Ein Verfahren zur Kryosektion von Spinalganglien der Maus
Summary
Vorgestellt wird die Entwicklung zur konsequent hochwertigen Erfassung von Kryostatschnitten der Spinalganglien.
Abstract
Qualitativ hochwertige Kryostatschnitte des Spinalganglions (DRG) der Maus sind entscheidend für eine ordnungsgemäße immunchemische Färbung und RNAscope-Studien bei der Erforschung von entzündlichen und neuropathischen Schmerzen, Juckreiz sowie anderen peripheren neurologischen Erkrankungen. Aufgrund der winzigen Probengröße des DRG-Gewebes bleibt es jedoch eine Herausforderung, konsistent qualitativ hochwertige, intakte und flache Kryostatschnitte auf Glasobjektträgern zu erhalten. Bisher gibt es keinen Artikel, der ein optimales Protokoll für die DRG-Kryosektion beschreibt. Dieses Protokoll stellt eine Schritt-für-Schritt-Methode dar, um die häufig auftretenden Schwierigkeiten im Zusammenhang mit der DRG-Kryosektion zu lösen. Der vorgestellte Artikel erklärt, wie man die umgebende Flüssigkeit aus den DRG-Gewebeproben entfernt, die DRG-Schnitte auf dem Objektträger mit der gleichen Ausrichtung platziert und die Abschnitte auf dem Glasobjektträger abflacht, ohne sich nach oben zu krümmen. Obwohl dieses Protokoll für die Kryosektion der DRG-Proben entwickelt wurde, kann es auch für die Kryosektion vieler anderer Gewebe mit einer kleinen Probengröße angewendet werden.
Introduction
Das Spinalganglion (DRG) enthält die primären sensorischen Neuronen, die Gewebemakrophagen und die Satellitenzellen, die die primären sensorischen Neuronen umgeben 1,2,3,4. Es ist eine wichtige anatomische Struktur bei der Verarbeitung harmloser und schädlicher Signale und spielt eine entscheidende Rolle bei Schmerzen, Juckreiz und verschiedenen peripheren Nervenerkrankungen 5,6,7,8,9,10,11,12,13. Obwohl mehrere Methoden entwickelt wurden, um DRG-Gewebe aus dem Rückenmark der Maus zu präparieren14,15,16, bleibt die Kryosektion des DRG-Gewebes eine Herausforderung, da das DRG-Gewebe recht klein ist und Kryostatschnitte von DRG-Proben dazu neigen, sich zu Rollen zu krümmen, was es schwierig macht, die Kryostatabschnitte richtig auf Glasobjektträger zu übertragen. Die richtige Kryosektion des DRG-Gewebes ist jedoch entscheidend für immunhistochemische Untersuchungen und die Struktur der DRG-sensorischen Neuronen 17,18,19,20,21,22,23. Da die Ergebnisse der Einzelzell-RNA-Sequenzierung die bemerkenswerte Heterogenität der DRG-sensorischen Neuronen sowohl bei Menschen24 als auch bei Mäusen25 gezeigt haben, ist die richtige Kryosektion von DRG-Gewebe entscheidend für die Untersuchung der funktionellen Rolle verschiedener DRG-Zellen unter verschiedenen physiologischen und pathologischen Bedingungen.
Obwohl die Tissue-Clearing-Technik angewendet wurde, um die 3D-Rekonstruktion des DRG26 als alternative Technik der Kryosektion des DRG zu untersuchen, ist die Tissue-Clearing-Technik zeit- und arbeitsaufwändig. Im Vergleich dazu ist die Kryosektion des DRG schnell und relativ einfach durchzuführen und bleibt daher eine Schlüsseltechnik für Immunhistochemie und Strukturstudien des DRG und anderer Regionen des zentralen Nervensystems. Die Gewinnung qualitativ hochwertiger, intakter und flacher Kryostatschnitte auf Glasobjektträgern bleibt jedoch eine Herausforderung in der neurowissenschaftlichen Forschung, da die Probengröße von Geweben, wie dem DRG und bestimmten Hirnregionen, winzig ist, und es gibt derzeit keinen Artikel, der das optimale Protokoll für die Kryosektion kleiner Gewebeproben, wie z. B. Maus-DRGs, beschreibt.
Dieses Protokoll bietet eine einfache, Schritt-für-Schritt-Technik für die Kryostat-Sektion des Maus-DRG, um zuverlässig so viele hochwertige DRG-Schnitte auf den Objektträgern für nachfolgende DRG-Studien zu erhalten. Obwohl diese Technik speziell für die Kryosektion von DRG-Proben entwickelt wurde, kann sie möglicherweise auch für die Kryosektion verschiedener anderer Gewebe mit einer kleinen Probengröße verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll bietet ein einfaches Schritt-für-Schritt-Verfahren für die Kryostat-Sektion des Maus-DRG, um zuverlässig qualitativ hochwertige DRG-Schnitte auf Objektträgern zu erhalten. Dieses Protokoll besteht aus vier kritischen Schritten. Zuerst müssen die DRG-Probe und die Pinzette trocken sein, bevor die DRG-Probe auf das Basis-OCT gelegt wird. Jede Flüssigkeit, die die DRG-Probe umgibt, bildet eine Eishülle um sie herum, was dazu führt, dass sich DRG-Abschnitte vom OCT lösen und nach oben krümmen. Zwei…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nichts.
Materials
| Avertin | Sigma-Aldrich | T48402-25G | Anesthetize animal |
| Epredia Cryotome Cryostat Cryocassettes, 25 mm dia. Crosshatched | Fisherbrand | 1910 | Hold the OCT section at the bottom |
| Ergo Tweezers | Fisherbrand | S95310 | Using the end of a tweezer to gently touch the bottom (6 o’clock) of the section so that it sticks to the platform surface to prevent the section from curving back in a roll |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 1255015 | To collect the DRG section |
| Marking pens | Fisherbrand | 133794 | Mark the orientation of base OCT |
| Scigen Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisherbrand | 23730571 | Embedding medium for frozen tissue specimens to ensure optimal cutting temperature (O.C.T.). |
References
- Guan, Z., et al. Injured sensory neuron-derived CSF1 induces microglial proliferation and DAP12-dependent pain. Nature Neuroscience. 19 (1), 94-101 (2016).
- Yu, X., et al. Dorsal root ganglion macrophages contribute to both the initiation and persistence of neuropathic pain. Nature Communications. 11 (1), 264 (2020).
- Costa, F. A. L., Moreira Neto, F. L. Satellite glial cells in sensory ganglia: its role in pain. Brazilian Journal of Anesthesiology. 65 (1), 73-81 (2015).
- Noguri, T., Hatakeyama, D., Kitahashi, T., Oka, K., Ito, E. Profile of dorsal root ganglion neurons: study of oxytocin expression. Molecular Brain. 15 (1), 44 (2022).
- Su, P. P., Zhang, L., He, L., Zhao, N., Guan, Z. The role of neuro-immune interactions in chronic pain: implications for clinical practice. Journal of Pain Research. 15, 2223-2248 (2022).
- Esposito, M. F., Malayil, R., Hanes, M., Deer, T. Unique characteristics of the dorsal root ganglion as a target for neuromodulation. Pain Medicine. 20, S23-S30 (2019).
- Chen, X. J., Sun, Y. G. Central circuit mechanisms of itch. Nature Communications. 11 (1), 3052 (2020).
- Guan, Z., Hellman, J., Schumacher, M. Contemporary views on inflammatory pain mechanisms: TRPing over innate and microglial pathways. F1000Research. , (2016).
- Boadas-Vaello, P., et al. Neuroplasticity of ascending and descending pathways after somatosensory system injury: reviewing knowledge to identify neuropathic pain therapeutic targets. Spinal Cord. 54 (5), 330-340 (2016).
- Guha, D., Shamji, M. F. The dorsal root ganglion in the pathogenesis of chronic neuropathic pain. Neurosurgery. 63, 118-126 (2016).
- Shorrock, H. K., et al. UBA1/GARS-dependent pathways drive sensory-motor connectivity defects in spinal muscular atrophy. Brain. 141 (10), 2878-2894 (2018).
- Sleigh, J. N., et al. Trk receptor signaling and sensory neuron fate are perturbed in human neuropathy caused by Gars mutations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (16), E3324-E3333 (2017).
- Rubio, M. A., Herrando-Grabulosa, M., Gaja-Capdevila, N., Vilches, J. J., Navarro, X. Characterization of somatosensory neuron involvement in the SOD1(G93A) mouse model. Scientific Reports. 12 (1), 7600 (2022).
- Sleigh, J. N., West, S. J., Schiavo, G. A video protocol for rapid dissection of mouse dorsal root ganglia from defined spinal levels. BMC Research Notes. 13 (1), 302 (2020).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, 82 (2016).
- Perner, C., Sokol, C. L. Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release. STAR Protocols. 2 (1), 100333 (2021).
- Haberberger, R. V., Barry, C., Matusica, D. Immortalized dorsal root ganglion neuron cell lines. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 184 (2020).
- Pokhilko, A., Nash, A., Cader, M. Z. Common transcriptional signatures of neuropathic pain. Pain. 161 (7), 1542-1554 (2020).
- Martin, S. L., Reid, A. J., Verkhratsky, A., Magnaghi, V., Faroni, A. Gene expression changes in dorsal root ganglia following peripheral nerve injury: roles in inflammation, cell death and nociception. Neural Regeneration Research. 14 (6), 939-947 (2019).
- Miller, R. J., Jung, H., Bhangoo, S. K., White, F. A. Cytokine and chemokine regulation of sensory neuron function. Handbook of Experimental Pharmacology. (194), 417-449 (2009).
- Neto, E., et al. Axonal outgrowth, neuropeptides expression and receptors tyrosine kinase phosphorylation in 3D organotypic cultures of adult dorsal root ganglia. PLoS One. 12 (7), e0181612 (2017).
- Nascimento, A. I., Mar, F. M., Sousa, M. M. The intriguing nature of dorsal root ganglion neurons: Linking structure with polarity and function. Progress in Neurobiolology. 168, 86-103 (2018).
- Middleton, S. J., Perez-Sanchez, J., Dawes, J. M. The structure of sensory afferent compartments in health and disease. Journal of Anatomy. 241 (5), 1186-1210 (2022).
- Nguyen, M. Q., von Buchholtz, L. J., Reker, A. N., Ryba, N. J., Davidson, S. Single-nucleus transcriptomic analysis of human dorsal root ganglion neurons. eLife. 10, e71752 (2021).
- Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).
- Hunt, M. A., et al. DRGquant: A new modular AI-based pipeline for 3D analysis of the DRG. Journal of Neuroscience Methods. 371, 109497 (2022).
