Quantificazione basata su immagini ad alto rendimento della sintesi e della distribuzione del DNA mitocondriale

Per la maggior parte delle cellule eucariotiche i mitocondri sono organelli essenziali, in quanto svolgono un ruolo cruciale in numerosi processi cellulari. Innanzitutto, i mitocondri sono i principali fornitori di energia delle cellule¹. I mitocondri sono anche coinvolti nella regolazione dell’omeostasi cellulare (ad esempio, redox intracellulare² e l’equilibrio del calcio³), segnalazione cellulare^4,5, apoptosi⁶, sintesi di diversi composti biochimici ^7,8 e risposta immunitaria innata⁹. La disfunzione mitocondriale è associata a vari stati patologici e malattie umane¹⁰.

Il funzionamento dei mitocondri dipende dall’informazione genetica situata in due genomi separati: il genoma nucleare e mitocondriale. Il genoma mitocondriale codifica per un piccolo numero di geni rispetto al genoma nucleare, ma tutti i geni codificati dal mtDNA sono essenziali per la vita umana. Il meccanismo proteico mitocondriale necessario per mantenere il mtDNA è codificato dall’nDNA. I componenti di base del replisoma mitocondriale, così come alcuni fattori di biogenesi mitocondriale, sono già stati identificati (rivisti nella ricerca precedente^11,12). Tuttavia, i meccanismi di replicazione e mantenimento del DNA mitocondriale sono ancora lontani dall’essere compresi. A differenza dell’nDNA, il genoma mitocondriale esiste in più copie, il che fornisce un ulteriore strato per regolare l’espressione genica mitocondriale. Molto meno si sa attualmente sulla distribuzione e la segregazione del mtDNA all’interno degli organelli, in che misura questi processi sono regolati e, se lo sono, quali proteine sono coinvolte¹³. Il modello di segregazione è cruciale quando le cellule contengono una popolazione mista di mtDNA wild-type e mutato. La loro distribuzione ineguale può portare alla generazione di cellule con una quantità dannosa di mtDNA mutato.

Finora, i fattori proteici necessari per il mantenimento del mtDNA sono stati identificati principalmente con metodi biochimici, analisi bioinformatiche o attraverso studi associati alla malattia. In questo lavoro, al fine di garantire un’alta probabilità di identificare fattori che in precedenza sono sfuggiti all’identificazione, viene descritta una strategia diversa. Il metodo si basa sulla marcatura del mtDNA durante la replicazione o la riparazione con 5-bromo-2′-deossiuridina (BrdU), un analogo nucleosidico della timidina. BrdU è facilmente incorporato nei filamenti di DNA nascente durante la sintesi del DNA e, in generale, viene utilizzato per monitorare la replicazione del DNA nucleare¹⁴. Tuttavia, la procedura sviluppata qui è stata ottimizzata per rilevare BrdU incorporato nel mtDNA utilizzando l’immunofluorescenza degli anticorpi anti-BrdU.

L’approccio consente la quantificazione ad alto rendimento della sintesi e della distribuzione del mtDNA in cellule umane coltivate in vitro. È necessaria una strategia ad alto rendimento per condurre test in diverse condizioni sperimentali in un tempo relativamente breve; Pertanto, si propone nel protocollo di utilizzare un formato multi-pozzo per la coltura cellulare e la microscopia a fluorescenza automatizzata per l’imaging. Il protocollo include la trasfezione di cellule HeLa umane con una libreria di siRNA e il successivo monitoraggio della replicazione o riparazione del mtDNA utilizzando la marcatura metabolica del DNA appena sintetizzato con BrdU. Questo approccio è combinato con l’immunocolorazione del DNA con l’aiuto di anticorpi anti-DNA. Entrambi i parametri vengono analizzati utilizzando la microscopia quantitativa a fluorescenza. Inoltre, i mitocondri vengono visualizzati con un colorante specifico. Per dimostrare la specificità del protocollo, la colorazione BrdU è stata testata su cellule prive di mtDNA (cellule rho0), su cellule HeLa dopo il silenziamento di noti fattori di mantenimento del mtDNA e su cellule HeLa dopo trattamento con un inibitore della replicazione del mtDNA. I livelli di mtDNA sono stati misurati anche con un metodo indipendente, vale a dire qPCR.