예쁜꼬마선충 잔디 회피 분석을 위한 스마트폰 기반 이미징 방법
Summary
이 기사에서는 스마트폰 및 발광 다이오드(LED) 라이트 박스와 같이 쉽게 구할 수 있는 품목을 사용하여 예쁜꼬마선충의 잔디 회피 행동을 기록하는 간단하고 저렴한 방법을 설명합니다. 또한 비디오 파일을 계산에 더 적합한 형식으로 처리하는 Python 스크립트를 제공합니다.
Abstract
독성 또는 병원성 박테리아에 노출되면 선충 Caenorhabditis elegans 는 학습된 잔디 회피 행동을 나타내며, 이 경우 벌레는 점차 먹이원을 떠나 박테리아 잔디 밖에 남아 있는 것을 선호합니다. 이 분석은 유해한 조건에 적절하게 대응하기 위해 외부 또는 내부 신호를 감지하는 웜의 능력을 테스트하는 쉬운 방법입니다. 간단한 분석이지만 계수는 특히 여러 샘플의 경우 시간이 많이 걸리고 밤새 지속되는 분석 기간은 연구자에게 불편합니다. 장기간에 걸쳐 많은 플레이트를 이미징할 수 있는 이미징 시스템은 유용하지만 비용이 많이 듭니다. 여기에서는 예쁜꼬마선충의 잔디밭 회피를 기록하는 스마트폰 기반 이미징 방법을 설명합니다. 이 방법은 스마트폰과 발광 다이오드(LED) 라이트 박스만 있으면 투과된 광원 역할을 할 수 있습니다. 무료 타임랩스 카메라 애플리케이션을 사용하여 각 전화기는 잔디밭 밖에 있는 벌레를 수동으로 셀 수 있을 만큼 충분한 선명도와 대비로 최대 6개의 플레이트를 이미지화할 수 있습니다. 결과 동영상은 매 시간마다 10초 길이의 오디오 비디오 인터리브(AVI) 파일로 처리된 다음 각 단일 플레이트를 표시하도록 잘라서 계산하기 더 쉽게 만듭니다. 이 방법은 회피 결함을 검사하려는 사람들에게 비용 효율적인 방법이며 잠재적으로 다른 예쁜꼬마선충 분석으로 확장될 수 있습니다.
Introduction
예쁜꼬마선충 연구의 많은 장점 중 하나는 예쁜꼬마선충의 단순한 신경계가 유전적 및 세포 수준의 변화가 네트워크 기능과 행동 결과에 어떤 영향을 미치는지 연구할 수 있는 기회를 제공한다는 것입니다. 제한된 수의 뉴런을 가지고 있음에도 불구하고 예쁜꼬마선충은 다양한 복잡한 행동을 보입니다. 그 중 하나는 세균성 선충이 박테리아 잔디를 떠나 유해한 먹이원에 반응하는 잔디 회피입니다. 예쁜꼬마선충은 병원성 박테리아 1,2,3, 독소를 생성하거나 독소 1,4로 스파이크된 박테리아 잔디밭, 심지어 표적 유전자 녹다운이 벌레의 건강에 해로운 RNAi 발현 박테리아 4,5를 피합니다. 연구에 따르면 벌레는 병원성 박테리아에 의해 생성되는 대사 산물과 같은 외부 신호에 반응합니다 1,6, 또는 음식이 그들을 아프게 한다는 것을 나타내는 내부 신호 4,7. 이러한 신호는 미토겐 활성화 단백질 키나아제(MAPK) 경로 및 형질전환 성장 인자 베타(TGFβ) 경로와 같은 보존된 신호 전달 경로를 통해 처리되며 장과 신경계사이의 통신이 필요합니다 4,6,7,8.
분석은 간단하지만 학습된 행동은 여러 시간에 걸쳐, 종종 하룻밤 사이에 발생합니다. 떠날 수 없는 돌연변이가 있지만, 이 경우 한 시점에 회피를 득점하는 것만으로도 결함을 입증하기에 충분하지만 많은 돌연변이는 결국 떠나지만 나오는 속도가 느립니다. 이를 위해 웜의 움직임을 몇 시간마다 추적해야 하며, 이는 하룻밤 사이에 수행하기 어려울 수 있습니다. 계수 자체에도 시간이 걸리고 플레이트 사이에 지연 시간이 발생하므로 동시에 테스트할 수 있는 플레이트의 수가 제한됩니다. 이미징 설정을 사용하여 전체 분석 기간 동안 많은 플레이트를 동시에 기록하는 것은 매우 유용하지만 연구실의 자금 조달 상황에 따라 설정 비용이 엄청날 수 있습니다.
이 문제를 해결하기 위해 우리는 스마트폰을 사용하여 회피 분석을 기록하는 매우 간단한 방법을 고안했습니다. 각 전화기는 최대 6개의 분석 플레이트의 타임랩스 비디오를 녹화할 수 있습니다. 투과광을 제공하기 위해 온라인에서 쉽게 구입할 수 있는 발광 다이오드(LED) 라이트 박스를 사용합니다. 분석 플레이트는 속이 빈 직사각형 터널로 지지되는 높은 플랫폼에 배치되어 들어오는 빛에 초점을 맞춰 대비를 만듭니다. 또한 비디오를 각 시간별 시점의 10초 클립을 보여주는 AVI(오디오 비디오 인터리브) 파일로 변환하는 Python 스크립트를 제공합니다. 그런 다음 비디오를 개별 플레이트로 자르고 수동 계산에 사용할 별도의 파일에 저장합니다.
이 방법은 대부분의 사람들이 쉽게 사용할 수 있는 항목을 사용하여 사용하기 매우 쉬운 저렴한 절차를 제공합니다. 여기에서 우리는 인간 병원체 녹농균(PA14)에 대해 잘 확립된 잔디 회피 분석을 사용하는 방법을 설명하며, 그 프로토콜은 이전에 2,9. 마지막으로, 우리는 또한 다른 예쁜꼬마선충 행동 실험에 적용하려는 사람들을 위해 이미징 방법의 고려 사항과 한계를 검토합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
직접적인 관찰에 의존하지 않고 동물의 행동을 이미징하는 것은 편리할 뿐만 아니라 시각적 문서를 남길 수 있는 이점도 있습니다. 이를 통해 객관적인 제3자에 의한 블라인드 분석이 가능하거나 이미지 인식 기술을 사용한 자동 분석에도 사용할 수 있습니다. 장점에도 불구하고 일반적으로 제공되는 표준 장비는 비용이 많이 들기 때문에 한 번 구입하면 설정에 전념합니다.
…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
원고를 비판적으로 읽고 파이썬 코드를 테스트해 주신 이덕중씨에게 감사드립니다. 본 연구는 한국연구재단 2017R1A5A2015369 (K.-h.Y.) 및 2019R1C1C1008708 (K.-h.Y.)의 후원으로 진행되었다.
Materials
| 35 mm Petri dish | SPL | #10035 | |
| Bacto agar | BD | #214010 | |
| Bacto Peptone | BD | #211677 | |
| CaCl2 | DAEJUNG | 2507-1400 | |
| Cholesterol | BioBasic | CD0122 | |
| Dipotassium hydrogen phosphate (K2HPO4) | JUNSEI | 84120-0350 | |
| Glycerol | BioBasic | GB0232 | |
| King B Broth | MB cell | MB-K0827 | |
| LED light box multi-pad | Artmate | N/A | This is a USB powered, LED light pad for tracing and drawing purposes. Artmate is a Korean brand, but searching for "LED light box for tracing" in any search engine should yield numerous options from other brands. Overall dimension is around 9" x 12" (A4 size). For example, from amazon US: https://www.amazon.com/LITENERGY-Ultra-Thin-Adjustable-Streaming-Stenciling/dp/B07H7FLJX1/ref=sr_1_5?crid=YMYU0VYY226R&keywords= LED%2Blight%2Bbox&qid=1674183224&sprefix =led%2Blight%2Bbo%2Caps%2C270&sr=8-5&th=1 |
| MgSO4 | DAEJUNG | 5514-4400 | |
| Plastic paper sleeve (clear) | Smead | #85753 | Any clear plastic sheet with a bit of stiffness can be used as stage. For example, from Amazon US: https://www.amazon.com/Smead-Organized-Translucent-Project-85753/dp/B07HJTRCT7/ref=psdc_1069554_t3_B09J48GXQ 8 |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | JUNSEI | 84185-0350 | |
| Power strip | To accommodate 3 phones and one LED box, you need at least 4 outlets. | ||
| Smartphone | N/A | N/A | Minimum requirement: 12MP wide camera, 1080p HD video recording at 30fps |
| Sodium chloride(NaCl) | DAEJUNG | #7548-4100 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | YAKURI | #31727 |
References
- Pradel, E., et al. Detection and avoidance of a natural product from the pathogenic bacterium Serratia marcescens by Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (7), 2295-2300 (2007).
- Reddy, K. C., Hunter, R. C., Bhatla, N., Newman, D. K., Kim, D. H. Caenorhabditis elegans NPR-1-mediated behaviors are suppressed in the presence of mucoid bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (31), 12887-12892 (2011).
- Hao, Y., et al. Thioredoxin shapes the C. elegans sensory response to Pseudomonas produced nitric oxide. eLife. 7, 36833 (2018).
- Liu, Y., Samuel, B. S., Breen, P. C., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans pathways that surveil and defend mitochondria. Nature. 508 (7496), 406-410 (2014).
- Melo, J. A., Ruvkun, G. Inactivation of conserved C. elegans genes engages pathogen- and xenobiotic-associated defenses. Cell. 149 (2), 452-466 (2012).
- Meisel, J. D., Panda, O., Mahanti, P., Schroeder, F. C., Kim, D. H. Chemosensation of bacterial secondary metabolites modulates neuroendocrine signaling and behavior of C. elegans. Cell. 159 (2), 267-280 (2014).
- Singh, J., Aballay, A. Intestinal infection regulates behavior and learning via neuroendocrine signaling. eLife. 8, 50033 (2019).
- Lee, K., Mylonakis, E. An intestine-derived neuropeptide controls avoidance behavior in Caenorhabditis elegans. Cell Reports. 20 (10), 2501-2512 (2017).
- Singh, J., Aballay, A. Bacterial lawn avoidance and bacterial two choice preference assays in Caenorhabditis elegans. Bio-Protocol. 10 (10), 3623 (2020).
- Reddy, K. C., Andersen, E. C., Kruglyak, L., Kim, D. H. A polymorphism in npr-1 is a behavioral determinant of pathogen susceptibility in C. elegans. Science. 323 (5912), 382-384 (2009).
- de Bono, M., Bargmann, C. I. Natural variation in a neuropeptide Y receptor homolog modifies social behavior and food response in C. elegans. Cell. 94 (5), 679-689 (1998).
- Mathew, M. D., Mathew, N. D., Ebert, P. R. WormScan: a technique for high-throughput phenotypic analysis of Caenorhabditis elegans. PLoS One. 7 (3), 33483 (2012).
- Stroustrup, N., et al. The Caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).
- Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
- Marquina-Solis, J., et al. Peptidergic signaling controls the dynamics of sickness behavior in Caenorhabditis elegans. bioRxiv. , (2022).
- Churgin, M. A., Fang-Yen, C. An imaging system for monitoring C. elegans behavior and aging. Methods in Molecular Biology. 2468, 329-338 (2022).
- Barlow, I. L., et al. Megapixel camera arrays enable high-resolution animal tracking in multiwell plates. Communications Biology. 5 (1), 253 (2022).
- Kawazoe, Y., Yawo, H., Kimura, K. D. A simple optogenetic system for behavioral analysis of freely moving small animals. Neuroscience Research. 75 (1), 65-68 (2013).
