כימות מבוסס תמונה בתפוקה גבוהה של סינתזה והפצה של DNA מיטוכונדריאלי
Summary
מתואר הליך לחקר הדינמיקה של מטבוליזם של דנ”א מיטוכונדריאלי (mtDNA) בתאים באמצעות פורמט צלחת מרובת בארות והדמיה אימונופלואורסצנטית אוטומטית כדי לזהות ולכמת סינתזה והפצה של mtDNA. זה יכול לשמש גם כדי לחקור את ההשפעות של מעכבים שונים, לחצים תאיים והשתקת גנים על חילוף החומרים mtDNA.
Abstract
הרוב המכריע של תהליכים תאיים דורשים אספקה רציפה של אנרגיה, המוביל הנפוץ ביותר של אשר הוא מולקולת ATP. תאים אאוקריוטים מייצרים את רוב ה-ATP שלהם במיטוכונדריה על ידי זרחן חמצוני. מיטוכונדריה הם אברונים ייחודיים מכיוון שיש להם גנום משלהם המשוכפל ומועבר לדור הבא של התאים. בניגוד לגנום הגרעיני, ישנם עותקים רבים של הגנום המיטוכונדריאלי בתא. המחקר המפורט של המנגנונים האחראים לשכפול, תיקון ותחזוקה של הגנום המיטוכונדריאלי חיוני להבנת תפקודם התקין של מיטוכונדריה ותאים שלמים בתנאי נורמליות ומחלות כאחד. כאן מוצגת שיטה המאפשרת כימות בתפוקה גבוהה של סינתזה והפצה של DNA מיטוכונדריאלי (mtDNA) בתאים אנושיים בתרבית חוץ גופית . גישה זו מבוססת על זיהוי אימונופלואורסצנטי של מולקולות DNA מסונתזות באופן פעיל המסומנות על ידי שילוב 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) וזיהוי בו זמנית של כל מולקולות mtDNA עם נוגדנים נגד DNA. נוסף על כך, מדמיינים את המיטוכונדריה בעזרת צבעים או נוגדנים ספציפיים. גידול תאים בפורמט רב-באר ושימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומטי מקלים על חקר הדינמיקה של mtDNA והמורפולוגיה של המיטוכונדריה במגוון תנאי ניסוי בזמן קצר יחסית.
Introduction
עבור רוב התאים האיקריוטים, מיטוכונדריה הם אברונים חיוניים, שכן הם ממלאים תפקיד מכריע בתהליכים תאיים רבים. בראש ובראשונה, מיטוכונדריה הם ספקי האנרגיה העיקריים של תאים1. מיטוכונדריה מעורבים גם בוויסות הומאוסטזיס תאי (לדוגמה, חמצון-חיזור תוך-תאי2 ומאזן הסידן3), איתות תאי 4,5, אפופטוזיס6, סינתזה של תרכובות ביוכימיות שונות7,8, והתגובה החיסונית המולדת9. תפקוד לקוי של המיטוכונדריה קשור למצבים פתולוגיים שונים ולמחלות אנושיות10.
תפקוד המיטוכונדריה תלוי במידע הגנטי הנמצא בשני גנומים נפרדים: הגנום הגרעיני והמיטוכונדריאלי. הגנום המיטוכונדריאלי מקודד מספר קטן של גנים בהשוואה לגנום הגרעיני, אך כל הגנים המקודדים ב-mtDNA חיוניים לחיי האדם. מנגנון החלבונים המיטוכונדריאליים הדרוש לשמירה על mtDNA מקודד על ידי nDNA. המרכיבים הבסיסיים של הרפליזום המיטוכונדריאלי, כמו גם כמה גורמים ביוגנזה מיטוכונדריאלית, כבר זוהו (נסקרו במחקר קודם11,12). עם זאת, מנגנוני השכפול והתחזוקה של הדנ”א המיטוכונדריאלי עדיין רחוקים מלהיות מובנים. בניגוד ל-nDNA, הגנום המיטוכונדריאלי קיים במספר עותקים, מה שמספק שכבה נוספת לוויסות ביטוי גנים מיטוכונדריאליים. הרבה פחות ידוע כיום על התפלגות והפרדה של mtDNA בתוך אברונים, באיזו מידה תהליכים אלה מוסדרים, ואם כן, אילו חלבונים מעורבים13. דפוס ההפרדה הוא חיוני כאשר תאים מכילים אוכלוסייה מעורבת של mtDNA מסוג בר ומוטציה. התפלגות לא שוויונית שלהם עלולה להוביל ליצירת תאים עם כמות מזיקה של mtDNA מוטציה.
עד כה, הגורמים החלבוניים הדרושים לתחזוקת mtDNA זוהו בעיקר בשיטות ביוכימיות, ניתוחים ביואינפורמטיים או באמצעות מחקרים הקשורים למחלות. בעבודה זו, על מנת להבטיח סיכוי גבוה לזיהוי גורמים שחמקו בעבר מזיהוי, מתוארת אסטרטגיה שונה. השיטה מבוססת על תיוג של mtDNA במהלך שכפול או תיקון עם 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU), אנלוג נוקלאוזיד של תימידין. BrdU משולב בקלות בגדילי דנ”א מתהווים במהלך סינתזת דנ”א, ובאופן כללי, משמש לניטור שכפול דנ”א גרעיני14. עם זאת, ההליך שפותח כאן הותאם לאיתור BrdU המשולב ב- mtDNA באמצעות אימונופלואורסנציה של נוגדנים נגד BrdU.
הגישה מאפשרת כימות בתפוקה גבוהה של סינתזת mtDNA והפצה בתאים אנושיים בתרבית חוץ גופית. יש צורך באסטרטגיית תפוקה גבוהה כדי לבצע בדיקות בתנאי ניסוי שונים בזמן קצר יחסית; לכן, מוצע בפרוטוקול להשתמש בפורמט רב בארות לתרבית תאים ומיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומטי להדמיה. הפרוטוקול כולל העברה של תאי HeLa אנושיים עם ספריית siRNA וניטור עוקב של שכפול או תיקון mtDNA באמצעות תיוג מטבולי של DNA מסונתז חדש עם BrdU. גישה זו משולבת עם immunostaining של ה- DNA בעזרת נוגדנים anti DNA. שני הפרמטרים מנותחים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כמותי. נוסף על כך, מדמיינים מיטוכונדריה באמצעות צבע מסוים. כדי להדגים את הספציפיות של הפרוטוקול, צביעת BrdU נבדקה על תאים נטולי mtDNA (תאי rho0), על תאי HeLa על השתקה של גורמי תחזוקה ידועים של mtDNA, ועל תאי HeLa לאחר טיפול במעכב שכפול mtDNA. רמות mtDNA נמדדו גם בשיטה עצמאית, כלומר qPCR.
Protocol
Representative Results
Discussion
מבחינה היסטורית, תיוג DNA על ידי שילוב BrdU וזיהוי נוגדנים שימש בשכפול DNA גרעיני ומחקר מחזור התא 14,27,28. עד כה, כל הפרוטוקולים לזיהוי DNA המסומן ב- BrdU כללו שלב דנטורציה של DNA (חומצי או תרמי) או עיכול אנזים (DNase או פרוטאינאז) כדי לאפשר חשיפה לאפיטופים …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המרכז הלאומי למדע, פולין (מספר מענק/פרס: 2018/31/D/NZ2/03901).
Materials
| 2′,3′-Dideoxycytidine (ddC) | Sigma-Aldrich | D5782 | |
| 384 Well Cell Culture Microplates, black | Greiner Bio-One | #781946 | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) | Sigma-Aldrich | B5002-1G | Dissolve BrdU powder in water to 20 mM stock solution and aliquot. Use 20 µM BrdU solution for labeling. |
| Adhesive sealing film | Nerbe Plus | 04-095-0060 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21121 | |
| Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgM secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21426 | |
| BioTek 405 LS microplate washer | Agilent | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Cell counting chamber Thoma | Heinz Herenz | REF:1080339 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Cytiva | SH30243.01 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 41965-062 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F1635 | Formaldehyde is toxic; please read the safety data sheet carefully. |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| IgG1 mouse monoclonal anti-BrdU (IIB5) primary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32323 | |
| IgM mouse monoclonal anti-DNA (AC-30-10) primary antibody | Progen | #61014 | |
| LightCycler 480 System | Roche | ||
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | #13778150 | |
| MitoTracker Deep Red FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 | Mitochondria tracking dye |
| Multidrop Combi Reagent Dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 51985-042 | |
| Orca-R2 (C10600) CCD Camera | Hamamatsu | ||
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781-100ML | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| qPCR primer Fw B2M (reference) | CAGGTACTCCAAAGATTCAGG | ||
| qPCR primer Fw GPI (reference gene) | GACCTTTACTACCCAGGAGA | ||
| qPCR primer Fw MT-ND1 | TAGCAGAGACCAACCGAACC | ||
| qPCR primer Fw POLG | TGGAAGGCAGGCATGGTCAAACC | ||
| qPCR primer Fw TFAM | GATGAGTTCTGCCTGCTTTAT | ||
| qPCR primer Fw TWNK | GCCATGTGACACTGGTCATT | ||
| qPCR primer Rev B2M (reference) | GTCAACTTCAATGTCGGATGG | ||
| qPCR primer Rev GPI (reference gene) | AGTAGACAGGGCAACAAAGT | ||
| qPCR primer Rev MT-ND1 | ATGAAGAATAGGGCGAAGGG | ||
| qPCR primer Rev POLG | GGAGTCAGAACACCTGGCTTTGG | ||
| qPCR primer Rev TFAM | GGACTTCTGCCAGCATAATA | ||
| qPCR primer Rev TWNK | AACATTGTCTGCTTCCTGGC | ||
| ScanR microscope | Olympus | ||
| siRNA Ctrl | Dharmacon | D-001810-10-5 | |
| siRNA POLG | Invitrogen | POLGHSS108223 | |
| siRNA TFAM | Invitrogen | TFAMHSS144252 | |
| siRNA TWNK | Invitrogen | C10orf2HSS125597 | |
| Suction device | NeoLab | 2-9335 | Suction device for cell culture |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| Trypsin | Biowest | L0931-500 | |
| UPlanSApo 20x 0.75 NA objective | Olympus |
References
- Brown, G. C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells. The Biochemical Journal. 284, 1-13 (1992).
- Zhang, L., et al. Biochemical basis and metabolic interplay of redox regulation). Redox Biology. 26, 101284 (2019).
- Pizzo, P., Drago, I., Filadi, R., Pozzan, T. Mitochondrial Ca2+ homeostasis: Mechanism, role, and tissue specificities. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 464 (1), 3-17 (2012).
- Shadel, G. S., Horvath, T. L. Mitochondrial ROS signaling in organismal homeostasis. Cell. 163 (3), 560-569 (2015).
- Martínez-Reyes, I., Chandel, N. S. Mitochondrial TCA cycle metabolites control physiology and disease. Nature Communications. 11 (1), 102 (2020).
- Galluzzi, L., Kepp, O., Trojel-Hansen, C., Kroemer, G. Mitochondrial control of cellular life, stress, and death. Circulation Research. 111 (9), 1198-1207 (2012).
- Rone, M. B., Fan, J., Papadopoulos, V. Cholesterol transport in steroid biosynthesis: role of protein-protein interactions and implications in disease states. Biochimica Et Biophysica Acta. 1791 (7), 646-658 (2009).
- Swenson, S. A., et al. From synthesis to utilization: The ins and outs of mitochondrial heme. Cells. 9 (3), 579 (2020).
- West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S. Mitochondria in innate immune responses. Nature Reviews. Immunology. 11 (6), 389-402 (2011).
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: In sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
- Pohjoismäki, J. L. O., Goffart, S. Of circles, forks and humanity: Topological organisation and replication of mammalian mitochondrial DNA. BioEssays. 33 (4), 290-299 (2011).
- Gustafsson, C. M., Falkenberg, M., Larsson, N. -. G. Maintenance and expression of mammalian mitochondrial DNA. Annual Review of Biochemistry. 85, 133-160 (2016).
- Nicholls, T. J., Gustafsson, C. M. Separating and segregating the human mitochondrial genome. Trends in Biochemical Sciences. 43 (11), 869-881 (2018).
- Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218 (4571), 474-475 (1982).
- Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: Improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433 (2021).
- R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2021).
- . dplyr: A Grammar of Data Manipulation Available from: https://CRAN.R-project.org/package=dplyr (2021)
- . data.table: Extension of `data.frame Available from: https://CRAN.R-project.org/package=data.table (2020)
- . ggplot2: Elegant graphics for data analysis Available from: https://ggplot2.tidyverse.org (2016)
- . ggpubr: "ggplot2" based publication ready plots Available from: https://CRAN.R-project.org/package=ggpubr (2020)
- Hashiguchi, K., Zhang-Akiyama, Q. -. M. Establishment of human cell lines lacking mitochondrial DNA. Methods in Molecular Biology. 554, 383-391 (2009).
- Piechota, J., Szczesny, R., Wolanin, K., Chlebowski, A., Bartnik, E. Nuclear and mitochondrial genome responses in HeLa cells treated with inhibitors of mitochondrial DNA expression. Acta Biochimica Polonica. 53 (3), 485-495 (2006).
- Spelbrink, J. N., et al. Human mitochondrial DNA deletions associated with mutations in the gene encoding Twinkle, a phage T7 gene 4-like protein localized in mitochondria. Nature Genetics. 28 (3), 223-231 (2001).
- Campbell, C. T., Kolesar, J. E., Kaufman, B. A. Mitochondrial transcription factor A regulates mitochondrial transcription initiation, DNA packaging, and genome copy number. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (9-10), 921-929 (2012).
- Krasich, R., Copeland, W. C. DNA polymerases in the mitochondria: A critical review of the evidence. Frontiers in Bioscience. 22 (4), 692-709 (2017).
- Kotrys, A. V., et al. Quantitative proteomics revealed C6orf203/MTRES1 as a factor preventing stress-induced transcription deficiency in human mitochondria. Nucleic Acids Research. 47 (14), 7502-7517 (2019).
- Gratzner, H. G., Pollack, A., Ingram, D. J., Leif, R. C. Deoxyribonucleic acid replication in single cells and chromosomes by immunologic techniques. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 24 (1), 34-39 (1976).
- Leif, R. C., Stein, J. H., Zucker, R. M. A short history of the initial application of anti-5-BrdU to the detection and measurement of S phase. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (1), 45-52 (2004).
- Lentz, S. I., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) biogenesis: visualization and duel incorporation of BrdU and EdU into newly synthesized mtDNA in vitro. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (2), 207-218 (2010).
- Liu, Y., et al. Multi-omic measurements of heterogeneity in HeLa cells across laboratories. Nature Biotechnology. 37 (3), 314-322 (2019).
