Memelilerde Mitokondriyal Fonksiyonu Ölçmek için Oksijenden Bağımsız Tahliller

1. Kompleks I, dihidroorotat dehidrogenaz (DHODH) ve kompleks V aktivitelerinin aktivitesini ölçmek için proliferasyon testleri Proliferasyon tahlilleri için hücrelerin tohumlanmasıNOT: Bu protokol, ATCC’den ticari olarak satın alınan insan osteosarkom hücre hattı 143B’yi kullanır. Bu hücre hattı, onaylı Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi (IBC) protokolümüzün yönergeleri altında kullanılmıştır.Plakaları doku kültürü inkübatöründen çıkarın. Ortamı plakalardan aspire edin ve kalan ortamları çıkarmak için 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın. PBS’yi aspire edin ve hücreleri plakanın altından kaldırmak için çanağı% 0.05 -% 0.25 tripsin ile örtün. Tripsinin hücreleri plakadan serbest bırakması için 3-5 dakika bekleyin ve daha sonra tripsini% 10 fetal sığır serumu (FBS) içeren istenen büyüme ortamının 10 mL’si ile söndürün. Hücreleri konik bir tüpte toplayın ve hücreleri pelet etmek için 5 dakika boyunca 1.000 × g’da santrifüjleyin. Peletleri rahatsız etmeden ortamı tüpten aspire edin. Pelet tam ortamla tekrar askıya alın. Hücreleri sayın ve 6 delikli bir plakada 10.000 ila 25.000 hücre arasında tohum atmak için gereken hacmi ölçün.NOT: Her hücre satırının, tohumlanacak hücre sayısı için optimize edilmesi gerekir. Elde edilen ideal birleşim, deneyin başlangıcında ~ ve deneyin sonunda ~’dir. Hücreleri 6 delikli bir plakaya pipetleyin ve kuyucuklara 2 mL tam ortam ekleyin. Deneysel ortam koşullarına geçmeden önce 24 saat bekletin.NOT: Tohum, koşul başına en az üç kopya ve tedavi edilmemiş kontrol koşulunu, inhibitörle tedavi edilmiş kontrol koşulunu, tedavi edilmemiş deneysel durumu ve inhibitörle muamele edilmiş deneysel durumu test etmek için yeterli kuyucuk içerir. Proliferasyon yoluyla karmaşık V aktivitesini değerlendirmek için orta değişimNOT: Galaktozlu bir ortamda çoğalan hücreler, ATP sentezi 9,10 için kompleks V aktivitesine bağlıdır. Glikolizden net iki ATP veren glikozun aksine, galaktoz hiç vermez ve hücreleri ATP sentezi için kompleks V’ye bağımlı olmaya zorlar (Şekil 1). Kompleks V inhibitörü oligomisin kontrol olarak kullanılır.10 mM glikoz içeren ortam yapın (bkz. Tablo 1). 10 mM galaktoz içeren ortam yapın (bkz. Tablo 1). Her bir kuyucuktaki ortamı glikoz içeren DMEM veya galaktoz içeren DMEM olarak değiştirin. İlgili kuyucuklara 5 μM oligomisin (kompleks V inhibitörü) ve tedavi edilmemiş kuyucuklara aynı miktarda DMSO ekleyin. Oligomisin stoğu DMSO’da askıya alınmış 10 mM’dir. Plakayı 2 gün boyunca doku kültürü inkübatörüne geri koyun. Karmaşık I aktivitesini proliferasyon yoluyla değerlendirmek için orta değişimNOT: Piruvat içermeyen bir ortamda çoğalan hücreler, kompleks I aktivitesine daha fazla bağımlıdır11,12. Piruvat olmadan, kültürlenmiş hücreler NADH reoksidasyonunun çoğunluğunu NAD + ‘ya geri döndürmek için kompleks I’e ihtiyaç duyarlar (Şekil 2). Kompleks I inhibitörü rotenon bir kontrol olarak kullanılır.% 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş piruvat içermeyen DMEM ortamı yapın. 1 M’lik bir piruvat çözeltisi yapın (bkz. Tablo 1). Her bir kuyucuktaki ortamı piruvat içermeyen ortam veya piruvat içeren ortam olarak değiştirin. Tedavi edilen kuyucuklara 2 μM rotenon (kompleks I inhibitörü) ve tedavi edilmemiş kuyucuklara aynı miktarda DMSO ekleyin. Rotenon stoğu DMSO’da 25 mM’dir. Plakayı 2 gün boyunca doku kültürü inkübatörüne geri koyun. DHODH aktivitesini proliferasyon ile değerlendirmek için orta değişimNOT: İdrar içermeyen bir ortamda çoğalan hücreler dihidroorotat dehidrogenaz (DHODH) aktivitesi gerektirir11,12,13. Eksojen idrarın yokluğunda, kültürlenmiş hücreler de novo yol boyunca pirimidinler sentezler. DHODH inhibitörü brequinar kontrol olarak kullanılır.İdrar içermeyen DMEM’i% 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin ile takviye edin. 10 mg / mL idrar stok çözeltisi yapın ve ardından 100 μg / mL idrar ortamı hazırlayın ( bkz. Tablo 1). Her bir kuyucuktaki ortamı idrarsız ortama veya idrar içeren ortama değiştirin. Tedavi edilen kuyucuklara 5 μM brequinar (DHODH inhibitörü) ve tedavi edilmemiş kuyucuklara aynı miktarda DMSO ekleyin. Brequinar stoğu DMSO’da 10 mM’dir. Plakayı 2 gün boyunca doku kültürü inkübatörüne geri koyun. Proliferasyon tahlilleri için hücrelerin sayılmasıTüm deneyler için, ortamı her 2 günde bir doldurun. Ortamın rengi sarı olursa, ortam değişikliklerinin sıklığını artırın. Hücrelerin 7 güne kadar çoğalmasına izin verin ve kuyucuklardan herhangi biri aşırı büyümüş görünmeye başlarsa deneyi durdurun. Kuyular, birleşme% 80’i aştığında aşırı büyümüş olarak kabul edilir. Ortamı aspire edin, 1x PBS ile yıkayın ve kuyunun dibini% 0.25 tripsin ile örtün (6 delikli bir tabak için 500 μL). Hücreler çanaktan çıkana kadar 5 dakika bekleyin. Bunu mikroskop altında kontrol edin. Tripsini% 10 FBS içeren 1 mL tam DMEM ile söndürün. Hücre kümelerini parçalamak için pipeti yukarı ve aşağı çekin. Her birini 10 mL izoton tamponu (kuyucuk başına bir bardak) ile doldurarak Coulter sayaç kaplarını hazırlayın. Bir hücre sayacındaki hücreleri sayın ve verileri kaydedin. Okuma mililitre başına hücre (hücre/mL) ise, kuyu başına toplam hücre sayısını elde etmek için kaydedilen değeri 1,5 ile çarpın.NOT: Hemositometre gibi diğer hücre sayma yöntemleri, laboratuvarda Coulter sayacı yoksa yeterli olacaktır. 2. DHODH aktivitesini ölçmek için 13C 4-Aspartat kararlı izotop izleme ve LC-MS analizi 13C4-yapışkan hücrelerde 4-aspartat kararlı izotop izlemeNOT: DHODH aktivitesi, 13 C 4-aspartatın 13C 3-UMP’ye dahil edilmesi ölçülerek doğrudan izlenebilir. Brequinar, DHODH aktivitesi için bir kontrol olarak kullanılır (Şekil 3). Ortaya çıkan 13C3-UMP seviyeleri, DHODH aktivitesinin bir ölçüsüdür.Ertesi gün% 75 birleşme elde etmek için 6 kuyucuklu bir kapta 250.000 ila 500.000 hücre arasında tohumlayın. 250 mM 13 C 4-aspartat ve 10 mM 13C4-aspartat ortamından oluşan bir stok çözeltisi hazırlayın (bakınız Tablo 1). Her bir kuyucuktaki ortamı 10 mM 13C 4-aspartat içeren ortama değiştirin. İlgilenilen hücreleri etiketlemek için sabit bir durum elde etmek için uygun sayıda saat boyunca inkübe edin.NOT: Kararlı durum, yüzde etiketli metabolit platolarının zaman içinde14 olduğu zaman dilimi olarak tanımlanır. 143B osteosarkom hücreleri için, 13C 4-aspartat 8 saat boyunca kararlı bir duruma ulaşır. Bu zaman dilimini, deneyden önce, ilgilenilen kararlı izotop ile bir zaman kursu deneyi yaparak belirlemek en iyi uygulamadır. Yapışkan hücrelerden metabolit izolasyonuBaşlamadan önce, bir kova kuru buz hazırlayın ve HPLC sınıfı suda% 80 HPLC sınıfı MeOH hazırlayın. Bu tamponu gece boyunca -80 ° C’lik bir dondurucuda soğutun veya doğrudan kuru buzun üzerine yerleştirin. İnkübatörden bir seferde bir plaka çıkararak, ortamı kuyucuklardan aspire edin ve 1x PBS ile 2x yıkayın. Bir sonraki adıma geçmeden önce kalan tüm PBS’yi kuyucuklardan çıkarın.NOT: Aspirasyon sırasında plakayı ve pipeti kabın duvarına yaslayarak yapışkan hücrelerin bozulmasını önleyin. Plakayı kuru buz üzerine yerleştirin ve hemen her bir kuyucuğa% 20 LCMS dereceli suya 800 μL% 80 LCMS sınıfı MeOH ekleyin. Hücre lizizini kolaylaştırmak için plakayı -80 ° C’lik bir dondurucuda en az 15 dakika inkübe edin.NOT: Bu noktada, bir sonraki plaka inkübatörden çıkarılabilir ve 2.2.1-2.2.4 adımları tekrarlanabilir. Tüm plakalar -80 ° C dondurucuda inkübe edilene kadar buna devam edin. Dondurucudan bir seferde bir plaka çıkararak, bir hücre kaldırıcı kullanarak kuru buz üzerinde her bir kuyucuğu kazıyın ve lizatı 1,5 mL’lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Bir sonraki adıma kadar tüpü kuru buz üzerinde tutun. Tüm tüpleri 4 ° C’de 10 dakika boyunca vorteks edin ve daha sonra maksimum hızda (en az 17.000 × g) 10 dakika boyunca 4 ° C’de santrifüj yapın. Süpernatantı 1,5 mL’lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve yaklaşık 6 saat boyunca veya numuneler buharlaşana kadar yüksek vakum ayarında -105 ° C soğuk tuzak ile donatılmış 4 ° C’lik bir vakum yoğunlaştırıcısında kurutun. Lizat kuruduktan sonra, metabolit peletlerini kütle spektrometrisi (LCMS) ile eşleştirilmiş sıvı kromatografisine hazırlamaya hazır olana kadar -80 ° C’de saklayın. Polar metabolitlerin sıvı kromatografisi-kütle spektrometresi (LC-MS) ölçümüNOT: Aspartatın, de novo pirimidin biyosentezindeki ara ürünlerin ve UMP’nin tespitine izin veren herhangi bir kromatografik ve kütle spektrometresi iş akışı yeterli olacaktır14.Kurutulmuş peletlere ve vortekse 4 °C’de 10 dakika boyunca 100 μL HPLC sınıfı su ekleyerek buz üzerinde LCMS için numuneleri hazırlayın. Numuneleri 4 °C’de maksimum hızda (en az 17.000 × g) 10 dakika boyunca santrifüj edin ve her LC-MS şişesine 25 μL hareket ettirin. LC-MS sistemine 2 μL lizat enjekte edin. Yaygın olarak kullanılan bir metodoloji aşağıda verilmiştir:LC-MS sınıfı suda çözünmüş 20 mM amonyum karbonat (LC-MS sınıfı) ve% 0.1 amonyum hidroksit (LC-MS Sınıfı) içeren mobil faz A’yı hazırlayın. Mobil faz B olarak 0 asetonitril (LC-MS Sınıfı) seçin. Kromatografi için, hidrofilik bileşikler için 2,1 mm x 20 mm koruma sütunu ile donatılmış 5 μm, 150 mm x 2,1 mm analitik bir sütun seçin ( Malzeme Tablosuna bakınız). Kolonlu fırını 25 °C’ye ayarlayın. Aşağıdaki sıvı kromatografisi ayarlarını kullanın: 0,15 mL/dak sabit akış hızı; 20 dakika boyunca ila Mobil Faz B arasında doğrusal bir gradyan, ardından 0,5 dakika boyunca ila Mobil Faz B’de doğrusal bir gradyan ve ardından 7,5 dakika boyunca Mobil Faz B’de bir bekletme takip eder. Aşağıdaki kütle spektrometre ayarlarını seçin: m/z 70 Da ile 1.000 Da arasında tam tarama; 70.000’lik bir karar; 1 × 106 AGC hedefi; ve maksimum 20 ms enjeksiyon süresi. Kaynağı polarite anahtarlama modunda çalıştırın. Püskürtme voltajını 3,0 kV’a, ısıtılmış kılcal damarı 275 °C’ye, HESI probunu 350 °C’ye, kılıf gazı akışını 40 üniteye, yardımcı gaz akışını 15 üniteye ve süpürme gazı akışını 1 üniteye ayarlayın. LCMS iş akışıyla arabirim oluşturan herhangi bir yazılımı kullanarak veri analizini gerçekleştirin.NOT: Yukarıdaki iş akışıyla kullanılan yazılımlar XCalibur (Thermo) ve TraceFinder’dır (Thermo). Veri analizi için dikkat edilmesi gereken önemli noktalar aşağıda özetlenmiştir:Beklenen saklama süreleri: Deneyden önce kromatografik yöntemi kullanarak ilgilenilen her metabolit için standartları çalıştırarak her metabolitin tutma süresini belirleyin.NOT: UMP ve 13C3-UMP dahil izotopologlarının tutma süreleri tamamen aynıdır. Metabolitler için beklenen M/Z: Bir metabolit negatif iyon modunda iyonlaşırsa (UMP gibi), UMP eksi bir protonun moleküler formülünü kullanarak beklenen tam kütleyi hesaplayın [C 9 H14N2O9P]. Pozitif iyon modunda iyonlaşan metabolitler için, moleküler formülü ve bir protonu kullanarak tam kütleyi hesaplayın. Kütle doğruluğu: Bir orbitrap kütle spektrometresi kullanıldığında, ilgilenilen metabolitin ve izotopologlarının kütle doğruluğunun ±5 mmu olması beklenir. Beklenen M/Z’yi ve algılanan gerçek M/Z’yi hesaba katarak bunu hesaplamak için yazılım kullanın. Doğal bolluk düzeltmesi: Tüm izleme verilerinin, doğadaki ~% 1 13C ve ~% 0.5 15N-izotoplarını hesaba katmak için doğal bolluk düzeltmesinden geçmesi beklenir. 3. SDH aktivitesini ölçmek için 13C 5-glutamin kararlı izotop izleme 13Yapışkan hücrelerde C5-glutamin kararlı izotop izlemeNOT: SDH aktivitesi, fumarat ve süksinatın belirli izotopologlarının 13 C 5-glutamin izleme 7,16,17 üzerine karşılıklı dönüşümü ölçülerek doğrudan izlenebilir. Kompleks III inhibitörü antimisin, SDH kompleksinin net yönlülüğünü değiştirmek için bir kontrol olarak kullanılır (Şekil 4).Ertesi gün% 75 birleşme elde etmek için 6 kuyucuklu bir kapta 250.000 ila 500.000 hücre arasında tohumlayın. 50 mM, 13C, 5-glutamin stoğu hazırlayın (bakınız Tablo 1). 2 mM, 13C, 5-glutamin içeren izleme ortamı hazırlayın (bkz. Tablo 1). Her bir kuyucuktaki ortamı 2 mM, 13C, 5-glutamin içeren ortama değiştirin. İlgilenilen hücreleri etiketlemenin sabit bir durumunu elde etmek için uygun sayıda saat boyunca inkübe edin (adım 2.1.3’teki nota bakın). Adım 2.2’deki protokolü izleyerek metabolitleri izole edin. Adım 2.3’te açıklanan iş akışını izleyerek LC-MS üzerindeki örnekleri analiz edin. SDH aktivitesini etiketleme desenlerine göre analiz etmeNOT: SDH kompleksinin süksinat oksidasyon aktivitesi, 13 C 5-glutamin izlemesinde 13 C 4-fumaratın 13C 4-süksinat oranı değerlendirilerek izlenebilir. SDH kompleksinin fumarat indirgeme aktivitesi, 13 C 5-glutamin izlemesinde 13 C 3-süksinatın 13C 3-fumarat oranı değerlendirilerek izlenebilir.13C 3-fumarat, 13 C 4-fumarat, 13 C3-süksinat ve 13C 4-süksinat yüzde etiketlemesini hesaplayın. Örneğin, 13 C 3-fumarat yüzdesini belirlemek için, fumarat izotopologları için tüm entegre tepe alanlarını toplayın (etiketsiz fumarat, 13 C 1-fumarat, 13 C 2-fumarat, 13 C 3-fumarat ve 13 C4-fumarat) ve 13C 3-fumarat için tepe alanını toplam izotopolog alanına bölün. 100 ile çarpın. Süksinat oksidasyonunu hesaplamak için, yüzde 13 C 4-fumaratı yüzde 13C4-süksinat yüzdesine bölün. Fumarat azalmasını hesaplamak için, yüzde13 C 3-süksinat yüzdesini yüzde 13C3-fumarat ile bölün. 4. Doğrudan kompleks I aktivite testi NOT: DCPIP yapay bir elektron alıcısıdır; ubikinolden elektronları kabul ederken indirgenmiş formuna dönüşür. Bu tahlilde, ubikinon, NADH’nin NAD + ‘ya karmaşık I-aracılı oksidasyonu yoluyla ubikinol’e indirgenir. Bu nedenle, bu hücresiz tahlilde oksitlenmiş DCPIP’in cirosunu ölçmek, kompleks I aktivitesi 7,18 için bir vekildir. Mitokondrinin hücrelerden saflaştırılması ve nicelleştirilmesiNOT: Bu tahlil19 için herhangi bir mitokondriyal saflaştırma protokolü kullanılabilir.25-100 milyon hücre elde edilene kadar hücreleri genişletin. Ortamı bulaşıklardan aspire edin, 1x PBS ile yıkayın, PBS’yi aspire edin ve% 0.25 tripsin ile hücreleri deneyin. Tripsini kültür ortamı ile söndürün ve hücreleri 5 dakika boyunca 1.000 × g’da pelet edin. Hücre peletlerini 5 mL 1x PBS’de 2x yıkayın ve hücreleri pelet etmek için santrifüjlemeyi 5 dakika boyunca 1.000 × g’da tekrarlayın. Yıkanmış peletleri mitokondriyal saflaştırmaya kadar -20 ° C’lik bir dondurucuda saklayın.NOT: Hücre topaklarını bir kereden fazla dondurmayın-çözmeyin. Mitokondri izolasyon tamponunu hazırlayın (bkz. Tablo 1).NOT: NaOH gibi sodyum içeren reaktifler, mitokondri izolasyon tamponlarını hazırlamak için kullanılmamalıdır, çünkü sodyum mitokondriyal membran potansiyeli20’yi karartır ve mitokondriyal kalsiyum homeostazı21’i bozar. Hücre peletlerini 1 mL mitokondri izolasyon tamponu başına 10 milyon hücreye yeniden askıya alın. Örneğin, 10 mL mitokondri izolasyon tamponunda 100 milyon peletlenmiş hücreyi yeniden askıya alın.NOT: Arabelleğe kabarcıklar sokmadan hücre kümelerini bozduğunuzdan emin olun. 2 mL hücre süspansiyonunu, Potter-Elvehjem PTFE havanesiyle uyumlu 3-8 mL çalışma hacmine sahip önceden soğutulmuş bir cam homojenizatöre taşıyın. Hücreleri 10-20 vuruşla homojenize edin, homojenizasyon işlemi boyunca hücre lizizini doğrulamak için hücreleri mikroskop altında izleyin. Etkili hücre lizisi sağlamak için gerekirse inme sayısını artırın.NOT: Yukarıdaki yöntemle hücrelerin homojenize edilmesi, hücrelerin lize edilmesinde etkili değilse, bir şırınga lizis yöntemi22’ye geçin. Hücre lizatının 2 mL’sini buz üzerindeki bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve tüm hücre süspansiyonu homojenize edilene kadar yukarıdaki adımları tekrarlayın. Çekirdekleri ve hücre kalıntılarını 4 ° C’lik bir santrifüjde 10 dakika boyunca 650 × g’da peletleyin. Süpernatantı yeni bir 2,0 mL tüpe taşıyın ve yukarıdaki santrifüjlemeyi 650 × g’da 4 ° C’de 10 dakika boyunca tekrarlayın. Süpernatantı yeni bir 2.0 mL tüpe taşıyın ve ham mitokondrileri 4 ° C’lik bir santrifüjde 10 dakika boyunca 7.000 × g’da pelet edin. Süpernatanı atın ve peleti 1 mL mitokondri izolasyon tamponunda yeniden askıya alın. Protein ölçümü için 50 μL’yi yeni bir tüpe taşıyın. Yukarıdaki santrifüjleme adımını numunenin iki alikotunda tekrarlayın (50 μL numune ve kalan ~ 950 μL). Supernatanı atın ve peletleri kullanıma hazır olana kadar -80 ° C’lik bir dondurucuda saklayın. Proteini çıkarmak için 50 μL aliquot’tan peletlere 200 μL RIPA tamponu, 10 dakika boyunca vorteks ve proteini izole etmek için 21.000 × g’da santrifüj ekleyin. 50 μL aliquot’taki protein miktarını ölçün ve 950 μL numunede kalan proteini ölçmek için bu sayıyı kullanın. Örneğin, 50 μL aliquot için protein niceliği 1 μg / μL ise, kalan mitokondriyal peletteki toplam protein 950 μg’dir (1 μg / μL × 950 μL). Kompleks I aktivite testinin yapılmasıNOT: Bu test için 143B osteosarkom hücre hattı kullanılmıştır, ancak protokol herhangi bir kültürlü hücre için uyarlanabilir.Mitokondri resüspansiyon tamponunda saflaştırılmış mitokondrileri (bakınız Tablo 1) 5 mg protein / mL’lik nihai bir konsantrasyona yeniden askıya alın. Mitokondrileri geçirgenleştirmek için -20 ° C’lik bir dondurucuda beş dondurma / çözülme döngüsü gerçekleştirin. Karmaşık I aktivite tahlili tamponunu yapın (bkz. Tablo 1). 5 mg/mL mitokondri stoğunun 50 ug’unu 90 μL kompleks I aktivite tamponu ile karıştırın. Kompleks I aktivitesini kontrol etmek için beş işlenmemiş replika ve beş rotenon ile muamele edilmiş (5 μM) replika hazırlayın. 37 °C’ye ayarlanmış bir plaka okuyucuda 600 nm’de taban çizgisi absorbansını okuyun. 2 mM’lik son konsantrasyona NADH ekleyerek reaksiyonu başlatın ve 1 saatlik bir süre boyunca absorbansı (600 nm) izleyin, en az 2 dakikada bir ölçüm yapın. Absorbanstaki azalma, karmaşık I aktivitesi yoluyla DCPIP’in azaldığının göstergesidir.NOT: NADH, tüm numunelerin aynı anda başlatıldığından emin olmak için çok kanallı bir pipet kullanılarak eklenmelidir. 5. Süperoksit seviyelerini ölçmek için LC-MS bazlı tahlil NOT: MitoSox Red’in floresan özellikleri, süperoksit23 ile reaksiyonundan bağımsız olarak değişebilir. Bu LC-MS bazlı tahlil, ürünü doğrudan MitoSox Red ile reaksiyona giren süperoksitten ölçer. Aşağıdaki tahlil Xiao ve ark.24’ten biraz değiştirilmiştir. 2-Hidroksi-mitoethidium (2-OH MitoE2+), süperoksit reaksiyonunun ürünüdür (Şekil 5). Bu test için Caki1 hücre hattı kullanılmıştır, ancak protokol herhangi bir kültürlü hücre için uyarlanabilir. Yapışkan hücrelerin MitoSox Red ile tedavisiErtesi gün% 75 birleşme elde etmek için 6 kuyucuklu bir kapta 250.000 ila 500.000 hücre arasında tohumlayın. LC-MS testi için bir dizi plaka ve hücre sayımı normalizasyonu için bir dizi plaka tohumladığınızdan emin olun. Dulbecco’nun modifiye Eagle besiyerinde% 10 ısı ile inaktive FBS ve% 1 penisilin-streptomisin içeren komple DMEM hazırlayın. Tüm kuyucuklardaki ortamı tüm koşullar için 2 mL tam DMEM ile yenileyin. Bu noktada ilgilendiğiniz ilaçları veya tedavileri eklediğinizden emin olun. Hücreleri 1 saat boyunca bir doku kültürü inkübatöründe inkübe edin. Pozitif ve negatif kontroller hazırlayın. PBS’de seyreltilmiş 50 mM’lik bir tert-bütil hidroperoksit stoğu ve DMSO’da seyreltilmiş 250 mM’lik bir N-asetil sistein (NAC) stoğu hazırlayın (bakınız Tablo 1).NOT: Tertbütil hidroperoksit (tBuOOH), pozitif bir kontrol görevi görecek ve 2-OH MitoE2 + miktarını artıracak güçlü bir reaktif oksijen türüdür. NAC, negatif bir kontrol görevi görecek ve tBuOOH’un neden olduğu süperoksit üretimini nötralize edecek güçlü bir antioksidandır. Pozitif kontrol kuyucuklarına 1 μL tBuOOH ve negatif kontrol kuyucuklarına 1 μL tBuOOH + 100 μL NAC ekleyin.NOT: P2 pipet (0,1-2 μL aralığı) kullanmak, 1 μL’yi aktarmanın en uygun yoludur. Bir doku kültürü inkübatöründe 1 saat inkübe edin. 1 mM MitoSox Kırmızı stoğu hazırlayın ( bakınız Tablo 1) ve 1 μM’lik nihai konsantrasyon elde etmek için her bir kuyucuğa 2 μL 1 mM MitoSox Kırmızısı ekleyin. Bu son inkübasyon sırasında, son LC-MS verilerini normalleştirmek için hücre sayımlarını elde etmek için yinelenen plakalardan birini sayın. Oksitlenmiş Mitosox Red ürününün yapışkan hücrelerden izolasyonuBir kova kuru buz alın ve izolasyona başlamadan önce kuru buzun üzerine soğuk HPLC sınıfı izopropanol yerleştirin. Her seferinde bir plaka çıkararak, ortamı kuyucuklardan aspire edin ve 1 mL 1x PBS ile 2x yıkayın. Bir sonraki adıma geçmeden önce kuyulardan kalan tüm PBS’leri aspire edin.NOT: Aspirasyon sırasında plakayı ve pipeti kabın duvarına yasladığınızdan emin olun, böylece yapışkan hücrelerin bozulmasını önleyin. Plakayı kuru buz üzerine yerleştirin ve her bir oyuğa 800 μL HPLC sınıfı izopropanol ekleyin. Hücre lizizini kolaylaştırmak için plakayı -80 ° C’lik bir dondurucuda en az 15 dakika inkübe edin.NOT: Bu noktada, bir sonraki plaka inkübatörden çıkarılabilir ve 5.2.1-5.2.4 adımları tekrarlanabilir. Tüm plakalar -80 ° C dondurucuda inkübe edilene kadar buna devam edin. Dondurucudan bir seferde bir plaka çıkararak, bir hücre kaldırıcı kullanarak kuru buz üzerinde her bir kuyucuğu kazıyın ve lizatı 1,5 mL’lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Bir sonraki adıma kadar tüpü kuru buz üzerinde tutun. Tüm tüpleri 4 ° C’de 10 dakika boyunca vorteks edin ve daha sonra maksimum hızda (en az 17.000 × g) 10 dakika boyunca 4 ° C’de santrifüj yapın. Süpernatantı 1,5 mL’lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve bir vakum konsantratöründe kurutun. Lizat kuruduktan sonra, metabolit peletlerini LC-MS için hazır olana kadar -80 ° C’de saklayın. MitoSox Kırmızı ve 2-hidroksi-mitoethidium LC-MS ölçümü (2-OH MitoE2+)HPLC sınıfı MeOH:kloroform:suyun 3:3:1 karışımından 100 μL ekleyerek buz üzerinde LCMS için numuneleri hazırlayın. 4 ° C’de 10 dakika boyunca vorteks. Her LC-MS şişesine 25 μL hareket ettirin. Kalan numuneyi -80 °C dondurucuda saklayın. Aşağıdaki sıvı kromatografi tamponlarını hazırlayın: i) tampon A:% 0.1 formik asit içeren HPLC sınıfı su; ii) tampon B: %0.1 formik asit içeren HPLC sınıfı asetonitril. Yöntemi geliştirmeye başlamak için Thermo XCalibur Instrument Setup uygulamasını açın. Bu pencerenin sol kenar çubuğunda iki kutu arayın – ilk kutu kromatografi yöntemi geliştirmeye izin verir ve ikinci kutu kütle spektrometri yöntemi geliştirmeye izin verir. Sıvı kromatografisi yöntemi geliştirme:0,25 mL/dak’lık bir akış hızı ayarlayın ve yöntemi B’de başlatın ve 12 dakikalık süre boyunca B’ye yükselin. Bir sonraki dakika boyunca, arabellek B’yi B’ye geri bırakın ve sonraki 2 dakika boyunca bu seviyeyi koruyun.NOT: B’deki son 2 dakikalık akış, kolon basıncının başlangıç basıncına düşmesi ve kolonun uygun tampon oranlarıyla dengelenmesi için kritik öneme sahiptir. Bu dengeleme adımının dahil edilmemesi, daha sonra çalıştırılan tüm örnekler için bekletme sürelerinin değişmesine neden olur. Aşağıdaki parametrelerle bir Tune Dosyası oluşturun:Tune Uygulamasını açın ve yeni bir melodi dosyası oluşturun. Yöntem Kurulumu modülündeki çakışan ayarları (bkz. adım 5.3.9.3) tarama aralığı, çözünürlük, polarite, AGC hedefi ve maksimum BT dahil olmak üzere bu ayar dosyasına da uygulayın. Kılıf gazını 30’a, Aux gazını 3’e ve Süpürme gazını da 3’e ayarlayın. Püskürtme voltajını 3 kV’a, Kapiler sıcaklığı 300’e ve S-lens RF seviyesini 60’a ayarlayın. Kütle spektrometresi yöntemi geliştirme:Sol alttaki potansiyel taramalar listesinden, Full MS’i pencerenin ortasına sürükleyip bırakın. Ayarları yapmak için düşüşten sonra Tam MS karesine tıkladığınızdan emin olun. MS yönteminin toplam süresi 13 dakikadır.NOT: LC yöntemi MS yönteminden daha uzundur, çünkü son 2 dakika kolon yenileme içindir ve metabolit nicelleştirmesi için değildir. Modülün sağ tarafında, Yöntemin özellikleri altında, Yöntem süresi ve Çalışma süresi’nin 13,00 dakika olarak ayarlandığından emin olun. Bu tam taramayı pozitif modda 70.000 Çözünürlükte ve 1 × 106 AGC hedefinde çalıştırın. Maksimum BT’yi 100 ms’ye ve Tarama aralığını 300 m/z ile 700 m/z arasında ayarlayın. Modülün üst kısmındaki Dosyaları Ayarla altında, yeni oluşturulan ayar dosyasının bu yönteme bağlı olduğunu gözlemleyin. 2 μL numune enjeksiyonu ile MitoSox Red algılama yöntemini çalıştırın.