Un procedimiento para la criosección de ganglios de la raíz dorsal de ratón
Summary
Aquí se presenta el desarrollo para la adquisición consistente de secciones de criostato de ganglios de raíces dorsales de alta calidad.
Abstract
Las secciones de criostato de ganglios de la raíz dorsal (DRG) de ratón de alta calidad son cruciales para la tinción inmunoquímica adecuada y los estudios de ARNoscopio en la investigación del dolor inflamatorio y neuropático, la picazón y otras afecciones neurológicas periféricas. Sin embargo, sigue siendo un desafío obtener consistentemente secciones de criostato de alta calidad, intactas y planas en portaobjetos de vidrio debido al pequeño tamaño de la muestra del tejido DRG. Hasta el momento, no existe ningún artículo que describa un protocolo óptimo para la criosección de DRG. Este protocolo presenta un método paso a paso para resolver las dificultades frecuentes asociadas con la criosección de DRG. El artículo presentado explica cómo eliminar el líquido circundante de las muestras de tejido de DRG, colocar las secciones de DRG en el portaobjetos mirando hacia la misma orientación y aplanar las secciones en el portaobjetos de vidrio sin curvarse hacia arriba. Aunque este protocolo se ha desarrollado para la criosección de las muestras de DRG, se puede aplicar para la criosección de muchos otros tejidos con un tamaño de muestra pequeño.
Introduction
El ganglio de la raíz dorsal (DRG) contiene las neuronas sensoriales primarias, los macrófagos tisulares y las células satélite que rodean a las neuronas sensoriales primarias 1,2,3,4. Es una estructura anatómica clave en el procesamiento de señales inocuas y nocivas, y desempeña un papel fundamental en el dolor, la picazón y diversos trastornos de los nervios periféricos 5,6,7,8,9,10,11,12,13. Aunque se han desarrollado varios métodos para diseccionar el tejido de DRG de la médula espinal del ratón14,15,16, la criosección del tejido de DRG sigue siendo un desafío, ya que el tejido de DRG es bastante pequeño y las secciones de criostato de las muestras de DRG tienden a curvarse en rollos, lo que dificulta la transferencia adecuada de las secciones de criostato a portaobjetos de vidrio. Sin embargo, la criosección adecuada del tejido DRG es crucial para los estudios de inmunohistoquímica y la estructura de las neuronas sensoriales DRG 17,18,19,20,21,22,23. Además, dado que los resultados de la secuenciación del ARN de una sola célula han revelado la notable heterogeneidad de las neuronas sensoriales DRG tanto en humanos24 como en ratones25, la criosección adecuada del tejido DRG es fundamental para investigar el papel funcional de diferentes células DRG en diversas condiciones fisiológicas y patológicas.
Aunque la técnica de limpieza de tejidos se ha aplicado para investigar la reconstrucción 3D del DRG26 como una técnica alternativa de criosección del DRG, la técnica de limpieza de tejidos requiere tiempo y trabajo. En comparación, la criosección de la GRD es rápida y relativamente fácil de realizar, por lo que sigue siendo una técnica clave para los estudios de inmunohistoquímica y estructura de la GRD y otras regiones del sistema nervioso central. Sin embargo, la obtención de secciones de criostato de alta calidad, intactas y planas en portaobjetos de vidrio sigue siendo un desafío en la investigación neurocientífica debido al pequeño tamaño de la muestra de tejidos, como el DRG y ciertas regiones del cerebro, y no hay ningún artículo que describa el protocolo óptimo en este momento para crioseccionar muestras de tejido de pequeño tamaño, como los DRG de ratón.
Este protocolo proporciona una técnica fácil y paso a paso para el corte de criostato del DRG del ratón para obtener de manera confiable la mayor cantidad de secciones de DRG de alta calidad en los portaobjetos para estudios posteriores de DRG. Si bien está diseñada específicamente para crioseccionar muestras de DRG, esta técnica puede usarse potencialmente para crioseccionar otros tejidos con un tamaño de muestra pequeño.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo proporciona un procedimiento sencillo paso a paso para el seccionamiento por criostato del DRG del ratón para obtener secciones de DRG de alta calidad en portaobjetos de forma fiable. Hay cuatro pasos críticos en este protocolo. Primero, la muestra de DRG y las pinzas deben estar secas antes de colocar la muestra de DRG en la OCT base. Cualquier líquido que rodee la muestra de DRG formará una capa de hielo a su alrededor, lo que hará que las secciones de DRG se separen de la OCT y se curven hacia arri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ninguno.
Materials
| Avertin | Sigma-Aldrich | T48402-25G | Anesthetize animal |
| Epredia Cryotome Cryostat Cryocassettes, 25 mm dia. Crosshatched | Fisherbrand | 1910 | Hold the OCT section at the bottom |
| Ergo Tweezers | Fisherbrand | S95310 | Using the end of a tweezer to gently touch the bottom (6 o’clock) of the section so that it sticks to the platform surface to prevent the section from curving back in a roll |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 1255015 | To collect the DRG section |
| Marking pens | Fisherbrand | 133794 | Mark the orientation of base OCT |
| Scigen Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisherbrand | 23730571 | Embedding medium for frozen tissue specimens to ensure optimal cutting temperature (O.C.T.). |
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