マウス背根神経節凍結切片の手順
Summary
ここでは、高品質な後根神経節クライオスタット切片を安定的に取得するための開発を紹介します。
Abstract
高品質のマウス後根神経節(DRG)クライオスタット切片は、炎症性および神経因性疼痛、かゆみ、その他の末梢神経疾患の研究における適切な免疫化学染色およびRNAscope研究に不可欠です。しかし、DRG組織のサンプルサイズが小さいため、高品質で無傷かつ平坦なクライオスタット切片をスライドガラス上に一貫して取得することは依然として課題です。これまでのところ、DRG凍結切片の最適なプロトコルを説明した記事はありません。このプロトコルは、DRG凍結切片に関連する頻繁に遭遇する問題を解決するための段階的な方法を提示します。本稿では、DRG組織サンプルから周囲の液体を除去し、DRG切片をスライド上に同じ向きで配置し、スライドガラス上の切片を湾曲せずに平らにする方法を説明します。このプロトコルはDRGサンプルの凍結切片用に開発されましたが、サンプルサイズが小さい他の多くの組織の凍結切片にも適用できます。
Introduction
後根神経節(DRG)には、一次感覚ニューロン、組織マクロファージ、および一次感覚ニューロンを取り囲む衛星細胞が含まれています1,2,3,4。これは、無害で有害な信号を処理する際の重要な解剖学的構造であり、痛み、かゆみ、およびさまざまな末梢神経障害に重要な役割を果たします5,6,7,8,9,10,11,12,13。マウス脊髄からDRG組織を解剖する方法はいくつか開発されているが14,15,16、DRG組織は非常に小さく、DRG試料のクライオスタット切片はロール状に湾曲する傾向があり、クライオスタット切片をスライドガラス上に適切に移すことが困難であるため、DRG組織の凍結切片は依然として困難である。しかし、DRG組織の適切な凍結切片は、免疫組織化学研究とDRG感覚ニューロンの構造にとって非常に重要です17,18,19,20,21,22,23。さらに、単一細胞RNAシーケンシングの結果、ヒト24とマウス25の両方でDRG感覚ニューロンの顕著な不均一性が明らかになったため、DRG組織の適切な凍結切片は、さまざまな生理学的および病理学的状態におけるさまざまなDRG細胞の機能的役割を調査するために重要です。
組織透明化技術は、DRG凍結切片の代替技術としてDRG26 の3D再構成を調査するために適用されていますが、組織透明化技術は時間と労力がかかります。それに比べて、DRGの凍結切片は迅速かつ比較的簡単に実行できるため、DRGおよび中枢神経系の他の領域の免疫組織化学および構造研究にとって重要な技術であることに変わりはありません。しかし、DRGや特定の脳領域などの組織のサンプルサイズが小さいため、スライドガラス上に高品質で無傷の平らなクライオスタット切片を得ることは、神経科学研究における課題であり、マウスDRGなどの小さなサイズの組織サンプルを凍結切片化するための最適なプロトコルを現時点では説明していません。
このプロトコルは、マウスDRGのクライオスタット切片作成のための簡単なステップバイステップの手法を提供し、その後のDRG研究のためにスライド上の高品質のDRG切片をできるだけ多く確実に取得します。この手法は、DRGサンプルの凍結切片作成に特化して設計されていますが、小さなサンプルサイズで他のさまざまな組織の凍結切片化にも使用できる可能性があります。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、マウスDRGのクライオスタット切片作成のための簡単なステップバイステップの手順を提供し、スライド上の高品質のDRG切片を確実に取得します。このプロトコルには 4 つの重要なステップがあります。まず、DRGサンプルとピンセットを乾燥させてから、DRGサンプルをベースOCTに置く必要があります。DRGサンプルを取り巻く液体は、その周囲に氷殻を形成し、その結果、DRG?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
何一つ。
Materials
| Avertin | Sigma-Aldrich | T48402-25G | Anesthetize animal |
| Epredia Cryotome Cryostat Cryocassettes, 25 mm dia. Crosshatched | Fisherbrand | 1910 | Hold the OCT section at the bottom |
| Ergo Tweezers | Fisherbrand | S95310 | Using the end of a tweezer to gently touch the bottom (6 o’clock) of the section so that it sticks to the platform surface to prevent the section from curving back in a roll |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 1255015 | To collect the DRG section |
| Marking pens | Fisherbrand | 133794 | Mark the orientation of base OCT |
| Scigen Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisherbrand | 23730571 | Embedding medium for frozen tissue specimens to ensure optimal cutting temperature (O.C.T.). |
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