جهاز التسريب المباشر لتوصيل الجزيئات في النباتات
Summary
تصف هذه المخطوطة جهازا جديدا للتسريب المباشر للنبات لفحص فعالية الجزيئات ضد البكتيريا (Candidatus Liberibacter asiaticus) أو ناقلها للحشرات (Diaphorina citri، Kuwayama) المرتبطة مجتمعة بمرض هوانغ لونغبينغ الحمضيات.
Abstract
يعد اختبار وظيفة المركبات العلاجية في النباتات مكونا مهما في البحوث الزراعية. تعتبر طرق النقع الورقي والتربة روتينية ولكن لها عيوب ، بما في ذلك الامتصاص المتغير والانهيار البيئي للجزيئات المختبرة. إن حقن جذع الأشجار راسخ ، لكن معظم الطرق لذلك تتطلب معدات باهظة الثمن وخاصة. لفحص العلاجات المختلفة ل Huanglongbing ، هناك حاجة إلى طريقة بسيطة ومنخفضة التكلفة لتوصيل هذه المركبات إلى الأنسجة الوعائية لأشجار الحمضيات الصغيرة المزروعة في البيوت الزجاجية المصابة ببكتيريا Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) المحدودة اللحاء أو المصابة بناقل الحشرات CLas الذي يتغذى على اللحاء Diaphorina citri Kuwayama (D. citri).
لتلبية متطلبات الفحص هذه ، تم تصميم جهاز التسريب المباشر للنبات (DPI) الذي يتصل بجذع المصنع. الجهاز مصنوع باستخدام نظام طباعة 3D قائم على النايلون ومكونات مساعدة يمكن الحصول عليها بسهولة. تم اختبار فعالية امتصاص المركب لهذا الجهاز في نباتات الحمضيات باستخدام علامة الفلورسنت 5،6-كربوكسي فلوريسئين-دياسيتات. لوحظ بشكل روتيني توزيع مركب موحد للعلامة في جميع أنحاء النباتات.
علاوة على ذلك ، تم استخدام هذا الجهاز لتوصيل جزيئات مضادة للميكروبات ومبيدات الحشرات لتحديد آثارها على CLas و D. citri على التوالي. تم تسليم الستربتومايسين المضاد الحيوي أمينوغليكوزيد إلى نباتات الحمضيات المصابة ب CLas باستخدام الجهاز ، مما أدى إلى انخفاض عيار CLas من 2 أسابيع إلى 4 أسابيع بعد العلاج. أدى توصيل مبيد الحشرات النيونيكوتينويد إيميداكلوبريد إلى نباتات الحمضيات الموبوءة ب D. citri إلى زيادة كبيرة في وفيات سيلليد بعد 7 أيام. تشير هذه النتائج إلى أن جهاز DPI هذا يمثل نظاما مفيدا لتوصيل الجزيئات إلى النباتات لاختبارها وتسهيل أغراض البحث والفحص.
Introduction
غالبا ما تتطلب إدارة النباتات في البيئات التجارية والمناظر الطبيعية استخدام المركبات الكيميائية لتحسين نمو النبات وصحته. تعتمد كيفية توصيل هذه الجزيئات على نوع الجزيء ووظيفة الجزيء ونوع النبات ونظام الإدارة المعمول به. التطبيقات الورقية والتربة هي أسهل استراتيجيات التسليم ، لكن القيود في امتصاص بعض الجزيئات تتطلب التسليم المباشر. مثال على هذه الجزيئات هو الجزيئات العلاجية التي تعمل بشكل أفضل عندما تتحرك بشكل منتظم داخل النبات ولكن لا يمكن توصيلها بشكل فعال عن طريق التطبيقات الموضعية البسيطة1. هذا هو الحال مع Huanglongbing (HLB) ، وتسمى أيضا مرض تخضير الحمضيات. HLB هو مرض مرتبط ببكتيريا محدودة اللحاء ، Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) ، والتي لا يمكن زراعتها خارج النبات ، أو ناقل الحشرات ، Diaphorina citri Kuwayama (D. citri) 2.
إذا كانت الجزيئات العلاجية المفترضة عبارة عن منتجات جينية ، فيمكن اختبارها عن طريق إنشاء نباتات محورة وراثيا تعبر عن هذه المركبات. ومع ذلك ، يمكن أن يكون إنتاج النباتات المعدلة وراثيا كثيف الوقت والموارد ، ويعتمد بشكل كبير على النمط الجيني ، ويمكن تثبيطه عن طريق إسكات الجينات3. بالإضافة إلى ذلك ، حتى لو أظهرت هذه الجينات المحورة نتائج واعدة ، فإن قيود الإدراك التنظيمي والعام تقلل من احتمال قبولها التجاري 4,5. ومع ذلك ، فإن التطبيق الخارجي للمركبات يبسط اختبار الجزيئات البيولوجية والاصطناعية لأنه لا يتطلب إنتاج نباتات محورة وراثيا مستقرة أو عابرة ، مما يقلل من الوقت والموارد لاختبار تأثيرات الجزيء. يمكن استخدام طريقة لتوصيل النباتات النظامية الفعالة والكفؤة للمركبات الخارجية لمجموعة واسعة من أغراض البحث والفرز.
أحد هذه التطبيقات هو تحليل حركة الجزيئات الجهازية داخل نظام الأوعية الدموية للنبات ، والذي يمكن إجراؤه باستخدام علامات قابلة للتتبع ، سواء كانت نظائر كيميائية فلورية أو مرئية أو فريدة من نوعها6،7،8،9. إحدى علامات الفلورسنت شائعة الاستخدام هي 5,6-carboxyfluorescein-diacetate (CFDA) ، وهي صبغة منفذة للغشاء تتحلل بواسطة الإسترات داخل الخلايا إلى 5,6-carboxyfluorescein (CF) ، وبالتالي تصبح فلورية وغير منفذةللغشاء 10. تم استخدام CFDA على نطاق واسع لمراقبة انتقال اللحاء ، وعلاقات الحوض والمصدر ، وأنماط الأوعية الدموية في الأنسجة النباتية11،12.
بالإضافة إلى هذه العلامات ، قد تغير بعض المركبات بشكل مباشر فسيولوجيا النبات لزيادة الإنتاجية أو قتل النبات في حالة مبيدات الأعشاب. كل من المبيدات الحشرية والمركبات المضادة للميكروبات هي وسيلة لزيادة إنتاجية النبات ، وخاصة في وجود HLB. مثال على جزيء مضاد للميكروبات يستخدم للتحكم في CLas هو الستربتومايسين. الستربتومايسين هو مضاد حيوي أمينوغليكوزيد تم عزله في الأصل من Streptomyces griseus وقد ثبت أنه يمنع نمو البكتيريا من خلال تثبيط التخليق الحيوي للبروتين13. من حيث المبيدات الحشرية ، فإن الهدف الرئيسي لأبحاث HLB هو D. citri ، الذي ينقل CLas من شجرة إلىشجرة 14. لهذا الغرض ، يشيع استخدام مبيدات النيونيكوتينويد ، مثل إيميداكلوبريد ، لأنها المعيار الذهبي لمكافحة الآفات الحشرية15. كل هذه الاستخدامات المتنوعة هي جوانب مهمة لاستراتيجيات إدارة المصنع الحالية ، ويعتمد تطوير منتجات جديدة على فحوصات الفحص الفعالة.
إحدى الطرق المستخدمة لإدخال المركبات في النباتات الخشبية هي الحقن المباشر في الجذع. تم تصميم مجموعة متنوعة من الأنظمة التي تختلف في احتياجاتها لمواقع الحقن مسبقة الحفر ، وتستخدم هذه الأنظمة إما الحقن القائم على الضغط أو التدفق السلبي16. على الرغم من أن الأنظمة القائمة على الضغط تسمح بالإدخال السريع لمركب معين ، إلا أنه يجب النظر في الضرر المادي المحتمل الناجم عن إجبار السائل من خلال الأوعية الدموية المسدودة أو الانصمام17. على الرغم من أن التطبيق الورقي أو الغمر للمركبات أقل استهلاكا للوقت في التنفيذ ، إلا أن الحقن المباشر للنبات يقلل من هدر المركب محل الاهتمام بسبب الخسائر في الهواء أو التربة ويمكن أيضا إطالة الوقت الذي تكون فيه المركبات في حالة نشطة عن طريق تقليل التعرض للبيئة الخارجية18. كلا هذين الجانبين مهمان للحفاظ على الكواشف باهظة الثمن وضمان الاتساق بين النسخ المتماثلة في إعدادات البحث.
تصف هذه الدراسة تصميم وبناء واستخدام جهاز مبتكر للتسريب المباشر للنبات (DPI) ، والذي يمكن استخدامه لتقييم كيفية تأثير المركبات ذات الأهمية على النبات المضيف. تم استخدام طابعة 3D قياسية لتصنيع كل من الجهاز نفسه والعديد من المكونات المرتبطة ببنائه. تسمح طريقة البناء الداخلية هذه للباحثين بتعديل الجهاز ومكونات الجهاز بناء على احتياجاتهم التجريبية المحددة وتقلل من الاعتماد على أجهزة حقن النباتات المتاحة تجاريا. إعداد الجهاز بسيط وفعال ، وجميع المكونات الإضافية متاحة بسهولة وغير مكلفة. على الرغم من أن النظام مصمم للاستخدام مع مجموعة متنوعة من الأنواع النباتية ، إلا أن الأمثلة المقدمة هنا تتعلق بنباتات الحمضيات المحفوظة بوعاء. بالإضافة إلى ذلك ، توضح هذه الدراسة أن هذا الجهاز قادر على توصيل أنواع متعددة من المركبات بكفاءة بشكل منهجي إلى نباتات الحمضيات الصغيرة دون التسبب في الفتك. وشملت المركبات التي تم اختبارها CFDA ، الذي تم استخدامه لتقييم توزيع المركبات في النبات ، والستربتومايسين والإيميداكلوبريد ، والتي تم استخدامها للتحقق من أن التأثيرات المضادة للميكروبات والمبيدات الحشرية لهذه المركبات قد لوحظت عند تسليمها عبر DPI.
Protocol
Representative Results
Discussion
لكي يعتبر جهاز DPI طريقة قابلة للتطبيق لتوصيل المركبات الخارجية إلى النباتات ، يجب أن يساهم في امتصاص مركب قوي ومتسق في مجموعة متنوعة من أنواع الأنسجة. أظهرت التجربة التي استخدمت CFDA بوضوح حركة كل من المركب acropetal و basipetal ، وكذلك في كل من نظام الأوعية الدموية وخلايا mesophyll من الورقة. بالإضافة إلى ذلك ، ومن المفترض أن يكون الثقب بالملل المستخدم في جهاز DPI هذا يوفر مساحة كبيرة من السطح لامتصاص المركب ، كان CFDA موجودا بكميات متساوية نسبيا في جميع أقسام الساق ، وليس فقط في مجموعة فرعية صغيرة من الأوعية الدموية المجاورة للجهاز ، كما شوهد في دراسات امتصاص الصبغة السابقة في النباتات باستخدام حقن الجذع6. بالإضافة إلى ذلك ، تم اختبار توصيل البروتين الفلوري الأخضر وصبغة الأزهار باستخدام جهاز DPI ، ولوحظ توزيع لهذه المركبات مشابه ل CFDA (البيانات غير معروضة). تشير هذه البيانات إلى أنه يمكن استخدام الجهاز لتقديم مجموعة متنوعة من المركبات التي تختلف في الحجم والتركيب الجزيئي بشكل منهجي. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى وجود اختلافات في امتصاص المركب بناء على مرحلة نمو الأوراق ، حيث تأخذ الأوراق النامية الأصغر سنا مركبا أكثر من الأوراق القديمة. قد يكون هذا بسبب التغيرات في خصائص الأوعية الدموية الموجودة في أنسجة الحوض مقابل المصدر ويجب تحسينها لتجربة معينة.
أظهر جهاز DPI امتصاصا كافيا للمركب لتصور CFDA و GFP وصبغة الأزهار ، كما أنه استغرق ما يكفي لإظهار التأثيرات المضادة للبكتيريا والمبيدات الحشرية للستربتومايسين والإيميداكلوبريد ، على التوالي. أدى كل من هذه المركبات إلى تغييرات في صلاحية الكائن المستهدف بعد أسبوع واحد من علاج واحد 2.0 مل. تشير هذه البيانات إلى أنه يمكن استخدام جهاز DPI في فحوصات النبات بالكامل لاختبار صلاحية مجموعة واسعة من المركبات لمكافحة الآفات الميكروبية والحشرية. علاوة على ذلك ، نظرا لاتصاله المباشر بنظام الأوعية الدموية ، قد يوفر هذا الجهاز فرصة لاختبار المركبات التي لا تمتصها الجذور أو خلايا البشرة بكفاءة. سيكون تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) ذا أهمية خاصة ، حيث يمكن استخدامه لتعديل التعبير الجيني داخل النبات المضيف أو مسبب المرض أو ناقل مسببات الأمراض. أظهرت الأبحاث السابقة التي أدخلت الحمض النووي الريبي دبوس الشعر من خلال ثقب محفور في جذع نباتات التفاح والعنب أن جزيئات الحمض النووي الريبي كانت مقتصرة على نسيج الخشب ، مما يشير إلى أن هذه الجزيئات قد تكون فعالة فقط ضد الكائنات الحية التي تتغذى على عصارة نسيجالخشب 22. وبالنظر إلى أن جهاز DPI يستخدم نظاما مماثلا لتوصيل الثقوب المحفورة، فمن المنطقي أن الحمض النووي الريبوزي (RNA) ذو الدبوس الشعري الذي يتم توصيله باستخدام هذا الجهاز قد يقتصر أيضا على نسيج الخشب. ومع ذلك ، فإن الانخفاض الملحوظ في عيار CLas المحدود باللحاء بعد علاج الستربتومايسين من جهاز DPI يشير بقوة إلى أن هذا المضاد الحيوي كان موجودا في اللحاء. لذلك ، من المحتمل أن يعتمد التوزيع الوعائي للمركبات التي يتم تسليمها باستخدام جهاز DPI على حجمها وكيمياءها ، ويجب تقييم كل جزيء على أساس فردي.
على الرغم من وجود عدد من أجهزة DPI المتاحة تجاريا في السوق ، إلا أن الجهاز الموصوف هنا يمكن تصنيعه داخليا وقابل للتعديل. وبهذه الطريقة ، يمكن إجراء تحسينات وتغييرات في الحجم بناء على الأنواع النباتية والتصميم التجريبي المستخدم ، ولا تعتمد على المنتجات التجارية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توصيل الجهاز بشكل شبه دائم بالنبات ، مما يعني أنه يمكن إجراء معالجات متعددة لمركب معين في وقت واحد دون الحاجة إلى إعادة إصابة النبات بحقن مركبة متعددة. في ملاحظة تحذيرية ، يمكن أن يتسرب الجهاز إذا لم يتم تثبيته بشكل صحيح. نتيجة لذلك ، يتم فقدان المركب في البيئة بدلا من تسليمه إلى المصنع. لذلك ، يجب توخي الحذر لفحص الجهاز بحثا عن أي علامات تسرب أثناء الإعداد والأيام القليلة الأولى بعد ذلك. على الرغم من أن حفر حفرة في الشجرة قد يكون ضارا ، فقد تم اختيار هذه الطريقة لضمان امتصاص مركب قوي ومتسق. بالإضافة إلى ذلك ، لم يلاحظ أي آثار ضارة على صحة النبات من ربط جهاز DPI في هذه التجارب. ومع ذلك ، يجب تضمين نباتات إضافية في التصميم التجريبي لتحل محل تلك التي قد تفقد قوتها طوال فترة تجربة معينة. أخيرا ، نظرا لأن هذا الجهاز يستخدم التدفق السلبي لإدخال المركبات ، فقد يكون من الصعب التنبؤ بمعدل الامتصاص عبر أنواع نباتية مختلفة أو مراحل نمو نفس النوع. قد يؤدي هذا إلى تعقيد التجارب إذا كانت سرعة امتصاص المركب عاملا مقيدا. للحصول على أفضل النتائج ، يجب التخطيط للتجارب بحيث يتم توفير وقت كاف للمصنع لامتصاص 2.5 مل من المركب بالكامل ، الأمر الذي قد يستغرق ما يصل إلى أسبوع واحد. في الختام ، يعد جهاز DPI هذا أداة فعالة للتقييم السريع لنشاط المركبات المضادة للميكروبات أو المبيدات الحشرية في النبات ضد CLas وناقله ، D. citri ، وبالتالي توفير مزيد من المعلومات حول الفعالية النظامية والتأثير على أداء النبات من مقايسة الأوراق المنفصلة المقدمة سابقا23. مما لا شك فيه أن تنوع التطبيقات لهذا النظام يتجاوز الاستخدامات المحددة الموضحة في هذه الدراسة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يشكروا Mant Acon على النباتات المستخدمة في هذه الدراسة. تم توفير التمويل من قبل مشروع CRIS التابع لوزارة الزراعة الأمريكية (USDA) 8062-22410-007-000-D ومنحة وزارة الزراعة الأمريكية NIFA 2020-70029-33176.
Materials
| 0.5 cm Diameter Steel Balls | Ballistic Products Inc. | #SHT #T | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe | Becton Dickinson | 382903029952 | |
| 20 G 1 Syringe Needle | Becton Dickinson | 305175 | |
| 2 mL Screw Cap Tubes | USA Scientific | 1420-9710 | |
| 3/32nd Inch Black Oxide Drill Bit | Sears | 964077 | |
| 3D Printer | Markforged | F-PR-2027 | |
| 3D Printing Software | Markforged | F-SW-FDVX | |
| 3D Printing Software | Markforged | S-FW-OEVX | |
| 5(6)-CFDA (5-(and-6)-Carboxyfluorescein Diacetate) | Invitrogen | C195 | |
| 5/64th Inch Black Oxide Drill Bit | Sears | 964502 | |
| 96 Well qPCR Machine | Roche | 5815916001 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 22621408 | |
| Fluorescent Microscope | Olympus | SP-BX43-BI | |
| Fluorescent Microscope Filter | Chroma | 69401-ET | |
| Gloss Clear Spray Paint | Rustoleum | 249117 | |
| Grey Lego Baseplate | Lego | 11024 | |
| Handheld Cordless Drill | Makita | 6349D | |
| Homogenizer | Fisher Scientific | 15-340-163 | |
| Imidacloprid 2F | Quali-Pro | 83080133 | |
| Liquid Plastisol Medium Hardness | Fusion X Fishing Lures | XSOL-505 | |
| Red Silicone 70 Shore A O-Ring | Grainger | Varies by Size | |
| Non-Stick Cooking Spray | PAM | 64144030217 | |
| NucleoSpin Plant II | Macherey-Nagel | 740770.5 | |
| Parafilm | Bemis | HS234526A | |
| Poly Viyl Acetate Based Glue | Elmers | E301 | |
| qPCR Master Mix | Promega | A6001 | |
| qPCR Primers | Integrated DNA Technologies | Varies by DNA sequence | |
| Reverse Transcriptase | Promega | A5003 | |
| Single Edge Razor Blade | Garvey | 40475 | |
| Translucent Silicone RTV Rubber | Aero Marine Products | AM 115T | |
| Transparent Silicone Tape | Maxwell | KE30S | |
| Truncated Oncocin 112 | Genscript | Varies by peptide sequence | |
| White 1 x 6 Lego Piece | Lego | 300901 | |
| White Nylon | Markforged | F-MF-0003 |
References
- Hu, J., Wang, N. Evaluation of the spatiotemporal dynamics of oxytetracycline and its control effect against citrus huanglongbing via trunk injection. Phytopathology. 106 (12), 1495-1503 (2016).
- Bendix, C., Lewis, J. D. The enemy within: Phloem-limited pathogens. Molecular Plant Pathology. 19 (1), 238-254 (2018).
- Keshavareddy, G., Kumar, A. R. V., Ramu, V. S. Methods of plant transformation- A review. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 7 (7), 2656-2668 (2018).
- Qaim, M. Role of new plant breeding technologies for food security and sustainable agricultural development. Applied Economics Perspectives and Policy. 42 (2), 129-150 (2020).
- Siegrist, M., Hartmann, C. Consumer acceptance of novel food technologies. Nature Food. 1 (6), 343-350 (2020).
- Larson, D. W., Doubt, J., Matthes-Sears, U. Radially sectored hydraulic pathways in the xylem of Thuja occidentalis as revealed by the use of dyes. International Journal of Plant Sciences. 155 (5), 569-582 (1994).
- Mehdi, R., et al. Symplasmic phloem unloading and radial post-phloem transport via vascular rays in tuberous roots of Manihot esculenta. Journal of Experimental Botany. 70 (20), 5559-5573 (2019).
- Miller, G. S., Parente, R. M., Santra, S., Gesquiere, A. J. Tracking of fluorescent antibiotic conjugate in planta utilizing fluorescence lifetime imaging. Planta. 253 (2), (2021).
- Treydte, K., Lehmann, M. M., Wyczesany, T., Pfautsch, S. Radial and axial water movement in adult trees recorded by stable isotope tracing. Tree Physiology. 41 (12), 2248-2261 (2021).
- Nie, P. Liping Hu, Haiyan Zhang, Jixiang Zhang, Zhenxian Zhang, Lingyun Zhang, The predominance of the apoplasmic phloem-unloading pathway is interrupted by a symplasmic pathway during Chinese jujube fruit development. Plant and Cell Physiology. 51 (6), 1007-1018 (2010).
- Jiang, M., Deng, Z., White, R. G., Jin, T., Liang, D. Shootward movement of CFDA tracer loaded in the bottom sink tissues of Arabidopsis. Journal of Visualized Experiments. (147), e59606 (2019).
- Liu, H., Si, C., Shi, C., Wang, S. Zhe Sun, Yanxi Shi, from apoplasmic to symplasmic phloem unloading during storage roots formation and bulking of sweet potato. Crop Science. 59 (2), 675-683 (2019).
- Erdos, T., Ullmann, A. Effect of streptomycin on the incorporation of amino-acids labeled with carbon-14 into ribonucleic acid and protein in a cell-free system of a Mycobacterium. Nature. 183 (4661), 618-619 (1959).
- Bové, J. M. Huanglongbing: A destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus. Journal of Plant Pathology. 88 (1), 7-37 (2006).
- Motaung, T. E. Chloronicotinyl insecticide imidacloprid: Agricultural relevance, pitfalls and emerging opportunities. Crop Protection. 131, 105097 (2020).
- Berger, C., Laurent, F. Trunk injection of plant protection products to protect trees from pests and diseases. Crop Protection. 124, 104831 (2019).
- Archer, L., Crane, J. H., Albrecht, U. Trunk injection as a tool to deliver plant protection materials-An overview of basic principles and practical considerations. Horticulturae. 6 (6), 552 (2022).
- Wise, J. C., et al. Trunk injection: A discriminating delivering system for horticulture crop IPM. Entomology, Ornithology & Herpetology: Current Research. 03 (2), (2014).
- Ammar, E. D., George, J., Sturgeon, K., Stelinski, L. L., Shatters, R. G. Asian citrus psyllid adults inoculate Huanglongbing bacterium more efficiently than nymphs when this bacterium is acquired by early instar nymphs. Scientific Reports. 10 (1), 18244 (2020).
- Stover, E., Mccollum, G., Ramos, J., Shatters, R. G. Growth, health and Liberibacter asiaticus titer in diverse citrus scions on mandarin versus trifoliate hybrid rootstocks in a field planting with severe Huanglongbing. Proceedings of the Florida State Horticultural Society. 127, 53-59 (2014).
- Akaike, H. A new look at the statistical model identification. IEEE Transactions on Automatic Control. 19 (6), 716-723 (1974).
- Dalakouras, A., Jarausch, W., Buchholz, G., Bassler, A., Braun, M., Manthey, T., Krczal, G., Wassenegger, M. Delivery of hairpin RNAs and small RNAs into woods and herbaceous plants by trunk injection and petiole absorption. Frontiers in Plant Science. 9, 1253 (2018).
- Ammar, E. D., Walter, A. J., Hall, D. G. New excised-leaf assay method to test inoculativity of Asian citrus psyllid (Hemiptera: Psyllidae) with Candidatus Liberibacter asiaticus associated with citrus Huanglongbing disease. Journal of Economic Entomology. 106 (1), 25-35 (2013).
