הליך עבור עכבר שורש גבי גנגליון Cryosectioning
Summary
מוצג כאן הפיתוח לרכישה עקבית של קטעי קריוסטט גנגליון שורש גבי באיכות גבוהה.
Abstract
קטעי קריוסטט איכותיים של גנגליון שורש גבי של עכבר (DRG) חיוניים לצביעת אימונוכימיה נכונה ולמחקרי RNAscope בחקר כאב דלקתי ונוירופתי, גירוד, כמו גם מצבים נוירולוגיים היקפיים אחרים. עם זאת, זה עדיין אתגר להשיג באופן עקבי קטעי קריוסטט איכותיים, שלמים ושטוחים על שקופיות זכוכית בגלל גודל הדגימה הזעיר של רקמת DRG. עד כה, אין מאמר המתאר פרוטוקול אופטימלי עבור קריוסקציה DRG. פרוטוקול זה מציג שיטה שלב אחר שלב לפתרון הקשיים הנפוצים הקשורים להקפאת DRG. המאמר המוצג מסביר כיצד להסיר את הנוזל שמסביב מדגימות רקמת DRG, למקם את קטעי DRG על השקופית הפונים לאותו כיוון, ולשטח את החלקים במגלשת הזכוכית מבלי להתעקל כלפי מעלה. למרות פרוטוקול זה פותח עבור cryosectioning דגימות DRG, זה יכול להיות מיושם עבור cryosectioning של רקמות רבות אחרות עם גודל מדגם קטן.
Introduction
גנגליון השורש הגבי (DRG) מכיל את נוירוני החישה הראשוניים, את המקרופאגים הרקמתיים, ואת תאי הלוויין המקיפים את נוירוני החישה הראשוניים 1,2,3,4. זהו מבנה אנטומי מרכזי בעיבוד אותות מזיקים ומזיקים, וממלא תפקידים קריטיים בכאב, גירוד והפרעות עצביות היקפיות שונות 5,6,7,8,9,10,11,12,13. למרות שפותחו מספר שיטות לניתוח רקמת DRG מחוט השדרה של העכבר14,15,16, הקפאה של רקמת DRG נותרה מאתגרת מכיוון שרקמת DRG קטנה למדי, וקטעי קריוסטט של דגימות DRG נוטים להתעקם לגלילים, מה שמקשה על העברה נכונה של קטעי הקריוסטט לשקופיות זכוכית. עם זאת, קריוסקציה נכונה של רקמת DRG חיונית למחקרי אימונוהיסטוכימיה ולמבנה של נוירונים חושיים DRG 17,18,19,20,21,22,23. יתר על כן, מכיוון שתוצאות ריצוף RNA חד-תאי חשפו את ההטרוגניות יוצאת הדופן של נוירונים חושיים DRG הן בבני אדם24 והן בעכברים25, קריוסקציה נכונה של רקמת DRG היא קריטית לחקר התפקיד התפקודי של תאי DRG שונים במצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים.
למרות שטכניקת ניקוי הרקמות יושמה כדי לחקור את השחזור התלת-ממדי של DRG26 כטכניקה חלופית של הקפאת DRG, טכניקת ניקוי הרקמות גוזלת זמן ועבודה. לשם השוואה, קריוסקציה של DRG היא מהירה וקלה יחסית לביצוע, ולכן היא נותרה טכניקה מרכזית לאימונוהיסטוכימיה ומחקרי מבנה של DRG ואזורים אחרים של מערכת העצבים המרכזית. עם זאת, השגת קטעי קריוסטט איכותיים, שלמים ושטוחים על שקופיות זכוכית נותרה אתגר במחקר מדעי המוח בגלל גודל הדגימה הזעיר של רקמות, כמו DRG ואזורי מוח מסוימים, ואין מאמר המתאר את הפרוטוקול האופטימלי בשלב זה להקפאה של דגימות רקמות בגודל קטן, כגון DRG עכבר.
פרוטוקול זה מספק טכניקה קלה, שלב אחר שלב, לחתך קריוסטט של DRG העכבר כדי להשיג באופן אמין כמה שיותר קטעי DRG באיכות גבוהה בשקופיות עבור מחקרי DRG הבאים. בעוד שתוכננה במיוחד עבור דגימות DRG בהקפאה, טכניקה זו יכולה לשמש באופן פוטנציאלי להקפאת רקמות שונות אחרות עם גודל מדגם קטן.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מספק הליך קל שלב אחר שלב עבור חתך קריוסטט של DRG העכבר כדי להשיג קטעי DRG באיכות גבוהה על שקופיות בצורה אמינה. ישנם ארבעה שלבים קריטיים בפרוטוקול זה. ראשית, דגימת DRG והפינצטה חייבות להיות יבשות לפני העברת דגימת DRG לבסיס OCT. כל נוזל המקיף את דגימת DRG ייצור קליפת קרח סביבה, וכתוצאה מכך ק…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ללא.
Materials
| Avertin | Sigma-Aldrich | T48402-25G | Anesthetize animal |
| Epredia Cryotome Cryostat Cryocassettes, 25 mm dia. Crosshatched | Fisherbrand | 1910 | Hold the OCT section at the bottom |
| Ergo Tweezers | Fisherbrand | S95310 | Using the end of a tweezer to gently touch the bottom (6 o’clock) of the section so that it sticks to the platform surface to prevent the section from curving back in a roll |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 1255015 | To collect the DRG section |
| Marking pens | Fisherbrand | 133794 | Mark the orientation of base OCT |
| Scigen Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisherbrand | 23730571 | Embedding medium for frozen tissue specimens to ensure optimal cutting temperature (O.C.T.). |
References
- Guan, Z., et al. Injured sensory neuron-derived CSF1 induces microglial proliferation and DAP12-dependent pain. Nature Neuroscience. 19 (1), 94-101 (2016).
- Yu, X., et al. Dorsal root ganglion macrophages contribute to both the initiation and persistence of neuropathic pain. Nature Communications. 11 (1), 264 (2020).
- Costa, F. A. L., Moreira Neto, F. L. Satellite glial cells in sensory ganglia: its role in pain. Brazilian Journal of Anesthesiology. 65 (1), 73-81 (2015).
- Noguri, T., Hatakeyama, D., Kitahashi, T., Oka, K., Ito, E. Profile of dorsal root ganglion neurons: study of oxytocin expression. Molecular Brain. 15 (1), 44 (2022).
- Su, P. P., Zhang, L., He, L., Zhao, N., Guan, Z. The role of neuro-immune interactions in chronic pain: implications for clinical practice. Journal of Pain Research. 15, 2223-2248 (2022).
- Esposito, M. F., Malayil, R., Hanes, M., Deer, T. Unique characteristics of the dorsal root ganglion as a target for neuromodulation. Pain Medicine. 20, S23-S30 (2019).
- Chen, X. J., Sun, Y. G. Central circuit mechanisms of itch. Nature Communications. 11 (1), 3052 (2020).
- Guan, Z., Hellman, J., Schumacher, M. Contemporary views on inflammatory pain mechanisms: TRPing over innate and microglial pathways. F1000Research. , (2016).
- Boadas-Vaello, P., et al. Neuroplasticity of ascending and descending pathways after somatosensory system injury: reviewing knowledge to identify neuropathic pain therapeutic targets. Spinal Cord. 54 (5), 330-340 (2016).
- Guha, D., Shamji, M. F. The dorsal root ganglion in the pathogenesis of chronic neuropathic pain. Neurosurgery. 63, 118-126 (2016).
- Shorrock, H. K., et al. UBA1/GARS-dependent pathways drive sensory-motor connectivity defects in spinal muscular atrophy. Brain. 141 (10), 2878-2894 (2018).
- Sleigh, J. N., et al. Trk receptor signaling and sensory neuron fate are perturbed in human neuropathy caused by Gars mutations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (16), E3324-E3333 (2017).
- Rubio, M. A., Herrando-Grabulosa, M., Gaja-Capdevila, N., Vilches, J. J., Navarro, X. Characterization of somatosensory neuron involvement in the SOD1(G93A) mouse model. Scientific Reports. 12 (1), 7600 (2022).
- Sleigh, J. N., West, S. J., Schiavo, G. A video protocol for rapid dissection of mouse dorsal root ganglia from defined spinal levels. BMC Research Notes. 13 (1), 302 (2020).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, 82 (2016).
- Perner, C., Sokol, C. L. Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release. STAR Protocols. 2 (1), 100333 (2021).
- Haberberger, R. V., Barry, C., Matusica, D. Immortalized dorsal root ganglion neuron cell lines. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 184 (2020).
- Pokhilko, A., Nash, A., Cader, M. Z. Common transcriptional signatures of neuropathic pain. Pain. 161 (7), 1542-1554 (2020).
- Martin, S. L., Reid, A. J., Verkhratsky, A., Magnaghi, V., Faroni, A. Gene expression changes in dorsal root ganglia following peripheral nerve injury: roles in inflammation, cell death and nociception. Neural Regeneration Research. 14 (6), 939-947 (2019).
- Miller, R. J., Jung, H., Bhangoo, S. K., White, F. A. Cytokine and chemokine regulation of sensory neuron function. Handbook of Experimental Pharmacology. (194), 417-449 (2009).
- Neto, E., et al. Axonal outgrowth, neuropeptides expression and receptors tyrosine kinase phosphorylation in 3D organotypic cultures of adult dorsal root ganglia. PLoS One. 12 (7), e0181612 (2017).
- Nascimento, A. I., Mar, F. M., Sousa, M. M. The intriguing nature of dorsal root ganglion neurons: Linking structure with polarity and function. Progress in Neurobiolology. 168, 86-103 (2018).
- Middleton, S. J., Perez-Sanchez, J., Dawes, J. M. The structure of sensory afferent compartments in health and disease. Journal of Anatomy. 241 (5), 1186-1210 (2022).
- Nguyen, M. Q., von Buchholtz, L. J., Reker, A. N., Ryba, N. J., Davidson, S. Single-nucleus transcriptomic analysis of human dorsal root ganglion neurons. eLife. 10, e71752 (2021).
- Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).
- Hunt, M. A., et al. DRGquant: A new modular AI-based pipeline for 3D analysis of the DRG. Journal of Neuroscience Methods. 371, 109497 (2022).
