加齢黄斑変性症病変性症の眼底自家蛍光における特異的変動を定量的に決定するワークフロー

この研究は、ヘルシンキ宣言に従って実施され、ボン大学の倫理委員会(プロトコルコード305/21)によって承認されました。書面によるインフォームドコンセントは、研究に関与したすべての被験者から得られました。動画の参加者全員に、オンライン動画の作成に肖像や個人情報を使用する許可を与える同意書に署名するよう求めました。 1. 定量的自家蛍光(QAF)画像取得 QAFデバイスで正確な画像を取得するには、参加者がデバイスの前に快適に座っていることを確認してください。参加者に顎と額を顎とヘッドレストに押し付けてもらいます。外側のまぶたの角度が赤いマーキングと同じ高さになるまで、あご当ての高さを調整します。 小さな血管に焦点が合うまで記録デバイスのホイールを回転させて、画像が近赤外線モードに焦点を合わせていることを確認します。画像の角が均等に照らされるまでカメラを前方に動かして、目を拡大します。経験則として、フォーカスを球面に相当するものに調整します。青色QAFは波長が短いため、QAF撮像前のピントを1〜2ジオプター下げ、QAFデバイスのモードを近赤外モードからQAFモードに切り替えます。 照明を再調整してアップスケールし、中心窩に最も近い小さな血管に焦点が合い、画像が赤い点なしで明るく照らされるまで、画像の焦点を微調整します(過照明を示します)。画像取得前にQAFモードで少なくとも30秒待ってフォトピグメントを漂白し、継続的な青色光励起がカメラ設定の視野内の感光体色素を漂白できるようにします。 画像をキャプチャするには、イメージングデバイスのタッチパッドで 画像取得 を押します。撮影中にまばたきや急な眼球運動が発生した場合に備えて、必ず複数のQAF画像を撮影してください。注:このワークフローには、スペクトル領域光干渉断層撮影(SD-OCT)画像も必要です。OCT画像取得は、臨床現場で広く使用されているため、別の場所で説明されています25。 2.画像のエクスポート この分析パイプラインでは、QAF イメージと OCT イメージが Extensible Markup Language (XML) ファイル形式であることを確認します。 HEYEXビューアで、目的のQAF/OCT画像を右クリックし、ドロップダウンメニューから Export | as XML を選択します。 3. QAF分析用のオープンソースプラグイン – パイプラインのインストール 注:提示されたQAFソフトウェアは、オープンソースソフトウェアImageJ(FIJI拡張)26用に作成された「Spectralis pipeline」という名前のオープンソースプラグインです。 プラグインにアクセスするには、FIJIを開き、ドロップダウンメニューから「ヘルプ」→「アップデート」を選択し、「アップデートサイトの管理」をクリックして、既存のアップデートサイトにCreative Computation Update Site「https://sites.imagej.net/CreativeComputation/」を追加します。 プラグインをダウンロードし、FIJIを再起動します。これで、Spectralis Pipelineがインストールされました。さまざまな Spectralis プラグインは、ドロップダウンメニューの Plugins |Spectralis または プラグイン |SpectralisBatchです。 4. セットアップ – データストレージ 注: シームレスなワークフローを可能にするには、 次のようにフォルダ構造を設定する ことをお勧めします。まず、研究対象ごとにフォルダを設定します。Oculus dexter(OD)と oculus sinister(OS)は、それぞれ右目と左目を指し、これらの略語はこのワークフロー全体で使用されます。 各被験者の検査眼ごとに、OCT 用に 1 つのフォルダーを 1 つ設定し、それぞれ OD_OCT と OS_OCT という名前を付けます。Spectralis パイプラインは、「Mark_BScans_OCT」プラグインからの出力をタブ区切りの値としてこれらのフォルダーに自動的に保存します。 QAF イメージの場合は、 OD_QAF と OS_QAF という名前の 2 つのフォルダーを作成します。 他のマルチモーダルイメージングモダリティを使用する場合は、追加のフォルダーを作成します。結果のフォルダー構造が、次の構造になっていることを確認します。CASE_IDOD_OCTOD_QAFOD_other_imaging_modalityOS_OCTOS_QAFOS_other_imaging_modality 5. QAF XMLファイルのQAF画像化(使用プラグイン:QAF_xml_reader) Spectralis QAF XML Exportファイルは、赤-緑-青(RGB)形式で保存され、0〜255(測定されたAF値を表す)のスケールに制限され、「標準」および「黒」のキャリブレーション領域が含まれます。「QAF_xml_reader」プラグインはQAF画像を生成します。このためには、 プラグイン のドロップダウンメニューを開き、 Spectralis |QAF_XML_Readerし、開始画面を破棄します。 新しいウィンドウが開き、「 Choose a directory containing a Spectralis XML QAF Export:」 というプロンプトが表示されます。 ディレクトリ を選択し、「 選択」をクリックします。 QAF装置の基準校正係数(RCF)(QAF画像の画像情報に含まれる)と、画像撮影時の 患者の年齢 を入力します。 次のウィンドウは「QAF パラメーター (QAF Parameters)」と呼ばれます。画像取得時に患者が 偽水晶体 の場合は、代わりに 20歳 を選択します(これには年齢補正を適用しない効果があります)。 OKをクリックすると、 8ビットにマップ というラベルのポップアップが表示されたら、色分けされたQAF画像の最小QAF(qafMin)値と最大QAF(qafMax)値を入力します。qafMin と qafMax が不明な場合は、デフォルト設定を使用して「 OK」をクリックし、表示される [Raw QAF Data] というラベルの付いた元の画像と、32 ビットの QAF と 8 ビットの色分けされた QAF 画像を確認します。注:色分けされたQAF画像は、説明のみを目的として使用されています。実際のQAF値を含む32ビットQAF画像は、さらなる分析に利用されます。 6. OCT画像にQAF画像を登録する(使用プラグイン:Register_OCT_2) 注:このステップは、OCT画像とQAF画像を正確に位置合わせし、QAF画像とOCT BScanの病変を位置合わせするために必要です。 ドロップダウンメニューからプラグインにアクセスし ます プラグイン |Spectralis、または使用するさまざまなプラグインにアクセスするためのホットキーを作成します。これを実現するには Register_OCT_2 、[ プラグイン] |ショートカット |ショートカットを追加 目的の ホットキーを選択します。 プラグインを開いた後、最初に表示されるウィンドウで[ OK ]をクリックします。次に、「 Choose a directory containing the Spectralis OCT XML export:」 というプロンプトを含むウィンドウが ImageJ のメインウィンドウに表示されます。 Spectralis OCT XML Export を含むフォルダを選択し、[ 開く]をクリックします。注 : OCT が読み込まれますが、使用しているコンピュータの処理能力によっては、最大で 2 分かかる場合があります。 次に、「 登録した画像の保存先: 」というプロンプトを含むウィンドウがポップアップするのを待ちます。 EnFaceStack (アライメントされた画像ファイル)を保存するディレクトリを選択し、[ 開く]をクリックします。 「EnFaceStackに追加する画像を選択してください:」というプロンプトを含むポップアップウィンドウが表示されるのを待ち、32ビットQAF画像を選択して画像をSD-OCTに合わせ、「開く」をクリックします。この EnFaceStack に必要な画像がすべて含まれている場合は、[キャンセル]を選択します。 次のウィンドウで、 EnFaceStackのラベルを選択するようにユーザーに求められたら、事前に作成された QAF ラベルを選択します。または、「その他」(Other) ボックスにモダリティの名前を入力します。[ OK ] を選択してイメージを登録します。注: [ その他 ] フィールドには、スペースやその他の句読点を含めないでください。 ポップアップする 3 つのウィンドウを観察します。1つ目は Localizer というラベルが付いており、SD-OCTを 左目(OS) 画像として表示します。2 番目のウィンドウには、QAF または元の左目 (OS) または右目 (OD) として以前に選択した他のモダリティの 1 つという名前が付けられます。最後のウィンドウは [ランドマーク] と呼ばれ、各画像で 1 つから 3 つのランドマーク を選択するように求められます。 画像ごとに1〜3つのランドマークを選択して、2つの画像を位置合わせします-血管分岐または両方のモダリティにあるその他の特性。ランドマークを選択する前に、ズームインします(ズームインするには「+」キーボード文字を使用し、ズームアウトするには「-」を使用します)。選択したランドマークが画像内で垂直方向と水平方向の両方に広がっていることを確認します。すべてのランドマークに注釈を付けたら、[ランドマーク] タブで [OK] を選択し、次のプロンプトで [キャンセル] を選択します。 「結果を表示しますか」というウィンドウが表示されたら、[はい]を選択して、画像が正しく整列されているかどうかを確認します。これを行うには、小さな船を拡大してカーソルを横に置き、上下にスクロールして、カーソルに対して船がどれだけ動くかを確認します。アライメントが正確でない場合は、OD_QAFディレクトリの「.tiff」ファイルを削除し、手順2の最初からプロセスを再開します。注:Mark_BScans_OCTのマーキングは正確でなければならないため、SD-OCTとQAF画像の間のアライメントも非常に正確でなければなりません。ピクセルパーフェクトなアライメントは、ほとんどの画像で実現できますが、アライメントが3〜4ピクセルの精度に制限される場合もあります。 7. 比較用の平均QAF画像作成(使用プラグイン:StandardRetina/BatchStandardRetina) 注:QAF値は網膜の位置に強く依存します(例:黄斑色素によって引き起こされる中心シャドーイング)。したがって、ドルーゼンのQAF値は、同じ領域の標準QAF値と比較する必要があります。解析の前提条件として、 StandardRetina は平均化されたQAF画像(例えば、年齢を合わせた対照コホートから)のenfaceマップを作成します。結果のenfaceマップは、中心網膜の平均QAF値のピクセルごとのマップを示しています。 Spectralis パイプライン内で標準網膜を作成する方法は 2 つあり、1 つ目の AddToStandardRetina_OCT では一度に 1 つの新しい症例を enface マップに追加でき、2 つ目の BatchStandardRetina では複数の症例を一度に追加できます。一度に 1 つの画像を追加するには、[ プラグイン] |スペクトル | AddToStandardRetina_OCT をクリックし、開始画面を閉じます。ウィンドウがポップアップし、「 Choose a directory containing a Spectralis OCT XML export」というテキストが表示されたら、 フォルダ を選択し、「 選択 」をクリックしてBScanを開きます。 新しいウィンドウが表示され、「 Choose a directory containing registered EnFace images:」というプロンプトが表示されたら、 適切なフォルダ を選択して 「選択」をクリックします。 ポップアップする3つのウィンドウ、1つは2番目のステップで選択したフォルダのスタック画像を表示する EnFaceStack 、OCT BScanを表示する Bscan スタックというラベルの付いた2番目のウィンドウ、そして中央に表示される3番目のウィンドウはモ ダリティの選択です。 EnFaceStackからモダリティを選択します。 モダリティを選択し、プロンプト「Choose a directory containing the StandardRetina」でポップアップする新しいウィンドウを確認します。StandardRetina を含むディレクトリがまだ存在しない場合は、空のフォルダを選択して新しい StandardRetina を作成します。 新しい StandardRetina を調べ、上下にスクロールし、カーソルを移動して、その特定の場所の平均と標準偏差を表示します。ボタンをクリックします 同意しますか?StandardRetinaに最新の写真を追加するか、破棄します。 一度に複数の画像を追加するには、 Batch_QAF_StandardRetinaを使用します。 まず、ケース ID と同じフォルダーに “manifest.txt” ファイルを用意し、.txt ファイルの場所から OCT および EnFaceStack への相対パスがリストされていることを確認します。この 2 つをタブ スペースで区切り、名前の前後に余分な空白がないことを確認します。ファイルは次の設定のようになります。pathToOCT_1>pathToEnFaceStack_1>001/OD-OCT>001/OD-QAFpathToOCT_2>pathToEnFaceStack_2>002/OD-OCT>002/OD-QAF 表計算ソフトでファイルを作成し、 txtファイルとして保存します。マニフェストファイルが正しく機能するために、すべてのパスにスライス (文字) QAF が含まれていることを確認します。プラグインは、ドロップダウンメニューの [プラグイン] |SpectralisBatch-バッチ | QAF_StandardRetina。 開始画面を閉じ、新しいウィンドウが開くのを待ち、プロンプトが表示されます 最初の標準 Retina を選択します。既存の StandardRetina を含むフォルダーを選択するか、空のフォルダーを選択して新しい StandardRetina を作成します。 「モダリティの選択」というラベルの付いたプロンプトが表示されます。デフォルトは QAF です。それぞれのモダリティのファイル名が、マニフェストファイルで指定されているすべてのEnFaceStackのスライスのファイル名と完全に一致していることを確認します。次に、マニフェスト ファイルの選択を求めるウィンドウが開いたら (前述)、この StandardRetina に他のマニフェスト ファイルを追加しない場合は [キャンセル] をクリックするか、別のマニフェスト ファイルを選択します。[Accept?] というラベルの付いた新しいウィンドウで新しい StandardRetina を確認し、最新のバッチを StandardRetina に追加するか、最新のバッチを破棄するかを決定します。注:すべてのQAFを StandardRetina に結合するプロセスには、しばらく時間がかかる場合があります。 8. 分析のために関心領域に注釈を付ける(使用プラグイン:Mark_BScans_OCT) 病変(ドルーゼンなど)をマークするには、 プラグイン |スペクトル |Mark_BScans_OCT して、開始プロンプトを閉じます。[ Choose a directory containing a Spectralis OCT XML export ] というラベルの付いた新しいウィンドウを探します。目的のOCTがあるフォルダを選択し、「 OK」をクリックします。 フィジーがOCTをロードした後、ラベルが付いた新しいウィンドウを観察します 登録 済みの顔画像を含むディレクトリ を選択してください が表示されます。 EnFaceStack を含むディレクトリを選択し、[ 選択]をクリックします。 3 つの新しいウィンドウが表示され、1 つは EnFaceStack、1 つは BscanStack、もう 1 つは User Parameters という名前です。[User Parameters] ウィンドウでは、出力 csv ファイルの名前に表示されるケース ID、mm 単位の帯域幅、enface 線幅、BScan 線幅、および領域マスクの不透明度のいずれかのパラメーターを入力するように求められます。パラメータ帯域幅(mm)は、各等角ハルの幅をミリメートル (mm) 単位で決定します。 Enfaceの線幅 を使用して、 EnFaceStackというラベルの付いたウィンドウ上のマークされた病変の線幅を変更します。 BScan の線幅は、ウィンドウの Bscan スタックの線幅を決定します。このパラメータを 1 に設定することが、ほとんどの場合に最適な線幅設定であることに注意してください。 別のウィンドウに表示される En Face Mask または Distance Map のいずれかを選択して、バンドの内側に色を付けるかどうかを決定します。その後、プラグインの[BScanでマーク]ウィンドウで[完了]をクリックします。 次に、既存の StandardRetina を選択するように求められたら、StandardRetina を含むフォルダーを選択して [選択] をクリックします。 StandardRetinaが選択されている場合、出力Mark_BScans_OCTはモードZスコア(StandardRetinaと比較した測定されたQAF値)を選択することに注意してください。生のQAF値が望ましい場合は、[キャンセル]をクリックし、結果がzスコアではなく生の値になることを警告するメッセージというラベルの付いた新しいウィンドウを待ちます。 新しいウィンドウを探して、保存されたデータを含む 保存された状態を含むディレクトリを選択する ように促します。保存ファイルが存在する場合は、 スライスを含むディレクトリをクリックします |[選択] をクリックします。進行状況を保存しない場合は、[ キャンセル] を選択します。[ Mark in BScan] というラベルの付いた新しいウィンドウを探し、ドロップダウン メニューから [save]、[ ignore]、[done]、[ mark] を選択します。印：BScanの関心領域に、上記で説明した「Register_OCT_2」プラグインと同様のコマンドを使用して注釈を付け始めます。領域をマークするには、右クリックしてマウスカーソルを病変の最後までドラッグして開始を選択し、B-スキャンでマークウィンドウがマークが選択されていることを確認して、OKをクリックします。関心領域は、このBScanでマークされています。 不問に付す：[Mark in BScan]ウィンドウで[Ignore]を選択し、[OK]をクリックしてマーキングを無視します。 セーブ：[Mark in BScan]ウィンドウで[保存]を選択し、[OK]をクリックして新しいウィンドウを表示し、状態を保存するディレクトリを選択するプロンプトを表示します。既存のフォルダを選択するか、新しいフォルダを作成します。「Mark_BScans_OCT」を起動して既存のファイルを開き、保存状態を含むディレクトリを選択するウィンドウが表示されたら、保存状態を含むディレクトリを選択します。注: 複数の保存状態を 1 つのディレクトリに保存することはできません。あるロケールから別のロケールへの保存状態は簡単に切り替えられません(例:GERMANからUSA)。 完成です：[BScanでマーク]ウィンドウで[完了]を選択し、[OK]をクリックして、選択モダリティというラベルの付いた新しいウィンドウを表示します。 「bring the correct modality on top of the enface stack」というラベルのプロンプトが表示されたら、「Register_OCT_2」を使用してアライメントされたQAFというモダリティを先頭に持ってきます。これを行うには、EnFaceStackをスクロールするか、[En face Stack]ウィンドウを選択するか、左矢印または右矢印をクリックします。モダリティの名前が左上隅に表示されることに注意してください。 病変をより適切に検査してマーキングするには、Bscanウィンドウを拡大します。 B-スキャン ウィンドウをクリックし、ズームインする方向にマウスを向けて、 + キーを押します。ズームアウトするには、- キーを押します。 BScanスタックをスクロールするには、マウスを上下にスクロールするか、下部のバーを左または右にドラッグしてスキャン内を移動するか、B-スキャンフレームを選択してキーボードの左右の矢印キーをクリックします。BScanスタックの現在の領域の概要は、EnFaceStackウィンドウの赤い線と、BScan番号(31/120など)が表示されるBScanウィンドウの左上に表示されます。 [ OK ]をクリックして、対応する「OD_OCT」または「OS_OCT」フォルダに新しい.tsvファイルを作成します。.tsv ファイル名は、「Mark_Bscans_OCT」と、入力されたケース ID、横方向、およびMark_Bscans_OCTの最後のステップで選択したモダリティで構成されます。 さらに、ドルーゼンの色分けされた「iso-hulls」が EnFaceStackに表示されるようになりました。