Una procedura per la criosezione del ganglio della radice dorsale del topo
Summary
Di seguito viene presentato lo sviluppo per l’acquisizione costante di sezioni criostatiche gangliari a radice dorsale di alta qualità.
Abstract
Le sezioni del criostato del ganglio della radice dorsale (DRG) di topo di alta qualità sono fondamentali per una corretta colorazione immunochimica e studi di RNAscope nella ricerca di dolore infiammatorio e neuropatico, prurito e altre condizioni neurologiche periferiche. Tuttavia, rimane una sfida ottenere costantemente sezioni di criostato di alta qualità, intatte e piatte su vetrini a causa delle minuscole dimensioni del campione del tessuto DRG. Finora, non esiste un articolo che descriva un protocollo ottimale per la criosezione DRG. Questo protocollo presenta un metodo passo-passo per risolvere le difficoltà frequentemente incontrate associate alla criosezione DRG. L’articolo presentato spiega come rimuovere il liquido circostante dai campioni di tessuto DRG, posizionare le sezioni DRG sul vetrino rivolte verso lo stesso orientamento e appiattire le sezioni sul vetrino senza curvare verso l’alto. Sebbene questo protocollo sia stato sviluppato per la criosezione dei campioni DRG, può essere applicato per la criosezione di molti altri tessuti con un campione di piccole dimensioni.
Introduction
Il ganglio della radice dorsale (DRG) contiene i neuroni sensoriali primari, i macrofagi tissutali e le cellule satelliti che circondano i neuroni sensoriali primari 1,2,3,4. È una struttura anatomica chiave nell’elaborazione di segnali innocui e nocivi e svolge un ruolo critico nel dolore, nel prurito e in vari disturbi dei nervi periferici 5,6,7,8,9,10,11,12,13. Sebbene siano stati sviluppati diversi metodi per sezionare il tessuto DRG dal midollo spinale del topo14,15,16, la criosezione del tessuto DRG rimane impegnativa poiché il tessuto DRG è piuttosto piccolo e le sezioni del criostato dei campioni DRG tendono a curvarsi in rotoli, rendendo difficile il trasferimento corretto delle sezioni del criostato sui vetrini. Tuttavia, una corretta criosezione del tessuto DRG è fondamentale per gli studi di immunoistochimica e la struttura dei neuroni sensoriali DRG 17,18,19,20,21,22,23. Inoltre, poiché i risultati del sequenziamento dell’RNA a singola cellula hanno rivelato la notevole eterogeneità dei neuroni sensoriali DRG sia nell’uomo24 che nei topi25, una corretta criosezione del tessuto DRG è fondamentale per studiare il ruolo funzionale di diverse cellule DRG in varie condizioni fisiologiche e patologiche.
Sebbene la tecnica di purificazione dei tessuti sia stata applicata per studiare la ricostruzione 3D del DRG26 come tecnica alternativa di criosezione del DRG, la tecnica di purificazione dei tessuti richiede tempo e lavoro. In confronto, la criosezione del DRG è rapida e relativamente facile da eseguire, e quindi rimane una tecnica chiave per l’immunoistochimica e gli studi di struttura del DRG e di altre regioni del sistema nervoso centrale. Tuttavia, ottenere sezioni di criostato di alta qualità, intatte e piatte su vetrini rimane una sfida nella ricerca neuroscientifica a causa delle minuscole dimensioni del campione di tessuti, come il DRG e alcune regioni cerebrali, e non esiste un articolo che descriva il protocollo ottimale a questo punto per la criosezione di campioni di tessuto di piccole dimensioni, come i DRG di topo.
Questo protocollo fornisce una tecnica semplice e passo-passo per il sezionamento criostatico del DRG di topo per ottenere in modo affidabile il maggior numero di sezioni DRG di alta qualità sui vetrini per i successivi studi DRG. Sebbene sia stata progettata specificamente per la criosezione di campioni DRG, questa tecnica può potenzialmente essere utilizzata per la criosezione di vari altri tessuti con un campione di piccole dimensioni.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo fornisce una semplice procedura passo-passo per il sezionamento del criostato del DRG del topo per ottenere sezioni DRG di alta qualità su vetrini in modo affidabile. Ci sono quattro passaggi critici in questo protocollo. Innanzitutto, il campione DRG e le pinzette devono essere asciutti prima di mettere il campione DRG sull’OCT di base. Qualsiasi liquido che circonda il campione DRG formerà un guscio di ghiaccio attorno ad esso, con il risultato che le sezioni DRG si separano dall’OCT e si curvono. I…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nessuno.
Materials
| Avertin | Sigma-Aldrich | T48402-25G | Anesthetize animal |
| Epredia Cryotome Cryostat Cryocassettes, 25 mm dia. Crosshatched | Fisherbrand | 1910 | Hold the OCT section at the bottom |
| Ergo Tweezers | Fisherbrand | S95310 | Using the end of a tweezer to gently touch the bottom (6 o’clock) of the section so that it sticks to the platform surface to prevent the section from curving back in a roll |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 1255015 | To collect the DRG section |
| Marking pens | Fisherbrand | 133794 | Mark the orientation of base OCT |
| Scigen Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisherbrand | 23730571 | Embedding medium for frozen tissue specimens to ensure optimal cutting temperature (O.C.T.). |
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