この原稿は、黄龍峰柑橘類病に関連する細菌(Candidatus Liberibacter asiaticus)またはその昆虫ベクター(Diaphorina citri、Kuwayama)に対する分子の有効性をスクリーニングするための新しい直接植物注入装置について説明しています。
植物における治療用化合物の機能をテストすることは、農業研究の重要な要素です。葉面および土壌浸しの方法は日常的ですが、さまざまな取り込みやテストされた分子の環境破壊などの欠点があります。木の幹注入は十分に確立されていますが、このためのほとんどの方法は高価な独自の機器を必要とします。黄龍峰の様々な治療法をスクリーニングするためには、師部限定細菌 Candidatus Liberibacter asiaticus(CLas)に感染した、または師部摂食CLas昆虫 ベクターDiaphorina citri Kuwayama(D. citri)に感染した小さな温室栽培の柑橘類の血管組織にこれらの化合物を送達するための簡単で低コストな方法が必要です。
これらのスクリーニング要件を満たすために、植物の幹に接続する直接植物注入(DPI)装置が設計されました。このデバイスは、ナイロンベースの3D印刷システムと簡単に入手できる補助コンポーネントを使用して作られています。この装置の化合物取り込み有効性を、蛍光マーカー5,6−カルボキシフルオレセイン−ジアセテートを用いて柑橘類植物において試験した。植物全体にわたるマーカーの均一な化合物分布が日常的に観察された。
さらに、この装置は、抗菌分子と殺虫分子を送達するために使用され、それぞれCLasおよび D.citri に対するそれらの効果を測定しました。アミノグリコシド系抗生物質ストレプトマイシンは、この装置を使用してCLasに感染した柑橘類植物に送達され、その結果、処理後2週間から4週間にCLas力価が低下しました。ネオニコチノイド系殺虫剤イミダクロプリドを D. citriが蔓延した柑橘類植物に送達すると、7日後にオオバコの死亡率が大幅に増加しました。.これらの結果は、このDPIデバイスが、試験のために植物に分子を送達するための有用なシステムを表し、研究およびスクリーニング目的を容易にすることを示唆している。
商業および景観環境での植物の管理では、植物の成長と健康を最適化するために化合物の使用が必要になることがよくあります。これらの分子がどのように送達されるかは、分子の種類、分子の機能、植物の種類、および実施されている管理システムによって異なります。葉面散布と土壌施用が最も簡単な送達戦略ですが、一部の分子の取り込みには制限があるため、直接送達が必要です。これらの分子の例は、植物内で全身的に移動するときに最もよく機能するが、単純な局所適用では効果的に送達できない治療分子です1。これは、柑橘類の緑化病とも呼ばれる黄龍峰(HLB)の場合です。HLBは師部限定菌である カンディダトゥス ・リベリバクター・アジアティカス(CLas)(植物外では培養できない)やその昆虫媒介動物である桑山ディア フォリナ (D. citri)2に関連する病気です。
推定治療分子が遺伝子産物である場合、それらはこれらの化合物を発現するトランスジェニック植物を作成することによって試験することができる。しかし、トランスジェニック植物の生産は時間と資源を大量に消費する可能性があり、遺伝子型に大きく依存し、遺伝子サイレンシングによって阻害される可能性があります3。さらに、これらのトランスジェニックが有望な結果を示したとしても、規制および一般の認識の制約により、商業的に受け入れられる可能性が低下します4,5。しかし、化合物の外因性適用は、安定または一過性発現のトランスジェニック植物の生産を必要としないため、生物学的および合成分子の試験を簡素化し、分子の効果を試験するための時間とリソースを削減します。外因性化合物の効果的かつ効率的な全身性植物送達のための方法は、多種多様な研究およびスクリーニング目的に使用することができる。
これらのアプリケーションの1つは、植物の血管系内の全身分子の動きの分析であり、蛍光、可視、または固有の化学同位体であるかどうかにかかわらず、追跡可能なマーカーを使用して行うことができます6,7,8,9。一般的に使用される蛍光マーカーの1つは5,6-カルボキシフルオレセインジアセテート(CFDA)であり、これは膜透過性の色素であり、細胞内エステラーゼによって5,6-カルボキシフルオレセイン(CF)に分解され、その後蛍光および膜不透過性になります10。CFDAは、師部輸送、シンクとソースの関係、および植物組織における血管系のパターン形成を監視するために広く使用されています11,12。
これらのマーカーに加えて、特定の化合物は植物の生理機能を直接変化させて生産性を高めたり、除草剤の場合は植物を殺したりする可能性があります。殺虫剤および抗菌化合物はどちらも、特にHLBの存在下で、植物の生産性を高める手段である。CLasを制御するために使用される抗菌分子の例は、ストレプトマイシンである。ストレプトマイシンは、もともと ストレプトマイセス・グリセウス から単離されたアミノグリコシド系抗生物質であり、タンパク質生合成の阻害を通じて細菌の増殖を阻害することが示されています13。殺虫剤に関しては、HLB研究の主な標的は、CLasを樹木から樹木に伝達する D.シトリです14。この目的のために、イミダクロプリドなどのネオニコチノイドは、害虫を防除するためのゴールドスタンダードであるため、一般的に利用されています15。これらの多様な用途はすべて、現在のプラント管理戦略の重要な側面であり、新規製品の開発は効率的なスクリーニングアッセイに依存しています。
木本植物への化合物の導入に使用される1つの方法は、幹への直接注入である。事前に掘削された注入サイトのニーズが異なるさまざまなシステムが設計されており、これらのシステムは圧力ベースの注入またはパッシブフローのいずれかを利用します16。圧力ベースのシステムは所与の化合物の迅速な導入を可能にするが、閉塞または塞栓された血管系を通して液体を強制することによって引き起こされる潜在的な物理的損傷は考慮される必要がある17。化合物の葉面散布またはびしょ濡れ施用は実施するのにそれほど時間がかからないが、直接植物注入は、空気または土壌への損失による目的の化合物の無駄を減少させ、また、外部環境への曝露を減少させることによって化合物が活性状態にある時間を長くすることができる18。これらの側面は両方とも、高価な試薬を保存し、研究環境で反復間の一貫性を確保するために重要です。
この研究では、目的の化合物が宿主植物にどのように影響するかを評価するために使用できる革新的な直接植物注入(DPI)デバイスの設計、構築、および使用について説明します。標準の3Dプリンターを使用して、デバイス自体とその構造に関連するいくつかのコンポーネントの両方を製造しました。この社内構築方法により、研究者は特定の実験ニーズに基づいてデバイスとデバイスコンポーネントを変更することができ、市販の植物注入デバイスへの依存を減らすことができます。デバイスのセットアップはシンプルで効率的であり、すべての補助コンポーネントはすぐに入手でき、安価です。このシステムはさまざまな植物種で使用するように設計されていますが、ここで紹介する例は鉢植えの柑橘類に関するものです。さらに、この研究は、このデバイスが致死性を引き起こすことなく、若い柑橘類植物に複数の種類の化合物を全身的に効率的に送達できることを示しています。テストされた化合物には、植物内の化合物分布を評価するために使用されたCFDA、およびDPI を介して 送達されたときにこれらの化合物の抗菌効果と殺虫効果が観察されることを確認するために使用されたストレプトマイシンとイミダクロプリドが含まれていました。
DPIデバイスが植物への外因性化合物送達のための実行可能な方法と見なされるためには、さまざまな組織タイプへの堅牢で一貫した化合物の取り込みに貢献する必要があります。CFDAを用いた実験では、葉の血管系と葉肉細胞の両方で、アクロペータル化合物と担子弁化合物の動きの両方を明確に示しました。さらに、おそらくこのDPIデバイスで使用される穴が化合物の取り込みに大量の表面積を提供するため、CFDAは、トランクインジェクションを使用した植物での以前の色素取り込み研究で見られたように、デバイスに隣接する血管系の小さなサブセットだけでなく、ステムのすべてのセクションに比較的等しい量で存在していました6.さらに、緑色蛍光タンパク質および花色素の送達をDPI装置を用いて試験したところ、CFDAに類似したこれらの化合物の分布が観察された(データ示さず)。これらのデータは、この装置が、サイズおよび分子構造が異なる様々な化合物を全身的に送達するために使用できることを示唆している。ただし、葉の発達段階に基づいて化合物の取り込みに違いがあり、若い発育葉は古い確立された葉よりも多くの化合物を取り込むことは注目に値します。これは、シンク組織とソース組織に存在する血管系特性の変化が原因である可能性があり、特定の実験用に最適化する必要があります。
DPIデバイスは、CFDA、GFP、およびフローラル染料の可視化に十分な化合物の取り込みを示し、ストレプトマイシンとイミダクロプリドの抗菌効果と殺虫効果をそれぞれ示すのに十分な量を占めました。これらの化合物は両方とも、2.0mLの単回処理の1週間後に標的生物の生存率に変化をもたらしました。これらのデータは、DPIデバイスが植物全体のアッセイで使用され、微生物および害虫の防除のための多種多様な化合物の生存率を試験できることを示唆しています。さらに、血管系との直接接触のために、この装置は根または表皮細胞によって効率的に取り込まれない化合物をテストする機会さえ提供するかもしれない。特に興味深いのはRNA干渉(RNAi)であり、これは宿主植物、病原体、または病原体ベクター内の遺伝子発現を調節するために使用できるためです。リンゴとブドウの幹に開けられた穴を通してヘアピンRNAを導入した以前の研究は、RNA分子が木部組織に限定されていることを示し、これらの分子が咀嚼および木部樹液摂食生物に対してのみ有効である可能性があることを示唆しています22。DPIデバイスが同様のドリル穴送達システムを使用することを考えると、この装置で送達されるヘアピンRNAも木部組織に限定される可能性があることは当然のことです。しかし、DPIデバイスからのストレプトマイシン処理後の師部制限CLasの力価の観察された低下は、この抗生物質が師部に存在していたことを強く示唆しています。したがって、DPIデバイスを使用して送達される化合物の血管分布は、それらのサイズおよび化学的性質に依存する可能性が高く、各分子は個別に評価されるべきである。
市販のDPIデバイスは多数市場に出回っていますが、ここで説明するデバイスは社内で製造でき、変更可能です。このように、使用されている植物種や実験計画に基づいてサイズの改良や変更を行うことができ、市販品に依存しません。さらに、この装置は植物に半永久的に取り付けられているため、複数の化合物注入で植物を傷つけることなく、特定の化合物の複数の処理を同時に実行できます。注意点として、正しくインストールされていないとデバイスが漏れる可能性があります。その結果、化合物はプラントに送達されるのではなく、環境に失われます。したがって、セットアップ中およびその後の最初の数日間は、漏れの兆候がないかデバイスを検査するように注意する必要があります。木に穴を開けることは潜在的に有害ですが、この方法は堅牢で一貫した化合物の取り込みを確実にするために選択されました。さらに、これらの実験では、DPIデバイスの取り付けによる植物の健康への悪影響は見られませんでした。ただし、特定の実験の過程で活力を失う可能性のある植物を置き換えるために、追加の植物を実験計画に含める必要があります。最後に、このデバイスはパッシブフローを使用して化合物を導入するため、異なる植物種または同じ種の発生段階にわたる取り込み速度を予測することは困難です。化合物の取り込み速度が制限要因である場合、これは実験を複雑にする可能性があります。最良の結果を得るには、植物が2.5 mLの化合物を完全に吸収するのに十分な時間が提供されるように実験を計画する必要がありますが、これには最大1週間かかる場合があります。結論として、このDPIデバイスは、CLasおよびそのベクターD.citriに対する抗菌性または殺虫性化合物のプランタ内活性を迅速に評価するための有効なツールであり、したがって、以前に提示された分離葉アッセイよりも全身の有効性および植物性能への影響に関するより多くの情報を提供する23。間違いなく、このシステムのさまざまなアプリケーションは、この調査で説明されている特定の用途をはるかに超えています。
The authors have nothing to disclose.
著者らは、この研究で使用された植物についてMant Aconに感謝したいと思います。資金は、米国農務省(USDA)のCRISプロジェクト8062-22410-007-000-DおよびUSDA NIFA助成金2020-70029-33176によって提供されました。
0.5 cm Diameter Steel Balls | Ballistic Products Inc. | #SHT #T | |
10 mL Luer-Lok Syringe | Becton Dickinson | 382903029952 | |
20 G 1 Syringe Needle | Becton Dickinson | 305175 | |
2 mL Screw Cap Tubes | USA Scientific | 1420-9710 | |
3/32nd Inch Black Oxide Drill Bit | Sears | 964077 | |
3D Printer | Markforged | F-PR-2027 | |
3D Printing Software | Markforged | F-SW-FDVX | |
3D Printing Software | Markforged | S-FW-OEVX | |
5(6)-CFDA (5-(and-6)-Carboxyfluorescein Diacetate) | Invitrogen | C195 | |
5/64th Inch Black Oxide Drill Bit | Sears | 964502 | |
96 Well qPCR Machine | Roche | 5815916001 | |
Centrifuge | Eppendorf | 22621408 | |
Fluorescent Microscope | Olympus | SP-BX43-BI | |
Fluorescent Microscope Filter | Chroma | 69401-ET | |
Gloss Clear Spray Paint | Rustoleum | 249117 | |
Grey Lego Baseplate | Lego | 11024 | |
Handheld Cordless Drill | Makita | 6349D | |
Homogenizer | Fisher Scientific | 15-340-163 | |
Imidacloprid 2F | Quali-Pro | 83080133 | |
Liquid Plastisol Medium Hardness | Fusion X Fishing Lures | XSOL-505 | |
Red Silicone 70 Shore A O-Ring | Grainger | Varies by Size | |
Non-Stick Cooking Spray | PAM | 64144030217 | |
NucleoSpin Plant II | Macherey-Nagel | 740770.5 | |
Parafilm | Bemis | HS234526A | |
Poly Viyl Acetate Based Glue | Elmers | E301 | |
qPCR Master Mix | Promega | A6001 | |
qPCR Primers | Integrated DNA Technologies | Varies by DNA sequence | |
Reverse Transcriptase | Promega | A5003 | |
Single Edge Razor Blade | Garvey | 40475 | |
Translucent Silicone RTV Rubber | Aero Marine Products | AM 115T | |
Transparent Silicone Tape | Maxwell | KE30S | |
Truncated Oncocin 112 | Genscript | Varies by peptide sequence | |
White 1 x 6 Lego Piece | Lego | 300901 | |
White Nylon | Markforged | F-MF-0003 |