます。針をゆっくりと横にスライドさせて広げ、葉をテープの上に平らにします(図1F)。注意: 展開中に葉を壊したり損傷したりすることは、特に堅牢な中央肋骨を備えたより大きな原基で一般的です(図3E-Gを参照)。葉を激しく広げると、その表面が傷つき、イメージング中にアーティファクトが発生する可能性があります(図3H)。これらの問題に対する推奨解決策については、表 2 および説明を参照してください。 広げた原基に一滴の水をかけます。すぐに水滴と原基の上にカバーガラスを置きます。カバーガラスの端をゆっくりと押し下げて、テープに付着させます。注意: テープに接着するための余分な領域がある大きな長方形のカバースリップ(50 mm x 24 mmまたは60 mm x 24 mm)を使用することをお勧めします。葉を歪め、光の屈折が不均一になる可能性のある気泡の形成を最小限に抑えます(図3I-Kを参照)。取り付けられた原基の余白が緩く接着したカバーガラスの下でロールバックする可能性があるため、カバースリップがテープに完全に付着していることを確認してください(図3Lを参照)。 スライドを落射蛍光( 補助図S1K参照)または共焦点レーザー走査型顕微鏡のステージに置き、必要に応じて焦点と設定を調整して蛍光色素30を視覚化します。選択したトウモロコシFPレポーターラインに使用される照明および画像取得設定については、 表1 を参照してください。 葉全体または特定のROIを様々な検出チャネル30を通して画像化する。葉全体を画像化するには、葉のモザイク画像を手動でキャプチャするか、低倍率(4倍または10倍)で顕微鏡のタイリング操作を使用します。注:最小倍率でも、トウモロコシの葉の原基は大きすぎて落射蛍光または共焦点レーザー走査型顕微鏡で画像化できない可能性があり、その結果、イメージング時間が長くなり、光退色( 図3Mを参照)またはバックグラウンド自家蛍光の増加が発生する可能性があります。したがって、5 mmを超える全葉サンプルのイメージングには、蛍光実体顕微鏡を使用することをお勧めします。 共焦点イメージングでは、葉の厚さを含むzスタックを取得する必要があります(ステップ2.2.9を参照)。 すべての画像ファイルとそれに関連するメタデータ (使用可能な場合) を保存します。 表2:トウモロコシの葉の原基の横断面とマウント全体のイメージングにおける一般的な問題のトラブルシューティング。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。 図3:トウモロコシの葉の原基の最適ではない横断面と全マウントの準備。 (A-D)原基膜マーカーPIP2-1-CFP(A)と原形質膜結合性蛍光色素FM 4-64(B)による葉原基の横断切片の代表的な共焦点画像と、対応する明視野画像(C、D)。PIP2-1-CFPと比較すると、FM 4-64はセルの輪郭の最適ではない視覚化を表示します。(イーエム)裂け目(E-G)、傷ついた表面†(H)、気泡*(I-K)、ロールバックマージン(L)、およびフォトブリーチング領域‡(M)の存在を示す葉の原基のマウント全体の代表的な蛍光画像。葉原基はDII-金星(E-G)、GAR2-YFP(H-J)、mDII-金星(K)、PIN1a-YFP(L)、およびDR5-RFP(M)を表します。スケールバー = 200 μm (A-D);500 μm (E-M)図3AはRobilとMcSteen24の許可を得て修正および複製されていますが、図5B-Mは著者からの未発表データです。略語:P =プラストクロン;YFP = 黄色蛍光タンパク質;RFP = 赤色蛍光タンパク質;CFP = シアン蛍光タンパク質;PIP2-1-CFP = p Zm PIP2-1::ZmPIP2-1:CFP;DII-Venus = pZmUbi:DII:YFP-NLS;GAR2-YFP = p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP;mDII-Venus = pZmUbi:mDII:YFP-NLS;PIN1a-YFP = p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP;DR5-RFP = DR5rev::mRFPer;BF =明視野。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 4. 画像J/FIJIを使用した画像の処理 最大強度投影 (MIP) を使用した z スタックの平坦化ImageJ/FIJIを起動して画像のスタックを開くか、画像|スタック |メニューからスタックする画像。 イメージ スタックを選択します。メニューから [画像 |スタック |Zプロジェクト…。[Z プロジェクト]ダイアログ ボックスで、[投影タイプ]ドロップダウン メニューから[最大強度]を選択します。[OK]をクリックして、最大強度の Z 投影を作成します。注:平坦化された画像は、zスタック50全体で最も高い強度を持つピクセルの2D投影です。この方法は、蛍光色素の可視化には適していますが、厚い横断面や葉全体のマウントの明視野画像における解剖学的特徴の可視化には適していません。 [ファイル]を選択して、画像をTIFF(タグ付き画像ファイル形式)として保存します |名前を付けて保存 |ティフ。ファイルの名前を入力し、[ 保存] をクリックします。注:画像を保存するときに品質と詳細を保持するため、蛍光画像と共焦点画像の保存にはTIFFを使用することをお勧めします。 拡張被写界深度 (EDF) プラグイン51 を使用した z スタックの平坦化EDF プラグイン52 をインストールします。http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/ から Extended_Depth_Field.jar ファイル(バージョン17.05.2021)をダウンロードし、ImageJ/FIJIの「plugins」フォルダに配置します。 ImageJ/FIJIを起動して画像のスタックを開くか、画像|スタック |メニューからスタックする画像。 イメージ スタックを選択します。メニューから プラグイン |被写界深度の拡大 |EDFイージーモード。[ 被写界深度の拡張 ]ダイアログ ボックスで、[速度 /品質] の下のスライダを使用して目的の品質と処理速度を設定し、[ 高さマップ登録 ]を使用して地形の滑らかさのレベルを設定します。[ 実行 ] をクリックして、再構築されたイメージを作成します。注:EDFは、最適なフォーカス51を投影することにより、スタックを鮮明な合成2D画像に結合します。この手法は、限られた焦点深度を克服するのに役立ち、厚い横断面または全葉マウントの明視野画像を再構築するのに適しています。このフィルターを適用して蛍光色素を可視化する場合は、MIPとは異なり、EDFは画像のコントラストを調整し、ピクセル強度に影響を与えるため、注意してください。 画像を TIFF ファイルとして保存するには、[ ファイル] |名前を付けて保存 |ティフ。ファイルの名前を入力し、[ 保存] をクリックします。 グリッド/コレクションを使用した画像のつなぎ合わせ ステッチプラグイン53つなぎ合わせる画像または画像スタックのコレクションを1つのディレクトリに保存します。 ImageJ/FIJI を起動してプラグインを選択する |ステッチ |メニューからグリッド/コレクションステッチ。[グリッド/コレクション ステッチ] ダイアログ ボックスで、[種類] ドロップダウン メニューから [不明な位置] を選択し、[順序] から [ディレクトリ内のすべてのファイル] を選択します。OK をクリックします。 [グリッド スティッチング: 不明な位置]、[ディレクトリ内のすべてのファイル] ダイアログ ボックスで、[ディレクトリ] テキスト フィールドにディレクトリ パスを入力するか貼り付けるか、[参照…] をクリックしてディレクトリの場所を指定します。[OK] をクリックして、ステッチ プロセスを開始します。注: グリッド/コレクションステッチプラグインの不明な位置オプションは、重なり合う領域を分析することにより、連続した画像のセットから合成画像を再構築します。したがって、このオプションは、タイルスキャン操作を使用して取得されない横断面または全葉マウントの画像のモザイクをステッチする場合に便利です。 ステッチングが終了すると、ステッチされた画像を含む新しいウィンドウが表示されます。画像を TIFF ファイルとして保存するには、[ ファイル] |名前を付けて保存 |ティフ。ファイルの名前を入力し、[ 保存] をクリックします。注:2Dおよび3D画像の大きなモンタージュのステッチングは、顕微鏡ソフトウェアの画像再構成コマンドまたはImageJ/FIJIの Bio-Formatsインポートオプション を使用して行うこともできます。 「チャンネルを結合」コマンドを使用した複数のチャンネルの結合ImageJ/FIJIを起動し、マージする画像または画像スタックを開きます。注: イメージ スタックは、最初に手順 4.1 または 4.2 を使用してフラット化できます。蛍光色素チャネルの平坦化にはMIPが推奨されますが、EDFは明視野チャネルや焦点深度の異なる他のチャネルの平坦化に適しています。 画像で画像の明るさとコントラストを調整する |調整 |明るさ/コントラスト。スライダーまたは入力フィールドを使用してパラメーターを調整し、[ 適用] をクリックします。または、線形ヒストグラム ストレッチ法を使用して、[ プロセス |コントラストを高める…。 飽和ピクセルの割合を設定し、「 ノーマライズ」を選択してから、「 OK」をクリックします。注:画像間で蛍光色素のシグナル強度を定量化または比較する場合、画像の相対ピクセル強度が変化し、測定と比較に影響を与える可能性があるため、明るさやコントラストを調整しないことをお勧めします。 チャンネルを区別するには、ルックアップテーブル(LUT)を使用して特定の画像に擬似カラーを適用します。これを行うには、イメージを選択し、[ImageJ/FIJI] メニューから [ イメージ] を選択し、[ ルックアップ テーブル] をクリックして、ドロップダウン リストから適切な LUT を選択します。 メニューから [ 画像 |カラー |チャンネルをマージします。各チャンネル(C1、 C2、 C3など)で、ドロップダウンリストを使用して、そのチャンネルに割り当てる画像を選択します。[ OK ] をクリックしてチャネルを結合します。 [ ファイル] |名前を付けて保存 |ティフ。ファイルの名前を入力し、[ 保存] をクリックします。