Процедура криосекции ганглия заднего корешка мыши
Summary
Здесь представлена разработка для стабильного получения высококачественных срезов криостата ганглия заднего корешка.
Abstract
Высококачественные криостатные срезы ганглия заднего корешка мыши (DRG) имеют решающее значение для правильного иммунохимического окрашивания и РНК-скопических исследований при исследовании воспалительной и нейропатической боли, зуда, а также других периферических неврологических состояний. Тем не менее, по-прежнему остается сложной задачей получение высококачественных, неповрежденных и плоских срезов криостата на предметных стеклах из-за крошечного размера образца ткани DRG. До сих пор нет статьи, описывающей оптимальный протокол криосекции DRG. Данный протокол представляет собой пошаговый метод разрешения часто встречающихся трудностей, связанных с криосекционированием DRG. В представленной статье объясняется, как удалить окружающую жидкость из образцов тканей DRG, разместить секции DRG на предметном стекле, обращенные к одной и той же ориентации, и сплющить срезы на предметном стекле, не искривляя его. Несмотря на то, что этот протокол был разработан для криосекции образцов DRG, он может быть применен для криосекции многих других тканей с небольшим размером образца.
Introduction
Ганглий дорсального корешка (DRG) содержит первичные сенсорные нейроны, тканевые макрофаги и клетки-сателлиты, которые окружают первичные сенсорные нейроны 1,2,3,4. Он является ключевой анатомической структурой в обработке безобидных и вредных сигналов и играет решающую роль в боли, зуде и различных заболеваниях периферических нервов 5,6,7,8,9,10,11,12,13. Несмотря на то, что было разработано несколько методов для препарирования ткани DRG из спинного мозга мыши14,15,16, криосекция ткани DRG остается сложной задачей, поскольку ткань DRG довольно мала, а криостатные срезы образцов DRG имеют тенденцию изгибаться в рулоны, что затрудняет правильный перенос срезов криостата на предметные стекла. Тем не менее, правильное криосекционирование ткани DRG имеет решающее значение для иммуногистохимических исследований и структуры сенсорных нейронов DRG 17,18,19,20,21,22,23. Более того, поскольку результаты секвенирования одноклеточной РНК выявили замечательную гетерогенность сенсорных нейронов DRG как у людей24, так и у мышей25, правильное криосекционирование ткани DRG имеет решающее значение для изучения функциональной роли различных DRG-клеток в различных физиологических и патологических состояниях.
Несмотря на то, что метод очистки тканей был применен для исследования 3D-реконструкции DRG26 в качестве альтернативного метода криосекции DRG, метод очистки тканей является трудоемким и трудоемким. Для сравнения, криосекция DRG выполняется быстро и относительно легко, и, таким образом, она остается ключевым методом иммуногистохимии и структурных исследований DRG и других областей центральной нервной системы. Тем не менее, получение высококачественных, неповрежденных и плоских криостатных срезов на предметных стеклах остается проблемой в исследованиях в области неврологии из-за крошечного размера выборки тканей, таких как DRG и определенные области мозга, и на данный момент нет статьи, описывающей оптимальный протокол для криосекции образцов тканей небольшого размера, таких как мышиные DRG.
Этот протокол обеспечивает простую, пошаговую технику криостатного секционирования DRG мыши, чтобы надежно получить как можно больше высококачественных срезов DRG на предметных стеклах для последующих исследований DRG. Несмотря на то, что этот метод специально разработан для криосекции образцов DRG, он потенциально может быть использован для криосекции различных других тканей с небольшим размером образца.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол обеспечивает простую пошаговую процедуру криостатного секционирования DRG мыши для надежного получения высококачественных DRG срезов на предметных стеклах. В этом протоколе есть четыре критически важных шага. Во-первых, образец DRG и пинцет должны быть сухими, прежде чем по?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Никакой.
Materials
| Avertin | Sigma-Aldrich | T48402-25G | Anesthetize animal |
| Epredia Cryotome Cryostat Cryocassettes, 25 mm dia. Crosshatched | Fisherbrand | 1910 | Hold the OCT section at the bottom |
| Ergo Tweezers | Fisherbrand | S95310 | Using the end of a tweezer to gently touch the bottom (6 o’clock) of the section so that it sticks to the platform surface to prevent the section from curving back in a roll |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 1255015 | To collect the DRG section |
| Marking pens | Fisherbrand | 133794 | Mark the orientation of base OCT |
| Scigen Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisherbrand | 23730571 | Embedding medium for frozen tissue specimens to ensure optimal cutting temperature (O.C.T.). |
References
- Guan, Z., et al. Injured sensory neuron-derived CSF1 induces microglial proliferation and DAP12-dependent pain. Nature Neuroscience. 19 (1), 94-101 (2016).
- Yu, X., et al. Dorsal root ganglion macrophages contribute to both the initiation and persistence of neuropathic pain. Nature Communications. 11 (1), 264 (2020).
- Costa, F. A. L., Moreira Neto, F. L. Satellite glial cells in sensory ganglia: its role in pain. Brazilian Journal of Anesthesiology. 65 (1), 73-81 (2015).
- Noguri, T., Hatakeyama, D., Kitahashi, T., Oka, K., Ito, E. Profile of dorsal root ganglion neurons: study of oxytocin expression. Molecular Brain. 15 (1), 44 (2022).
- Su, P. P., Zhang, L., He, L., Zhao, N., Guan, Z. The role of neuro-immune interactions in chronic pain: implications for clinical practice. Journal of Pain Research. 15, 2223-2248 (2022).
- Esposito, M. F., Malayil, R., Hanes, M., Deer, T. Unique characteristics of the dorsal root ganglion as a target for neuromodulation. Pain Medicine. 20, S23-S30 (2019).
- Chen, X. J., Sun, Y. G. Central circuit mechanisms of itch. Nature Communications. 11 (1), 3052 (2020).
- Guan, Z., Hellman, J., Schumacher, M. Contemporary views on inflammatory pain mechanisms: TRPing over innate and microglial pathways. F1000Research. , (2016).
- Boadas-Vaello, P., et al. Neuroplasticity of ascending and descending pathways after somatosensory system injury: reviewing knowledge to identify neuropathic pain therapeutic targets. Spinal Cord. 54 (5), 330-340 (2016).
- Guha, D., Shamji, M. F. The dorsal root ganglion in the pathogenesis of chronic neuropathic pain. Neurosurgery. 63, 118-126 (2016).
- Shorrock, H. K., et al. UBA1/GARS-dependent pathways drive sensory-motor connectivity defects in spinal muscular atrophy. Brain. 141 (10), 2878-2894 (2018).
- Sleigh, J. N., et al. Trk receptor signaling and sensory neuron fate are perturbed in human neuropathy caused by Gars mutations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (16), E3324-E3333 (2017).
- Rubio, M. A., Herrando-Grabulosa, M., Gaja-Capdevila, N., Vilches, J. J., Navarro, X. Characterization of somatosensory neuron involvement in the SOD1(G93A) mouse model. Scientific Reports. 12 (1), 7600 (2022).
- Sleigh, J. N., West, S. J., Schiavo, G. A video protocol for rapid dissection of mouse dorsal root ganglia from defined spinal levels. BMC Research Notes. 13 (1), 302 (2020).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, 82 (2016).
- Perner, C., Sokol, C. L. Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release. STAR Protocols. 2 (1), 100333 (2021).
- Haberberger, R. V., Barry, C., Matusica, D. Immortalized dorsal root ganglion neuron cell lines. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 184 (2020).
- Pokhilko, A., Nash, A., Cader, M. Z. Common transcriptional signatures of neuropathic pain. Pain. 161 (7), 1542-1554 (2020).
- Martin, S. L., Reid, A. J., Verkhratsky, A., Magnaghi, V., Faroni, A. Gene expression changes in dorsal root ganglia following peripheral nerve injury: roles in inflammation, cell death and nociception. Neural Regeneration Research. 14 (6), 939-947 (2019).
- Miller, R. J., Jung, H., Bhangoo, S. K., White, F. A. Cytokine and chemokine regulation of sensory neuron function. Handbook of Experimental Pharmacology. (194), 417-449 (2009).
- Neto, E., et al. Axonal outgrowth, neuropeptides expression and receptors tyrosine kinase phosphorylation in 3D organotypic cultures of adult dorsal root ganglia. PLoS One. 12 (7), e0181612 (2017).
- Nascimento, A. I., Mar, F. M., Sousa, M. M. The intriguing nature of dorsal root ganglion neurons: Linking structure with polarity and function. Progress in Neurobiolology. 168, 86-103 (2018).
- Middleton, S. J., Perez-Sanchez, J., Dawes, J. M. The structure of sensory afferent compartments in health and disease. Journal of Anatomy. 241 (5), 1186-1210 (2022).
- Nguyen, M. Q., von Buchholtz, L. J., Reker, A. N., Ryba, N. J., Davidson, S. Single-nucleus transcriptomic analysis of human dorsal root ganglion neurons. eLife. 10, e71752 (2021).
- Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).
- Hunt, M. A., et al. DRGquant: A new modular AI-based pipeline for 3D analysis of the DRG. Journal of Neuroscience Methods. 371, 109497 (2022).
