JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicine

Рабочий процесс для количественного определения возрастных вариаций автофлуоресценции глазного дна, специфичных для поражения желтой дегенерации

Published: May 26, 2023
doi:
10.3791/65238
, , , ,
1Department of Ophthalmology,University of Bonn, 2Department of Ophthalmology and Visual Sciences,University of Alabama at Birmingham

Summary

В этом исследовании описывается рабочий процесс для определения и сравнения уровней автофлуоресценции из отдельных областей интереса (например, друз и субретинальных друзеноидных отложений при возрастной макулярной дегенерации [ВМД]) с учетом различных уровней аутофлуоресценции по всему глазному дну.

Abstract

Аутофлуоресцентная визуализация глазного дна (FAF) позволяет неинвазивно картировать собственные флуорофоры глазного дна, в частности, пигментный эпителий сетчатки (RPE), который теперь поддается количественной оценке с появлением количественной автофлуоресценции (КВАФ) на основе конфокальной сканирующей лазерной офтальмоскопии. Было показано, что при возрастной макулярной дегенерации (ВМД) КВАФ, как правило, снижается на заднем полюсе. Взаимосвязь между КВАФ и различными поражениями ВМД (друзами, субретинальными друзеноидными отложениями) до сих пор неясна.

В данной статье описывается рабочий процесс для определения специфичного для поражения КВАФ при ВМД. Используется мультимодальный подход визуализации in vivo , включая, помимо прочего, спектральную оптическую когерентную томографию (SD-OCT), сканирование макулярного объема и QAF. С помощью настраиваемых подключаемых модулей FIJI соответствующее изображение QAF выравнивается с изображением ближнего инфракрасного диапазона, полученным при сканировании SD-OCT (характерные ориентиры, т.е. бифуркации сосудов). Фовеола и край головки зрительного нерва отмечаются на ОКТ-изображениях (и переносятся на зарегистрированное изображение QAF) для точного позиционирования аналитических сеток.

Поражения, специфичные для ВМД, затем могут быть отмечены на отдельных ОКТ-БСканах или на самом изображении QAF. Нормативные карты КВАФ создаются с учетом варьирующегося среднего значения и стандартного отклонения значений КВАФ по всему глазному дну (изображения КВАФ из репрезентативной группы ВМД были усреднены для построения нормативных стандартных карт ВМД ВМД сетчатки). Подключаемые модули записывают координаты X и Y, z-оценку (числовое измерение, описывающее значение QAF по отношению к среднему значению карт автофокусировки в терминах стандартного отклонения от среднего), среднее значение интенсивности, стандартное отклонение и количество отмеченных пикселей. Инструменты также определяют z-баллы по пограничной зоне отмеченных поражений. Этот рабочий процесс и инструменты анализа улучшат понимание патофизиологии и клинической интерпретации изображений ФП при ВМД.

Introduction

Аутофлуоресцентная визуализация глазного дна (FAF) обеспечивает неинвазивное картирование естественных и патологически встречающихся флуорофоров глазного дна1. Наиболее распространенная синяя (возбуждение 488 нм) автофлуоресценция (ФП) возбуждает гранулы липофусцина и меланолипофусцина пигментного эпителия сетчатки (РПЭ)2,3,4. Распределение и увеличение/уменьшение гранул играют центральную роль в нормальном старении и различных заболеваниях сетчатки, включая возрастную макулярную дегенерацию (ВМД)5.

Дальнейшая разработка FAF, количественная аутофлуоресценция глазного дна (QAF), теперь позволяет точно определять интенсивность ФП сетчаткис топографическим разрешением 4,6. При включении эталона в оптический путь устройства обработки изображений FAF можно сравнивать интенсивность автофокусировки между устройствами, временными точками и объектами. Этот метод привел к смене парадигмы в отношении предполагаемого патогенетического фактора ВМД, который долгое время считался обусловленным чрезмерным накоплением липофусцина в клетках РПЭ7. Однако гистологическая и клиническая количественная оценка ФП выявила снижение ФП при ВМД (из-за перераспределения и потери аутофлюоресцентных гранул липофусцина и меланолипофуцина) вместо предполагаемого увеличения ФП 8,9,10.

Мониторинг мерцательной аритмии имеет клиническое значение. Von der Emde et al. и др. и др. показали, что ФП не только уменьшается, но и продолжает уменьшаться при течении ВМД в глазах с высоким риском промежуточной ВМД 8,9. Кроме того, гистологические исследования показывают, что большинство пораженных ВМД клеток RPE демонстрируют характерное поведение с агрегацией и экструзией гранул до потери клеток RPE в результате субдукции, отслаивания, миграции или атрофии13,14,15,16. Это также указывает на то, что потеря мерцательной аритмии может быть триггером или суррогатным сигналом надвигающегося прогрессирования заболевания.

До сих пор в исследованиях QAF оценивали мерцательную аритмию глобально только в системах полярных координат с использованием готовой сетки (например, QAF8/Delori Grid)17. Использование готовых сеток для измерения автофокусировки приводит к нескольким значениям автофокусировки в заранее определенных областях для каждого глаза объекта. При исследовании значений мерцательной аритмии таким образом могут быть пропущены локальные изменения в областях с патологически измененной ФП, например, при ВМД на вершине или рядом с друзами или субретинальными друзеноидными отложениями (SDD). Друзены и, в большей степени, ССД связаны с высоким риском развития поздней ВМД и потери зрения. Друзы, в частности, имеют типичный цикл увеличения в размерах в течение многих лет и могут быстро ухудшаться до атрофии. Можно предположить, что, например, глобальная ФП уменьшается при ВМД, но увеличивается или даже уменьшается в этих конкретных очаговых поражениях, связанных с заболеванием, и вокруг них.

Различные локальные паттерны мерцательной аритмии также могут иметь прогностическое значение для прогрессирования заболевания. Например, уровни автофлуоресценции могут быть использованы для оценки того, увеличиваются ли друзы в размерах или уже регрессируют к атрофии. Уже было показано, что измененные характеры перилейшни ФП при географической атрофии в значительной степени влияют на прогрессирование атрофии с течением времени18. Кроме того, локальные паттерны автофлуоресценции могут раскрыть дополнительные подробности о состоянии РПЭ. Часто оптическая когерентная томография (ОКТ) показывает гиперрефлекцию в хориокапиллярах, хотя слой RPE выглядит неповрежденным. Мультимодальный подход, сочетающий локальные значения КВАФ и ОКТ, может помочь дифференцировать поражения с высоким риском нарушения РПЭ и надвигающейся атрофии.

Одна из причин, по которой в исследованиях не выполняются анализы с пространственным разрешением, заключается в том, что наиболее часто используемое программное обеспечение производителя не предоставляет инструмента для такого рода анализа. Свойства мерцательной аритмии различных поражений в зависимости от стадии заболевания ВМД могут дополнительно объяснить патогенез ВМД. Поэтому был бы желателен инструмент для измерения регионарной, специфичной для поражения мерцательной аритмии. Для точного сравнения поражений, расположенных по всей сетчатке, рабочий процесс должен учитывать различные степени мерцательной аритмии на глазном днечеловека 19. Наиболее централизованно ФП характерно ниже из-за затемняющих эффектов макулярного пигмента и различного количества гранул20,21.

ФП достигает своего пика при ~9° (расстояние до ямки во всех направлениях) и уменьшается в большей степени периферически4. Таким образом, если сравнить абсолютные значения уровней ФП у мягких друз (расположенных в ямке и парафовеа в зонах с низкой ФП) и СДР (расположенных парацентрально в зонах с высокой ФП), результаты не будут сопоставимы22. Вдохновленная работой Pfau et al. и концепцией потери чувствительности (корректирующая чувствительность, измеряемая в ВМД для холма зрения [снижение чувствительности сетчатки с расстоянием до ямки] здоровых контрольных органов) для периметра, контролируемого глазным дном, ФП сравнивается со стандартизированными значениями ФП по всей макуле23,24. Результаты представляются в виде z-оценок (числовое измерение отношения значения интересующей области к среднему значению).

Целью данного исследования является оценка использования нового инструмента для измерения локальных уровней КВАФ при различных типах поражений у пациентов с ВМД. Этот инструмент предназначен для измерения уровня автофлуоресценции поражений, выявленных при ОКТ-сканировании. Это позволяет оценить локальные уровни аутофлуоресценции в поражениях, таких как мягкие друзы или SDD, и позволяет отслеживать изменения ФП от поражений с течением времени. Потенциальная полезность этого инструмента заключается в том, чтобы включить новый структурный биомаркер, который оценивает состояние РПЭ и может иметь прогностическую ценность для исследуемых поражений.

Protocol

Исследование проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией и одобрено Комитетом по этике Боннского университета (код протокола 305/21). Письменное информированное согласие было получено от всех субъектов, участвовавших в исследовании. Мы потребовали, чтобы все участники видео подписали формы разрешения, дающие нам разрешение на использование их образа и личной информации при создании онлайн-видео. 1. Получение изображений с помощью количественной автофлуоресценции (QAF) Для получения точного изображения с помощью устройства QAF убедитесь, что участник удобно сидит перед устройством. Попросите участника прижать подбородок и лоб к подбородку и подголовнику. Отрегулируйте высоту подбородка до тех пор, пока угол бокового века не будет на той же высоте, что и красная отметка. Убедитесь, что изображение сфокусировано в ближнем инфракрасном диапазоне, вращая колесико на записывающем устройстве до тех пор, пока малые сосуды не окажутся в фокусе. Увеличьте масштаб глаза, перемещая камеру вперед до тех пор, пока углы изображения не будут равномерно освещены. Как правило, настройте фокус на сферический эквивалент. Уменьшите фокус перед визуализацией QAF на одну или две диоптрии, так как синий QAF использует более короткую длину волны, и переключите режим устройства QAF с ближнего инфракрасного на режим QAF. Отрегулируйте и увеличьте освещение и точно настройте фокус изображения до тех пор, пока мелкие сосуды, ближайшие к ямке, не окажутся в фокусе, и изображение не будет ярко освещено без красных точек (указывающих на чрезмерную освещенность). Отбелите фотопигмент, подождав не менее 30 секунд в режиме QAF перед получением изображения, чтобы позволить продолжающемуся возбуждению синего света обесцветить пигмент фоторецептора в поле зрения настроек камеры. Для захвата изображений нажмите кнопку захвата изображения на сенсорной панели устройства обработки изображений; убедитесь, что вы сделали несколько снимков QAF на случай моргания или резких движений глаз во время съемки.ПРИМЕЧАНИЕ: Для рабочего процесса также требуются изображения оптической когерентной томографии в спектральной области (SD-OCT). Получение ОКТ-изображений описано в другом месте, поскольку оно широко используется в клинической практике25. 2. Экспорт изображений Для этого конвейера анализа убедитесь, что образы QAF и OCT имеют формат XML. В средстве просмотра HEYEX щелкните правой кнопкой мыши по нужному изображению QAF/OCT и выберите Export | as XML из выпадающего меню. 3. Плагины с открытым исходным кодом для QAF-анализа – установка конвейера ПРИМЕЧАНИЕ: Представленное программное обеспечение QAF представляет собой плагин с открытым исходным кодом под названием «Spectralis pipeline», созданный для программного обеспечения с открытым исходным кодом ImageJ (расширение FIJI)26. Чтобы получить доступ к подключаемому модулю, откройте FIJI, выберите « Справка », затем «Обновить » в раскрывающемся меню, затем нажмите « Управление сайтами обновлений», чтобы добавить «https://sites.imagej.net/CreativeComputation/» сайта обновления Creative Computation к уже существующим сайтам обновлений. Загрузите подключаемые модули, а затем перезапустите FIJI. Теперь Spectralis Pipeline установлен. Различные плагины Spectralis находятся в выпадающем меню Плагины | Spectralis или плагины | SpectralisBatch. 4. Настройка – хранение данных ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы обеспечить бесперебойный рабочий процесс, рекомендуется настроить структуру папок следующим образом. Во-первых, настройте папку для каждого изучаемого предмета. Oculus dexter (OD) и oculus sinister (OS) относятся к правому и левому глазу соответственно, и эти аббревиатуры используются в этом рабочем процессе. Для каждого исследуемого глаза каждого испытуемого создайте одну папку для ОКТ с именами OD_OCT и OS_OCT соответственно. Пусть конвейер Spectralis автоматически сохраняет выходные данные подключаемого модуля “Mark_BScans_OCT” в виде значений, разделенных табуляцией, в этих папках. Для образов QAF создайте две папки с именами OD_QAF и OS_QAF. Создайте дополнительные папки, если используются другие мультимодальные методы создания изображений. Убедитесь, что результирующая структура папок похожа на структуру, указанную ниже:CASE_IDOD_OCTOD_QAFOD_other_imaging_modalityOS_OCTOS_QAFOS_other_imaging_modality 5. Преобразование файла QAF XML в образ QAF (используемый плагин: QAF_xml_reader) Файлы экспорта Spectralis QAF XML хранятся в формате RGB (красный-зеленый-синий), ограниченный шкалой от 0 до 255 (представляющей измеренные значения автофокусировки) и включающий «стандартные» и «черные» области калибровки. Плагин “QAF_xml_reader” создает изображение QAF. Для этого откройте выпадающее меню плагинов , выберите Spectralis | QAF_XML_Reader и отбросьте начальный экран. Появится новое окно с запросом Выберите каталог, содержащий Spectralis XML QAF Export:. Выберите каталог и нажмите кнопку Выбрать. Введите референсный калибровочный коэффициент (RCF) устройства QAF (включенный в информацию об изображении QAF) и возраст пациента на момент получения изображения. Следующее окно называется QAF Parameters. Если на момент получения изображения у пациента наблюдается псевдофакия, выберите вместо него возраст 20 лет (это приводит к тому, что коррекция возраста не применяется). После нажатия кнопки «ОК», когда появится всплывающее окно с надписью «Сопоставить с 8 битами», введите минимальное значение QAF (qafMin) и максимальное значение QAF (qafMax) для изображения QAF с цветовой кодировкой. В случае, если qafMin и qafMax неизвестны, используйте настройки по умолчанию, нажмите OK и посмотрите на исходное изображение с меткой Raw QAF Data, а также на 32-битное изображение QAF и 8-битное изображение QAF с цветовой кодировкой.ПРИМЕЧАНИЕ: Изображение QAF с цветовой кодировкой используется исключительно в иллюстративных целях; для дальнейшего анализа используется 32-битный образ QAF с фактическими значениями QAF. 6. Регистрация QAF-образов с OCT-изображением (используемый плагин: Register_OCT_2) ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необходим для точного совмещения ОКТ-изображения с ОКФ-изображением, чтобы поражения на ОКФ-изображениях и ОКТ-БСканах были выровнены. Доступ к плагину осуществляется через выпадающее меню Плагины | Spectralили создайте горячую клавишу для доступа к различным используемым плагинам. Для этого выберите Register_OCT_2 в разделе Плагины | Ярлыки | Добавьте Сочетание клавиш и выберите нужную горячую клавишу. После открытия плагина нажмите OK в первом появившемся окне. Далее в главном окне ImageJ появится окно с запросом: Выберите каталог, содержащий экспорт Spectralis OCT XML:. Выберите папку, содержащую Spectralis OCT XML Export , и нажмите кнопку Открыть.ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь будет загружаться центр развертывания, что в зависимости от вычислительной мощности используемого компьютера может занять до 2 минут. Затем дождитесь появления всплывающего окна с запросом Сохранить зарегистрированные изображения в:. Выберите каталог, в котором будет храниться EnFaceStack (выровненный файл изображения) и нажмите кнопку Открыть. Дождитесь появления всплывающего окна с запросом «Выберите изображение для добавления в EnFaceStack»: чтобы появиться, выберите 32-битное изображение QAF , чтобы выровнять изображение с SD-OCT, и нажмите « Открыть». Если все необходимые изображения в этом EnFaceStack включены, выберите Отмена. Когда в следующем окне пользователю будет предложено выбрать метку для EnFaceStack, выберите готовую метку QAF ; В качестве альтернативы введите желаемое имя модальности в поле Другое. Нажмите кнопку ОК , чтобы зарегистрировать изображение.ПРИМЕЧАНИЕ: Не включайте пробелы или другие знаки препинания в поле «Другое ». Обратите внимание на три всплывающих окна. Первый называется Localizer (Локализатор ) и отображает SD-OCT в виде изображения для левого глаза (ОС ). Второе окно называется QAF или одна из других модальностей, выбранных ранее в качестве исходного левого (OS) или правого (OD) глаза. Последнее окно называется «Ориентиры», в котором предлагается выбрать от одного до трех ориентиров на каждом изображении. Выровняйте два изображения, выбрав от одного до трех ориентиров для каждого изображения, бифуркаций сосуда или других характеристик, расположенных в обеих модальностях. Увеличьте масштаб (используйте символ «+» для увеличения масштаба и «-» для уменьшения) перед выбором ориентира. Убедитесь, что выбранные ориентиры распределены на изображении как по вертикали, так и по горизонтали. После того, как все ориентиры будут аннотированы, нажмите кнопку ОК на вкладке Ориентиры и кнопку Отмена в следующем запросе. Когда появится окно с запросом Хотите ли вы просмотреть результаты , выберите Да , чтобы проверить, правильно ли выровнено изображение. Для этого увеличьте масштаб небольшого сосуда и поместите курсор рядом с ним, а затем прокрутите вверх или вниз, чтобы проверить, насколько сосуд перемещается относительно курсора. Если выравнивание не точное, удалите файл “.tiff” в каталоге OD_QAF и перезапустите процесс с начала шага 2.ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку маркировка на Mark_BScans_OCT должна быть точной, выравнивание между SD-OCT и QAF изображением также должно быть очень точным. Выравнивание с точностью до пикселя может быть достигнуто на большинстве изображений, хотя в некоторых случаях выравнивание ограничивается точностью в три или четыре пикселя. 7. Создание усредненного QAF-изображения для сравнения (используемый плагин: StandardRetina/BatchStandardRetina) ПРИМЕЧАНИЕ: Значения QAF сильно зависят от расположения сетчатки (например, центральное затенение, вызванное макулярным пигментом). Таким образом, значения QAF друз следует сравнивать со стандартными значениями QAF того же региона. В качестве предварительного условия для анализа StandardRetina создает карту усредненных изображений QAF (например, из контрольной когорты с сопоставимым возрастом). Результирующая карта грани показывает попиксельную карту среднего значения QAF для центральной сетчатки. Существует два способа создания стандартных сетчаток в конвейере Spectralis: первый, AddToStandardRetina_OCT, позволяет добавлять на карту enface по одному новому случаю за раз, а второй, BatchStandardRetina, добавляет сразу несколько наблюдений.Чтобы добавить по одному изображению за раз, выберите Плагины | Спектралис | AddToStandardRetina_OCT и закройте начальный экран. Когда появится окно с текстом Выберите каталог, содержащий экспорт Spectralis OCT XML, выберите папку и нажмите кнопку Выбрать , чтобы открыть BScan. Когда появится новое окно с запросом Выберите каталог, содержащий зарегистрированные изображения EnFace:, выберите соответствующую папку и нажмите кнопку Выбрать. Обратите внимание на три всплывающих окна, одно из которых помечено как EnFaceStack , в котором отображаются изображения Stacked из папки, выбранной на втором шаге, второе с меткой Bscan Stack , отображающее OCT BScan, и третье окно, появляющееся посередине с надписью Choose Modality. Выберите модальность из EnFaceStack. Выберите модальность и обратите внимание на новое всплывающее окно с запросом Выберите каталог, содержащий StandardRetina. Если каталог, содержащий StandardRetina, еще не существует, выберите пустую папку, чтобы создать новый StandardRetina. Изучите новый StandardRetina, прокрутите вверх и вниз и переместите курсор, чтобы просмотреть среднее значение и стандартное отклонение для этого конкретного местоположения. Нажмите на кнопку Принять? Добавить последнюю фотографию в StandardRetina или удалить ее. Чтобы добавить несколько изображений одновременно, используйте Batch_QAF_StandardRetina. Во-первых, подготовьте файл «manifest.txt» в той же папке, что и идентификаторы обращений, и убедитесь, что в нем указан относительный путь от расположения файла .txt до центра развертывания и EnFaceStack. Разделите их пробелом табуляции и убедитесь, что перед именами и после них нет дополнительных пробелов. Файл должен выглядеть примерно так:pathToOCT_1>pathToEnFaceStack_1>001/ОД-ОКТ>001/ОД-КАФpathToOCT_2>pathToEnFaceStack_2>002/ОД-ОКТ>002/ОД-КАФ Создайте файл в программе для работы с электронными таблицами и сохраните его в виде txt-файла. Убедитесь, что все пути содержат QAF для правильной работы файла манифеста. Плагины находятся в выпадающем меню Плагины | SpectralisBatch-Batch | QAF_StandardRetina. Закройте начальный экран и подождите, пока не откроется новое окно с запросом Выберите исходный стандартный Retina. Выберите папку с уже существующим StandardRetina или выберите пустую папку, чтобы создать новую папку StandardRetina. Найдите запрос с надписью Select Modality; значение по умолчанию — QAF. Убедитесь, что имя файла соответствующей модальности точно совпадает с именем файла для среза в каждом EnFaceStack, указанном в файле манифеста. Затем, когда откроется окно, предлагающее пользователю выбрать файл манифеста (описано выше), нажмите кнопку Отмена, если в этот файл StandardRetina не нужно добавлять другой файл манифеста, или выберите другой файл манифеста. Проверьте новый StandardRetina в новом окне с меткой Accept? и решите, следует ли добавить последний пакет в StandardRetina или удалить последний пакет.ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс объединения всех QAF в StandardRetina может занять некоторое время. 8. Аннотирование областей интереса для анализа (используемый плагин: Mark_BScans_OCT) Чтобы пометить поражения (например, друзы), откройте Плагины | Спектралис | Mark_BScans_OCT и отклоните приглашение на открытие. Найдите новое окно с надписью Выберите каталог, содержащий экспорт Spectralis OCT XML. Выберите папку, содержащую нужный центр развертывания, и нажмите кнопку ОК. После того, как FIJI загрузит OCT, обратите внимание на новое окно с надписью Выберите каталог, содержащий зарегистрированные изображения лиц . Выберите каталог, содержащий EnFaceStack , и нажмите кнопку Выбрать. Теперь появятся три новых окна: одно с меткой EnFaceStack, одно с надписью BscanStack и одно с именем User Parameters.В окне User Parameters пользователю предлагается ввести следующие параметры: идентификатор обращения, который затем будет отображаться в имени выходного csv-файла, пропускная способность в мм, ширина линии enface, ширина линии BScan и непрозрачность маски области.Параметр ширина полосы пропускания в мм определяет ширину каждой изооболочки в миллиметрах (мм). Используйте параметр Ширина линии Enface , чтобы изменить толщину линии отмеченных поражений в окне с меткой EnFaceStack. Толщина строки BScan определяет толщину строки в окне Bscan Stack. Обратите внимание, что установка этого параметра в 1 является наилучшей настройкой толщины линии в большинстве случаев. Выберите между маской En Face Mask или картой расстояний , отображаемой в отдельном окне, чтобы решить, следует ли раскрашивать внутренние полосы. После этого нажмите кнопку «Готово » в окне «Пометить в BScan » плагина. Затем, когда вам будет предложено выбрать уже существующий StandardRetina, выберите папку, содержащую StandardRetina, и нажмите кнопку Выбрать. Обратите внимание, что если выбран StandardRetina, выходной Mark_BScans_OCT выберет z-оценку режима (измеренного значения QAF по сравнению со StandardRetina). Если исходное значение QAF предпочтительнее, нажмите «Отмена» и дождитесь нового окна с надписью «Сообщение», которое предупреждает, что результаты будут необработанными значениями, а не z-оценками. Найдите новое окно, в котором появится запрос Выберите каталог, содержащий сохраненное состояние с сохраненными данными. Если файл сохранения существует, нажмите на каталог, содержащий слайсы | Выберите. Если ход выполнения не сохраняется, выберите Отмена. Найдите новое окно с надписью Mark in BScan и в выпадающем меню выберите « Сохранить», «Игнорировать», «Готово» и «Пометить».Метка: Начните аннотировать интересующие вас области в BScan с помощью тех же команд, что и в плагине “Register_OCT_2”, описанном выше. Чтобы пометить область, выберите «Начало», щелкнув правой кнопкой мыши и перетащив курсор мыши в конец поражения, убедитесь, что в окне «Метка в B-Sscan» выбрана метка, и нажмите кнопку «ОК». Область интереса теперь отмечена в этом BScan. Игнорировать: Выберите Ignore в окне Mark in BScan и нажмите OK, чтобы игнорировать маркировку. Спасать: Выберите « Сохранить » в окне « Пометить в BScan » и нажмите кнопку «ОК », чтобы появилось новое окно, содержащее запрос на выбор каталога для сохранения состояния. Выберите уже существующую папку или создайте новую. Откройте уже существующие файлы, начав с “Mark_BScans_OCT”, и выберите каталог, содержащий состояние сохранения, когда появится окно Выберите каталог, содержащий сохраненное состояние .ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько состояний сохранения не могут храниться в одном каталоге; сохранения состояний из одной локали в другую нельзя легко переключить (например, НЕМЕЦКИЙ на США). Договорились: Выберите « Готово» в окне « Пометить в BScan » и нажмите «ОК », чтобы появилось новое окно с меткой «Выбрать модальность ». Когда появится запрос с меткой bring the correct modality on top of enface stack , перенесите сверху модальность под названием QAF , которая была выровнена с помощью “Register_OCT_2”. Это можно сделать, прокрутив EnFaceStack, выбрав окно En face Stack или нажав на стрелку влево или вправо. Обратите внимание, что название модальности отображается в левом верхнем углу. Чтобы лучше осмотреть и обозначить поражения, увеличьте масштаб окна Bscan. Щёлкните по окну B-Scan , наведите курсор мыши в направлении увеличения масштаба и нажмите клавишу + ; Чтобы уменьшить масштаб, нажмите клавишу -. Прокручивайте стек BScan, прокручивая вверх или вниз мышь, перетаскивая полосу внизу влево или вправо, чтобы перемещаться по скану, или выбирая кадр B-скана и нажимая клавиши со стрелками влево и вправо на клавиатуре. Обратите внимание, что обзор текущей области в стеке BScan обеспечивается красной линией в окне EnFaceStack и в левом верхнем углу окна BScan, где отображается номер BScan (например, 31/120). Нажмите OK, чтобы создать новый файл .tsv в соответствующей папке «OD_OCT» или «OS_OCT». Обратите внимание, что имя файла .tsv будет состоять из “Mark_Bscans_OCT” плюс идентификатор обращения, который был введен, латеральность и модальность, которая была выбрана на последнем шаге Mark_Bscans_OCT. Кроме того, в EnFaceStack теперь будут отображаться “изо-оболочки” друз с цветовой кодировкой.

Representative Results

Просмотр выходных данныхЧтобы адекватно проанализировать и сделать выводы из результатов, важно понимать выходной файл Mark_Bscans_OCT. Первые три столбца помечены после идентификатора обращения, латеральности файла и выбранного способа создания образа. Четвертый столбец называется модой и помечен z-оценкой. Обратите внимание, что на момент написания этого текста Mark BScans может рассчитать только все поражения за один раз; Строки относятся к изо-корпусам, расстояния которых от внешнего края поражения указаны в нижнем и верхнем столбцах электронной таблицы. Изо-корпуса измеряют AF в z-показателях (в случае QAF) по заданной окружности, окружающей поражение. Обратите внимание, что минимальное значение пикселя в iso-оболочке можно найти в столбцах, помеченных min, столбцы с метками median, max, mean и stdev, соответственно, содержат медиану, максимум, среднее и стандартное отклонение среднего значения пикселов вiso-оболочке. Столбец n содержит общее количество пикселей в iso-оболочке. На рисунке 1 показана единичная выраженная мягкая друза у 84-летнего пациента мужского пола с промежуточной возрастной макулярной дегенерацией (иВМД). На рисунке 2 показан левый глаз репрезентативного пациента с SDD, отмеченными инструментом QAF-Workflow (рис. 3). ССД у этого пациента ассоциировались со снижением ФП (z-критерий = -0,4 ± 0,2). Аналогичным образом, изокорпуса вокруг SDD продемонстрировали сниженную AF (например, ближайшая изо-корпуска = -0,3 ± 0,3) по сравнению со StandardRetina. Правдоподобным объяснением этого явления может быть эффект затенения (снижение прозрачности) поражений SDD на RPE. Использование SDD было образцовым. Инструмент позволяет оценить локальные уровни мерцательной аритмии и при других поражениях, таких как друзы. Кроме того, инструмент позволяет отслеживать изменения ФП от поражений с течением времени. Рисунок 1: Единичная выраженная мягкая друза у 84-летнего пациента мужского пола с промежуточной возрастной макулярной дегенерацией (ВМД). (А) Изображение левого глаза с отмеченной друзой. (B) Крупный план друз: коричневый центр, представляющий отмеченных друз, и цветные полосы, представляющие окружающие изо-оболочки. В таблице ниже показан выходной файл. Значения друз QAF сравниваются с соответствующими значениями QAF соответствующего эксцентриситета из StandardRetina. Это приводит к z-показателям, которые представляют собой отклонение от среднего значения для незатронутых областей. Синяя рамка показывает слева направо: идентификатор случая, латеральность глаза, используемую модальность и желаемый результат (в данном случае z-оценки). Столбцы внутри оранжевого прямоугольника показывают границы измеряемой области в миллиметрах (нижняя = нижняя граница, верхняя = верхняя граница). Зеленым прямоугольником обозначены столбцы, показывающие измерения QAF. Слева направо они содержат минимум, медиану, максимум, количество пикселей, среднее значение и стандартное отклонение среднего значения. Каждая строка представляет изооболочку, строки в синем прямоугольнике представляют значения в пределах поражения, а строки в фиолетовом прямоугольнике показывают изооболочки, окружающие каждое повреждение (сверху вниз с увеличением расстояния до поражения). Масштабная линейка = 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 2: Помеченные SDD на QAF-изображении 80-летней пациентки с ранней стадией ВМД. (A) На изображении QAF можно увидеть SDD. То же самое изображение QAF показано с отпечатанными аннотациями SDD. (B) Вокруг каждого отмеченного поражения изооболочки изображены с цветовой кодировкой (светло-зеленый, темно-зеленый и красный). (C) Увеличенная версия синего прямоугольника. Внешний край каждого SDD отмечен синим цветом. Сокращения: QAF = количественная автофлуоресценция; ВМД = возрастная макулярная дегенерация; SDD = субретинальное друзеноидное отложение. Масштабная линейка = 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 3: Рабочий процесс для определения мерцательной аритмии поражений. На этом рисунке визуализированы программные плагины, необходимые для определения мерцательной аритмии, специфичной для поражения. (A) На рисунке показано изображение QAF с цветовой кодировкой, которое можно использовать для визуализации распределения значений QAF, но не следует использовать для дальнейшего анализа. (B) На переднем плане показано изображение QAF, а на заднем плане — инфракрасное изображение SD-OCT-сканирования. Предполагается, что это позволит визуализировать выравнивание с помощью бифуркаций сосудов. Это можно сделать с помощью плагина Register_OCT_2. (C) Стандартная сетчатка, которая используется для измерения значений z-оценки поражений. StandardRetinas можно создать с помощью StandardRetina/BatchStandardRetina. (D) На рисунке изображен BScan с синими стрелками, указывающими на SDD, которые выделены желтыми линиями (примечание: поражения всегда отмечаются под RPE независимо от расположения в направлении z). (E) Все отмеченные поражения отпечатываются на изображении QAF (см. рисунок 1). Последние два шага выполняются с помощью плагина Mark_BScans_OCT. Сокращения: AF = автофлуоресценция; QAF = количественная автофлуоресценция; SDD = субретинальное друзеноидное отложение; ИК = инфракрасный; RPE = пигментный эпителий сетчатки; SD-OCT = оптическая когерентная томография в спектральной области. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Discussion

Этот рабочий процесс представляет собой пошаговое руководство по использованию подключаемых инструментов FIJI с открытым исходным кодом для определения и сравнения ФП поражений, специфичных для ВМД. Подключаемые модули предоставляют простые в использовании шаблоны, которые не требуют каких-либо знаний в области программирования и могут применяться врачами без технической поддержки27. Насколько нам известно, эти инструменты являются единственными в своем роде для количественной оценки мерцательной аритмии, специфичной для поражения.

Значения QAF естественным образом варьируются в зависимости от сетчатки, при этом значения выше на периферии и ниже в макуле из-за неравномерного распределения липофусцина и меланолипофуцина в сетчатке, низкого уровня мерцательной аритмии сосудов и неравномерного распределения макулярного пигмента. Из-за высокой вариабельности естественных уровней QAF в сетчатке, анализ абсолютных значений QAF поражений напрямую не является перспективным подходом. Например, гипоавтофлуоресцентное поражение на периферии может иметь более высокие абсолютные значения QAF, чем физиологические уровни флуоресценции макулы. Использование StandardRetina и z-баллов для измерения уровней флуоресценции друз корректирует эту естественную дисперсию значений QAF.

Z-оценка — это числовое измерение отношения значения интересующей области к среднему значению в StandardRetina. Он вычисляется путем вычитания среднего значения от индивидуума из среднего значения из StandardRetina в том же месте, а затем деления результата на стандартное отклонение. Такая стандартизация позволяет сравнивать различные изображения QAF, так как z-оценка показывает, на сколько стандартных отклонений значение отличается от среднего. Положительная z-оценка указывает на то, что значение выше среднего, а отрицательная z-оценка указывает на то, что оно ниже среднего.

Важно отметить, что могут быть потенциальные подводные камни, которые следует учитывать. Несмотря на то, что этот метод учитывает различное количество уровней мерцательной аритмии на глазном дне, он все же может быть не самым точным способом измерения и сравнения мерцательной аритмии РПЭ. Люди имеют разный уровень и топографию желто-лютеинового пигмента, и поражения также могут влиять на прозрачность вышележащей сетчатки28,29. Таким образом, вполне вероятно, что измеренное снижение ФП в областях СДД (см. репрезентативные результаты) является следствием эффектов затенения, а не уменьшения флуорофоров в РПЭ30,31,32.

В настоящее время мы работаем над рабочим процессом для учета отражательной способности, толщины и количественного определения макулярного пигмента сетчатки (с использованием зеленой и синей автофокусировки) с помощью линейных смешанных моделей. Кроме того, до сих пор QAF использует возрастной поправочный коэффициент для учета линзовидного помутнения, который игнорирует межиндивидуальные различия в линзовидном помутнении участников аналогичного возраста33 года. Поэтому в настоящее время мы работаем над рабочим процессом для персонализированного корректирующего коэффициента лентикулярной автофлуоресценции и помутнения. Для достоверного извлечения информации о мерцательной аритмии из небольших очагов поражения необходима адекватная тестово-ретестовая надежность изображений КВАФ. Для дальнейшей дифференциации тех изображений QAF, для которых необходим более детальный анализ, мы исследуем «индексы надежности изображений QAF», которые могут предсказать надежность изображений QAF при повторном тестировании. На данном этапе разумным подходом является получение дубликатов изображений и повторное исследование надежности поражений, специфичной для поражения.

Представленный метод дополнительного анализа изо-корпусов поражений был технически сложен в реализации, так как изооболочки соседних поражений сливаются. Участки слившихся изокорпусов могут быть охарактеризованы по-разному в зависимости от того, какое поражение рассматривается. Наше решение состояло в том, чтобы рассматривать все поражения одного типа как одно поражение и анализировать их периферию как суставную изооболочку. Этот метод, однако, резко снижает возможность измерения изокорпусов отдельных друз и может рассматриваться как еще один подводный камень этого метода. Более технически сложные методы учета слияния изокорпусов или подвешенных сообщений о ФП в областях объединенных изокорпусов могут облегчить анализ ФП по окружности поражений в будущем.

Мы использовали ВМД в качестве модельного заболевания для этого исследования. Рабочий процесс может быть адаптирован для изучения поражений и при других заболеваниях. До настоящего времени КВАФ применялся при многих хориоретинальных заболеваниях, включая рецессивную болезнь Штаргардта, заболевания, ассоциированные с бестрофином-1, различные формы пигментного ретинита, острую зональную скрытую наружную ретинопатию, псевдоксантому эластичную и другие 17,33,34,35,36,37. Поскольку в этом рабочем процессе используется программное обеспечение с открытым исходным кодом, мы призываем других повторить эту работу при определении мерцательной аритмии, специфичной для поражения, и расширить наши знания о заболеваниях сетчатки. Таким образом, мы представляем рабочий процесс для определения и сравнения уровней мерцательной аритмии различных поражений сетчатки по всей макуле. Этот рабочий процесс прокладывает путь к более глубокому анализу мерцательной аритмии и может способствовать разработке новых биомаркеров при ВМД и не только.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была профинансирована грантом Немецкого офтальмологического общества (DOG) для докторантов (MW) и NIH/NEI 1R01EY027948 (TA).

Materials

BatchStandardRetina plugin n.a. n.a. n.a.
FIJI (Image J) n.a. n.a. n.a.
Mark_Bscans_OCT plugin n.a. n.a. n.a.
Microspft office Microsoft n.a. n.a.
QAF_xml_reader plugin n.a. n.a. n.a.
Register_OCT_2 plugin n.a. n.a. n.a.
Spectralis Heidelberg Engineering n.a. QAF extension
StandardRetina plugin n.a. n.a. n.a.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schmitz-Valckenberg, S., et al. Fundus autofluorescence imaging. Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100893 (2021).
  2. Bermond, K., et al. Autofluorescent granules of the human retinal pigment epithelium: phenotypes, intracellular distribution, and age-related topography. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 61 (5), 35 (2020).
  3. Bermond, K., et al. Autofluorescent organelles within the retinal pigment epithelium in human donor eyes with and without age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 63 (1), 23 (2022).
  4. Delori, F., et al. Quantitative measurements of autofluorescence with the scanning laser ophthalmoscope. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (13), 9379-9390 (2011).
  5. Fleckenstein, M., et al. Age-related macular degeneration. Nature Reviews Disease Primers. 7 (1), 31 (2021).
  6. Greenberg, J. P., et al. Quantitative fundus autofluorescence in healthy eyes. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 54 (8), 5684-5693 (2013).
  7. Sparrow, J. R., Boulton, M. RPE lipofuscin and its role in retinal pathobiology. Experimental Eye Research. 80 (5), 595-606 (2005).
  8. vonder Emde, L., et al. Natural history of quantitative autofluorescence in intermediate age-related macular degeneration. Retina. 41 (4), 694-700 (2021).
  9. Reiter, G. S., et al. Longitudinal changes in quantitative autofluorescence during progression from intermediate to late age-related macular degeneration. Retina. 41 (6), 1236-1241 (2021).
  10. Gliem, M., et al. Quantitative fundus autofluorescence in early and intermediate age-related macular degeneration. JAMA Ophthalmology. 134 (7), 817-824 (2016).
  11. Hussain, R. M., Gregori, N. Z., Ciulla, T. A., Lam, B. L. Pharmacotherapy of retinal disease with visual cycle modulators. Expert Opinion on Pharmacotherapy. 19 (5), 471-481 (2018).
  12. Ammar, M. J., Hsu, J., Chiang, A., Ho, A. C., Regillo, C. D. Age-related macular degeneration therapy: a review. Current Opinion in Ophthalmology. 31 (3), 215-221 (2020).
  13. Ach, T., et al. Lipofuscin redistribution and loss accompanied by cytoskeletal stress in retinal pigment epithelium of eyes with age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (5), 3242-3252 (2015).
  14. Zanzottera, E. C., Messinger, J. D., Ach, T., Smith, R. T., Curcio, C. A. Subducted and melanotic cells in advanced age-related macular degeneration are derived from retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (5), 3269-3278 (2015).
  15. Cao, D., et al. Hyperreflective foci, optical coherence tomography progression indicators in age-related macular degeneration, include transdifferentiated retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 62 (10), 34 (2021).
  16. Zanzottera, E. C., et al. The Project MACULA retinal pigment epithelium grading system for histology and optical coherence tomography in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (5), 3253-3268 (2015).
  17. Sparrow, J. R., Duncker, T., Schuerch, K., Paavo, M., de Carvalho, d. R. L. Lessons learned from quantitative fundus autofluorescence. Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100774 (2020).
  18. Schmitz-Valckenberg, S., et al. Correlation between the area of increased autofluorescence surrounding geographic atrophy and disease progression in patients with AMD. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (6), 2648-2654 (2006).
  19. Ach, T., Bermond, K. Autofluorescence of the human retinal pigment epithelium in normal aging and in age-related macular degeneration: histology and clinical correlation. Klinische Monatsblatter Fur Augenheilkunde. 236 (5), 672-681 (2017).
  20. Pollreisz, A., et al. Visualizing melanosomes, lipofuscin, and melanolipofuscin in human retinal pigment epithelium using serial block face scanning electron microscopy. Experimental Eye Research. 166, 131-139 (2018).
  21. Bernstein, P. S., et al. meso-zeaxanthin: The basic and clinical science underlying carotenoid-based nutritional interventions against ocular disease. Progress in Retinal and Eye Research. 50, 34-66 (2016).
  22. Göbel, A. P., Fleckenstein, M., Heeren, T. F. C., Holz, F. G., Schmitz-Valckenberg, S. In-vivo mapping of drusen by fundus autofluorescence and spectral-domain optical coherence tomography imaging. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 254 (1), 59-67 (2016).
  23. Pfau, M., et al. Mesopic and dark-adapted two-color fundus-controlled perimetry in geographic atrophy secondary to age-related macular degeneration. Retina. 40 (1), 169-180 (2020).
  24. vonder Emde, L., et al. Mesopic and dark-adapted two-color fundus-controlled perimetry in choroidal neovascularization secondary to age-related macular degeneration. Translational Vision Science and Technology. 8 (1), 7 (2018).
  25. Aumann, S., Donner, S., Fischer, J., Müller, F. Optical coherence tomography (OCT): principle and technical realization. High Resolution Imaging in Microscopy and Ophthalmology: New Frontiers in Biomedical Optics. , 59-85 (2019).
  26. Schindelin, J., et al. FIJI: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  27. Kleefeldt, N., et al. Quantitative fundus autofluorescence: advanced analysis tools. Translational Vision Science and Technology. 9 (8), 2 (2020).
  28. Hong, I. H., Jung, W. H., Lee, J. H., Chang, I. B. Macular pigment optical density in the Korean population: a cross sectional study. Journal of Korean Medical Science. 35 (5), e30 (2020).
  29. Putnam, C. M. Clinical imaging of macular pigment optical density and spatial distribution. Clinical and Experimental Optometry. 100 (4), 333-340 (2017).
  30. Zweifel, S. A., Spaide, R. F., Curcio, C. A., Malek, G., Imamura, Y. Reticular pseudodrusen are subretinal drusenoid deposits. Ophthalmology. 117 (2), 303-312 (2010).
  31. Curcio, C. A., et al. Subretinal drusenoid deposits in non-neovascular age-related macular degeneration: morphology, prevalence, topography, and biogenesis model. Retina. 33 (2), 265-276 (2013).
  32. Spaide, R. F. Outer retinal atrophy after regression of subretinal drusenoid deposits as a newly recognized form of late age-related macular degeneration. Retina. 33 (9), 1800-1808 (2013).
  33. Reiter, G. S. Influence of lens opacities and cataract severity on quantitative fundus autofluorescence as a secondary outcome of a randomized clinical trial. Scientific Reports. 11 (1), 12685 (2021).
  34. Gliem, M., et al. Quantitative fundus autofluorescence in pseudoxanthoma elasticum. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (14), 6159-6165 (2017).
  35. Burke, T. R., et al. Quantitative fundus autofluorescence in recessive Stargardt disease. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 55 (5), 2841-2852 (2014).
  36. Armenti, S. T., Greenberg, J. P., Smith, R. T. Quantitative fundus autofluorescence for the evaluation of retinal diseases. Journal of Visualized Experiments. (109), 53577 (2016).
  37. Pröbster, C., et al. Quantitative fundus autofluorescence in the developing and maturing healthy eye. Translational Vision Science and Technology. 10 (2), 15 (2021).
  38. Duncker, T., et al. Quantitative fundus autofluorescence and optical coherence tomography in PRPH2/RDS- and ABCA4-associated disease exhibiting phenotypic overlap. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (5), 3159-3170 (2015).

Tags

Age-related Macular DegenerationFundus AutofluorescenceQuantitative AutofluorescenceRetinal Pigment EpitheliumDrusenSubretinal Drusenoid DepositsOptical Coherence TomographyMultimodal ImagingFIJI Plug-insRegional VariationsPhotoreceptor DensitySpectral AnalysisFluorophores

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
von der Emde, L., Mallwitz, M., Holz, F. G., Sloan, K. R., Ach, T. A Workflow to Quantitatively Determine Age-Related Macular Degeneration Lesion-Specific Variations in Fundus Autofluorescence. J. Vis. Exp. (195), e65238, doi:10.3791/65238 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image