High-throughput image-based kwantificering van mitochondriale DNA-synthese en -distributie
Summary
Een procedure voor het bestuderen van de dynamiek van mitochondriaal DNA (mtDNA) metabolisme in cellen met behulp van een multi-well plaatformaat en geautomatiseerde immunofluorescentie beeldvorming om mtDNA-synthese en -distributie te detecteren en te kwantificeren, wordt beschreven. Dit kan verder worden gebruikt om de effecten van verschillende remmers, cellulaire stress en gen-uitschakeling op het mtDNA-metabolisme te onderzoeken.
Abstract
De overgrote meerderheid van cellulaire processen vereist een continue toevoer van energie, waarvan de meest voorkomende drager het ATP-molecuul is. Eukaryote cellen produceren het grootste deel van hun ATP in de mitochondriën door oxidatieve fosforylering. Mitochondriën zijn unieke organellen omdat ze hun eigen genoom hebben dat wordt gerepliceerd en doorgegeven aan de volgende generatie cellen. In tegenstelling tot het nucleaire genoom zijn er meerdere kopieën van het mitochondriale genoom in de cel. De gedetailleerde studie van de mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de replicatie, reparatie en onderhoud van het mitochondriale genoom is essentieel voor het begrijpen van de goede werking van mitochondriën en hele cellen onder zowel normale als ziekteomstandigheden. Hier wordt een methode gepresenteerd die de high-throughput kwantificering van de synthese en distributie van mitochondriaal DNA (mtDNA) in menselijke cellen die in vitro zijn gekweekt, mogelijk maakt. Deze aanpak is gebaseerd op de immunofluorescentiedetectie van actief gesynthetiseerde DNA-moleculen gelabeld door 5-broom-2′-deoxyuridine (BrdU) -opname en de gelijktijdige detectie van alle mtDNA-moleculen met anti-DNA-antilichamen. Bovendien worden de mitochondriën gevisualiseerd met specifieke kleurstoffen of antilichamen. Het kweken van cellen in een multi-well formaat en het gebruik van een geautomatiseerde fluorescentiemicroscoop maken het gemakkelijker om de dynamiek van mtDNA en de morfologie van mitochondriën onder verschillende experimentele omstandigheden in een relatief korte tijd te bestuderen.
Introduction
Voor de meeste eukaryote cellen zijn mitochondriën essentiële organellen, omdat ze een cruciale rol spelen in tal van cellulaire processen. Eerst en vooral zijn mitochondriën de belangrijkste energieleveranciers van cellen1. Mitochondriën zijn ook betrokken bij het reguleren van cellulaire homeostase (bijvoorbeeld intracellulaire redox2 en de calciumbalans3), celsignalering4,5, apoptose6, de synthese van verschillende biochemische verbindingen 7,8 en de aangeboren immuunrespons9. Mitochondriale disfunctie is geassocieerd met verschillende pathologische toestanden en menselijke ziekten10.
De werking van mitochondriën hangt af van de genetische informatie in twee afzonderlijke genomen: de nucleaire en mitochondriale genomen. Het mitochondriale genoom codeert voor een klein aantal genen in vergelijking met het nucleaire genoom, maar alle mtDNA-gecodeerde genen zijn essentieel voor het menselijk leven. De mitochondriale eiwitmachinerie die nodig is om het mtDNA in stand te houden, wordt gecodeerd door nDNA. De basiscomponenten van het mitochondriale replisoom, evenals enkele mitochondriale biogenesefactoren, zijn al geïdentificeerd (beoordeeld in eerder onderzoek11,12). Mitochondriale DNA-replicatie- en onderhoudsmechanismen zijn echter nog lang niet begrepen. In tegenstelling tot nDNA bestaat het mitochondriale genoom in meerdere kopieën, wat een extra laag biedt voor het reguleren van mitochondriale genexpressie. Er is momenteel veel minder bekend over de verdeling en segregatie van mtDNA binnen organellen, in hoeverre deze processen gereguleerd zijn, en zo ja, welke eiwitten erbij betrokken zijn13. Het segregatiepatroon is cruciaal wanneer cellen een gemengde populatie van wild-type en gemuteerd mtDNA bevatten. Hun ongelijke verdeling kan leiden tot de generatie van cellen met een schadelijke hoeveelheid gemuteerd mtDNA.
Tot nu toe zijn de eiwitfactoren die nodig zijn voor mtDNA-onderhoud voornamelijk geïdentificeerd door biochemische methoden, bioinformatische analyses of door ziektegerelateerde studies. In dit werk, om een grote kans te garanderen op het identificeren van factoren die eerder aan identificatie zijn ontsnapt, wordt een andere strategie beschreven. De methode is gebaseerd op de etikettering van mtDNA tijdens replicatie of reparatie met 5-broom-2′-deoxyuridine (BrdU), een nucleoside-analoog van thymidine. BrdU wordt gemakkelijk opgenomen in ontluikende DNA-strengen tijdens DNA-synthese en wordt in het algemeen gebruikt voor het monitoren van de replicatie van nucleair DNA14. De hier ontwikkelde procedure is echter geoptimaliseerd voor het detecteren van BrdU opgenomen in mtDNA met behulp van de immunofluorescentie van anti-BrdU-antilichamen.
De aanpak maakt de high-throughput kwantificering van mtDNA-synthese en -distributie mogelijk in menselijke cellen die in vitro zijn gekweekt. Een high-throughput strategie is noodzakelijk om in relatief korte tijd testen uit te voeren onder verschillende experimentele omstandigheden; Daarom wordt in het protocol voorgesteld om een multi-well-formaat te gebruiken voor celkweek en geautomatiseerde fluorescentiemicroscopie voor beeldvorming. Het protocol omvat de transfectie van menselijke HeLa-cellen met een siRNA-bibliotheek en de daaropvolgende monitoring van mtDNA-replicatie of -reparatie met behulp van de metabole etikettering van nieuw gesynthetiseerd DNA met BrdU. Deze aanpak wordt gecombineerd met immunostaining van het DNA met behulp van anti-DNA-antilichamen. Beide parameters worden geanalyseerd met behulp van kwantitatieve fluorescentiemicroscopie. Bovendien worden mitochondriën gevisualiseerd met een specifieke kleurstof. Om de specificiteit van het protocol aan te tonen, werd BrdU-kleuring getest op cellen zonder mtDNA (rho0-cellen), op HeLa-cellen na het uitschakelen van bekende mtDNA-onderhoudsfactoren en op HeLa-cellen na behandeling met een mtDNA-replicatieremmer. De mtDNA-niveaus werden ook gemeten met een onafhankelijke methode, namelijk qPCR.
Protocol
Representative Results
Discussion
Historisch gezien is DNA-etikettering door BrdU-opname en antilichaamdetectie gebruikt in nucleaire DNA-replicatie en celcyclusonderzoek 14,27,28. Tot nu toe hebben alle protocollen voor het detecteren van BrdU-gelabeld DNA een DNA-denaturatiestap (zuur of thermisch) of enzymvertering (DNase of proteïnase) opgenomen om blootstelling aan epitoop mogelijk te maken en de penetratie van antilichamen te vergemakkelijken. Deze protoc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het National Science Centre, Polen (Grant/Award Number: 2018/31/D/NZ2/03901).
Materials
| 2′,3′-Dideoxycytidine (ddC) | Sigma-Aldrich | D5782 | |
| 384 Well Cell Culture Microplates, black | Greiner Bio-One | #781946 | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) | Sigma-Aldrich | B5002-1G | Dissolve BrdU powder in water to 20 mM stock solution and aliquot. Use 20 µM BrdU solution for labeling. |
| Adhesive sealing film | Nerbe Plus | 04-095-0060 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21121 | |
| Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgM secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21426 | |
| BioTek 405 LS microplate washer | Agilent | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Cell counting chamber Thoma | Heinz Herenz | REF:1080339 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Cytiva | SH30243.01 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 41965-062 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F1635 | Formaldehyde is toxic; please read the safety data sheet carefully. |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| IgG1 mouse monoclonal anti-BrdU (IIB5) primary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32323 | |
| IgM mouse monoclonal anti-DNA (AC-30-10) primary antibody | Progen | #61014 | |
| LightCycler 480 System | Roche | ||
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | #13778150 | |
| MitoTracker Deep Red FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 | Mitochondria tracking dye |
| Multidrop Combi Reagent Dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 51985-042 | |
| Orca-R2 (C10600) CCD Camera | Hamamatsu | ||
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781-100ML | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| qPCR primer Fw B2M (reference) | CAGGTACTCCAAAGATTCAGG | ||
| qPCR primer Fw GPI (reference gene) | GACCTTTACTACCCAGGAGA | ||
| qPCR primer Fw MT-ND1 | TAGCAGAGACCAACCGAACC | ||
| qPCR primer Fw POLG | TGGAAGGCAGGCATGGTCAAACC | ||
| qPCR primer Fw TFAM | GATGAGTTCTGCCTGCTTTAT | ||
| qPCR primer Fw TWNK | GCCATGTGACACTGGTCATT | ||
| qPCR primer Rev B2M (reference) | GTCAACTTCAATGTCGGATGG | ||
| qPCR primer Rev GPI (reference gene) | AGTAGACAGGGCAACAAAGT | ||
| qPCR primer Rev MT-ND1 | ATGAAGAATAGGGCGAAGGG | ||
| qPCR primer Rev POLG | GGAGTCAGAACACCTGGCTTTGG | ||
| qPCR primer Rev TFAM | GGACTTCTGCCAGCATAATA | ||
| qPCR primer Rev TWNK | AACATTGTCTGCTTCCTGGC | ||
| ScanR microscope | Olympus | ||
| siRNA Ctrl | Dharmacon | D-001810-10-5 | |
| siRNA POLG | Invitrogen | POLGHSS108223 | |
| siRNA TFAM | Invitrogen | TFAMHSS144252 | |
| siRNA TWNK | Invitrogen | C10orf2HSS125597 | |
| Suction device | NeoLab | 2-9335 | Suction device for cell culture |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| Trypsin | Biowest | L0931-500 | |
| UPlanSApo 20x 0.75 NA objective | Olympus |
References
- Brown, G. C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells. The Biochemical Journal. 284, 1-13 (1992).
- Zhang, L., et al. Biochemical basis and metabolic interplay of redox regulation). Redox Biology. 26, 101284 (2019).
- Pizzo, P., Drago, I., Filadi, R., Pozzan, T. Mitochondrial Ca2+ homeostasis: Mechanism, role, and tissue specificities. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 464 (1), 3-17 (2012).
- Shadel, G. S., Horvath, T. L. Mitochondrial ROS signaling in organismal homeostasis. Cell. 163 (3), 560-569 (2015).
- Martínez-Reyes, I., Chandel, N. S. Mitochondrial TCA cycle metabolites control physiology and disease. Nature Communications. 11 (1), 102 (2020).
- Galluzzi, L., Kepp, O., Trojel-Hansen, C., Kroemer, G. Mitochondrial control of cellular life, stress, and death. Circulation Research. 111 (9), 1198-1207 (2012).
- Rone, M. B., Fan, J., Papadopoulos, V. Cholesterol transport in steroid biosynthesis: role of protein-protein interactions and implications in disease states. Biochimica Et Biophysica Acta. 1791 (7), 646-658 (2009).
- Swenson, S. A., et al. From synthesis to utilization: The ins and outs of mitochondrial heme. Cells. 9 (3), 579 (2020).
- West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S. Mitochondria in innate immune responses. Nature Reviews. Immunology. 11 (6), 389-402 (2011).
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: In sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
- Pohjoismäki, J. L. O., Goffart, S. Of circles, forks and humanity: Topological organisation and replication of mammalian mitochondrial DNA. BioEssays. 33 (4), 290-299 (2011).
- Gustafsson, C. M., Falkenberg, M., Larsson, N. -. G. Maintenance and expression of mammalian mitochondrial DNA. Annual Review of Biochemistry. 85, 133-160 (2016).
- Nicholls, T. J., Gustafsson, C. M. Separating and segregating the human mitochondrial genome. Trends in Biochemical Sciences. 43 (11), 869-881 (2018).
- Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218 (4571), 474-475 (1982).
- Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: Improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433 (2021).
- R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2021).
- . dplyr: A Grammar of Data Manipulation Available from: https://CRAN.R-project.org/package=dplyr (2021)
- . data.table: Extension of `data.frame Available from: https://CRAN.R-project.org/package=data.table (2020)
- . ggplot2: Elegant graphics for data analysis Available from: https://ggplot2.tidyverse.org (2016)
- . ggpubr: "ggplot2" based publication ready plots Available from: https://CRAN.R-project.org/package=ggpubr (2020)
- Hashiguchi, K., Zhang-Akiyama, Q. -. M. Establishment of human cell lines lacking mitochondrial DNA. Methods in Molecular Biology. 554, 383-391 (2009).
- Piechota, J., Szczesny, R., Wolanin, K., Chlebowski, A., Bartnik, E. Nuclear and mitochondrial genome responses in HeLa cells treated with inhibitors of mitochondrial DNA expression. Acta Biochimica Polonica. 53 (3), 485-495 (2006).
- Spelbrink, J. N., et al. Human mitochondrial DNA deletions associated with mutations in the gene encoding Twinkle, a phage T7 gene 4-like protein localized in mitochondria. Nature Genetics. 28 (3), 223-231 (2001).
- Campbell, C. T., Kolesar, J. E., Kaufman, B. A. Mitochondrial transcription factor A regulates mitochondrial transcription initiation, DNA packaging, and genome copy number. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (9-10), 921-929 (2012).
- Krasich, R., Copeland, W. C. DNA polymerases in the mitochondria: A critical review of the evidence. Frontiers in Bioscience. 22 (4), 692-709 (2017).
- Kotrys, A. V., et al. Quantitative proteomics revealed C6orf203/MTRES1 as a factor preventing stress-induced transcription deficiency in human mitochondria. Nucleic Acids Research. 47 (14), 7502-7517 (2019).
- Gratzner, H. G., Pollack, A., Ingram, D. J., Leif, R. C. Deoxyribonucleic acid replication in single cells and chromosomes by immunologic techniques. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 24 (1), 34-39 (1976).
- Leif, R. C., Stein, J. H., Zucker, R. M. A short history of the initial application of anti-5-BrdU to the detection and measurement of S phase. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (1), 45-52 (2004).
- Lentz, S. I., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) biogenesis: visualization and duel incorporation of BrdU and EdU into newly synthesized mtDNA in vitro. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (2), 207-218 (2010).
- Liu, Y., et al. Multi-omic measurements of heterogeneity in HeLa cells across laboratories. Nature Biotechnology. 37 (3), 314-322 (2019).
