Zuurstofonafhankelijke assays om de mitochondriale functie bij zoogdieren te meten

1. Proliferatietests om de activiteit van complexe I-, dihydroorotaatdehydrogenase (DHODH) en complexe V-activiteiten te meten Zaaicellen voor proliferatietestsOPMERKING: Dit protocol maakt gebruik van de humane osteosarcoomcellijn 143B die commercieel is gekocht bij ATCC. Deze cellijn werd gebruikt volgens de richtlijnen van ons goedgekeurde Institutional Biosafety Committee (IBC) protocol.Verwijder de platen uit de weefselkweekincubator. Zuig het medium uit de platen en was met 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) om overgebleven medium te verwijderen. Zuig de PBS aan en bedek de schaal met 0,05% -0,25% trypsine om de cellen van de onderkant van de plaat op te tillen. Wacht 3-5 minuten totdat de trypsine de cellen van de plaat vrijgeeft en blus vervolgens de trypsine met 10 ml van het gewenste groeimedium dat 10% foetaal runderserum (FBS) bevat. Verzamel de cellen in een conische buis en centrifugeer gedurende 5 minuten op 1.000 × g om de cellen te pelleteren. Zuig het medium uit de buis zonder de pellet te verstoren. Resuspendie van de pellet met volledig medium. Tel de cellen en kwantificeer het volume dat nodig is om tussen 10.000 en 25.000 cellen in een 6-well plaat te zaaien.OPMERKING: Elke cellijn moet worden geoptimaliseerd voor het aantal cellen dat moet worden gezaaid. De ideale samenloop die wordt bereikt is ~10% aan het begin van het experiment en ~80% aan het einde van het experiment. Pipetteer de cellen in een plaat met 6 putten en voeg 2 ml volledig medium toe aan de putjes. Laat 24 uur zitten voordat u overschakelt naar de experimentele mediumomstandigheden.OPMERKING: Zaad ten minste drie replicaties per aandoening en voldoende putten om de onbehandelde controleconditie, met remmer behandelde controleconditie, onbehandelde experimentele toestand en met remmer behandelde experimentele toestand te testen. Mediumverandering om complexe V-activiteit door proliferatie te beoordelenOPMERKING: Cellen die zich vermenigvuldigen in een medium met galactose zijn afhankelijk van complexe V-activiteit voor ATP-synthese 9,10. In tegenstelling tot glucose, dat netto twee ATP uit glycolyse oplevert, levert galactose geen op, waardoor de cellen afhankelijk zijn van complexe V voor ATP-synthese (figuur 1). De complexe V-remmer oligomycine wordt gebruikt als controle.Maak 10 mM glucosehoudend medium (zie tabel 1). Maak 10 mM galactosehoudend medium (zie tabel 1). Verander het medium in elke put in glucosebevattende DMEM of galactosebevattende DMEM. Voeg 5 μM oligomycine (de complexe V-remmer) toe aan de relevante putten en hetzelfde volume DMSO aan de onbehandelde putten. De oligomycinevoorraad is 10 mM geresuspendeerd in DMSO. Plaats de plaat gedurende 2 dagen terug in de couveuse voor weefselkweek. Mediumverandering om complexe I-activiteit te beoordelen door proliferatieOPMERKING: Cellen die zich vermenigvuldigen in een pyruvaatvrij medium zijn meer afhankelijk van complex I-activiteit11,12. Zonder pyruvaat hebben de gekweekte cellen complex I nodig om het grootste deel van de NADH-reoxidatie terug naar NAD + te vergemakkelijken (figuur 2). De complexe I-remmer rotenon wordt gebruikt als controle.Maak pyruvaatvrij DMEM-medium aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine. Maak een 1 M oplossing van pyruvaat (zie tabel 1). Verander het medium in elke put in pyruvaatvrij medium of pyruvaathoudend medium. Voeg 2 μM rotenon (de complexe I-remmer) toe aan de behandelde putten en hetzelfde volume DMSO aan de onbehandelde putten. De rotenonvoorraad is 25 mM geresuspendeerd in DMSO. Plaats de plaat gedurende 2 dagen terug in de couveuse voor weefselkweek. Mediumverandering om DHODH-activiteit te beoordelen door proliferatieOPMERKING: Cellen die zich vermenigvuldigen in een uridinevrij medium vereisen dihydroorotaatdehydrogenase (DHODH) activiteit11,12,13. Bij afwezigheid van exogene uridine synthetiseren de gekweekte cellen pyrimidines via de de novo route. De DHODH-remmer brequinar wordt gebruikt als controle.Maak uridinevrije DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine. Maak een uridine-stockoplossing van 10 mg/ml en bereid vervolgens een uridinemedium van 100 μg/ml (zie tabel 1). Verander het medium in elke put in uridinevrij medium of uridinehoudend medium. Voeg 5 μM brequinar (de DHODH-remmer) toe aan de behandelde putten en hetzelfde volume DMSO aan de onbehandelde putten. De brequinar stock is 10 mM geresuspendeerd in DMSO. Plaats de plaat gedurende 2 dagen terug in de couveuse voor weefselkweek. Het tellen van de cellen voor proliferatietestsVoor alle experimenten, vul het medium elke 2 dagen aan. Als het medium geel van kleur wordt, verhoogt u de frequentie van de mediumveranderingen. Laat de cellen tot 7 dagen prolifereren en stop het experiment als een van de putten er overwoekerd uit begint te zien. Putten worden als overwoekerd beschouwd wanneer de samenvloeiing meer dan 80% bedraagt. Zuig het medium aan, was met 1x PBS en bedek de bodem van de put met 0,25% trypsine (500 μL voor een 6-well dish). Wacht 5 minuten totdat de cellen van de schaal zijn opgetild. Controleer dit onder een microscoop. Blus de trypsine met 1 ml complete DMEM met 10% FBS. Pipetteer op en neer om de celklonten uit elkaar te halen. Bereid Coulter-tegenbekers voor door ze elk te vullen met 10 ml isotoonbuffer (één kopje per putje). Tel de cellen op een celteller en noteer de gegevens. Als de uitlezing cellen per milliliter (cellen / ml) is, vermenigvuldigt u de geregistreerde waarde met 1,5 om het totale aantal cellen per put te krijgen.OPMERKING: Andere celtelmethoden zoals een hemocytometer volstaan als het laboratorium geen Coulter-teller heeft. 2. 13C 4-Aspartaat stabiele isotoop tracing en LC-MS analyse om DHODH activiteit te meten 13C 4-aspartaat stabiele isotoop traceren in aanhangende cellenOPMERKING: DHODH-activiteit kan direct worden gecontroleerd door de opname van 13 C 4-aspartaat in 13C3-UMP te meten. Brequinar wordt gebruikt als controle voor DHODH-activiteit (figuur 3). De resulterende niveaus van 13C3-UMP zijn een maat voor DHODH-activiteit.Zaai tussen de 250.000 en 500.000 cellen in een schaal met 6 putten om de volgende dag 75% samenvloeiing te bereiken. Bereid een stamoplossing van 250 mM 13 C 4-aspartaat en 10 mM 13C4-aspartaatmedium (zie tabel 1). Verander het medium in elke put in medium met 10 mM 13C 4-aspartaat. Incubeer gedurende het juiste aantal uren om een steady state te bereiken voor het labelen van de cellen van belang.OPMERKING: De steady state wordt gedefinieerd als het tijdsbestek waarin het percentage gelabelde metaboliet plateaus in de loop van de tijd14. Voor 143B osteosarcoomcellen bereikt 13C 4-aspartaat een steady state met 8 uur. Het is het beste om dit tijdsbestek voorafgaand aan het experiment te bepalen door een tijdsloopexperiment uit te voeren met de stabiele isotoop van belang. Metabolietisolatie uit de aanhangende cellenVoordat u begint, bereidt u een emmer droogijs voor en bereidt u 80% HPLC-grade MeOH voor in HPLC-grade water. Koel deze buffer een nacht af in een vriezer van −80 °C of leg hem direct op droogijs. Neem één bord tegelijk uit de couveuse, zuig het medium uit de putjes en was 2x met 1x PBS. Verwijder alle resterende PBS uit de putten voordat u doorgaat naar de volgende stap.OPMERKING: Zorg ervoor dat u de plaat kantelt tijdens de aspiratie en pipet tegen de wand van de schotel om verstoring van de aanhangende cellen te voorkomen. Plaats de plaat op droogijs en voeg onmiddellijk 800 μL 80% LCMS-grade MeOH in 20% LCMS-grade water toe aan elke put. Incubeer de plaat gedurende ten minste 15 minuten in een vriezer van −80 °C om de cellysis te vergemakkelijken.OPMERKING: Op dit punt kan de volgende plaat uit de couveuse worden gehaald en stappen 2.2.1-2.2.4 worden herhaald. Ga hiermee door totdat alle platen in de vriezer van −80 °C zijn uitgebroed. Neem één plaat per keer uit de vriezer, schraap elk putje op droogijs met behulp van een cellifter en breng het lysaat over naar een microcentrifugebuis van 1,5 ml. Houd de buis op droogijs tot de volgende stap. Draai alle buizen gedurende 10 minuten bij 4 °C en centrifugeer vervolgens gedurende 10 minuten bij 4 °C bij maximale snelheid (ten minste 17.000 × g). Breng het supernatant over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en droog in een vacuümconcentrator van 4 °C die is uitgerust met een koudeval van −105 °C op een hoogvacuümstand gedurende ongeveer 6 uur of totdat de monsters zijn verdampt. Zodra het lysaat is gedroogd, bewaart u de metabolietkorrels bij −80 °C totdat u klaar bent om ze voor te bereiden op vloeistofchromatografie in combinatie met massaspectrometrie (LCMS). Vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS) meting van polaire metabolietenOPMERKING: Elke chromatografische en massaspectrometrieworkflow die de detectie van aspartaat, de tussenproducten in de novo pyrimidine biosynthese en UMP mogelijk maakt, volstaat14.Bereid de monsters voor op LCMS op ijs door 100 μL water van HPLC-kwaliteit toe te voegen aan de gedroogde pellets en vortex gedurende 10 minuten bij 4 °C. Centrifugeer de monsters bij 4 °C gedurende 10 minuten bij maximale snelheid (ten minste 17.000 × g) en verplaats 25 μL in elke LC-MS-injectieflacon. Injecteer 2 μL lysaat in het LC-MS-systeem. Een veelgebruikte methodologie wordt hieronder gegeven:Bereid mobiele fase A bestaande uit 20 mM ammoniumcarbonaat (LC-MS-kwaliteit) en 0,1% ammoniumhydroxide (LC-MS-kwaliteit) opgelost in water van LC-MS-kwaliteit. Kies 100% acetonitril (LC-MS Grade) als mobiele fase B. Kies voor de chromatografie een analytische kolom van 5 μm, 150 mm x 2,1 mm uitgerust met een beschermkolom van 2,1 mm x 20 mm voor hydrofiele verbindingen (zie de materiaaltabel). Zet de kolomoven op 25 °C. Gebruik de volgende vloeistofchromatografie-instellingen: een constant debiet van 0,15 ml/min; een lineaire gradiënt van 80% naar 20% Mobiele Fase B gedurende 20 min, gevolgd door een lineaire gradiënt van 20% naar 80% Mobiele Fase B gedurende 0,5 min, gevolgd door een hold op 80% Mobiele Fase B gedurende 7,5 min. Kies de volgende massaspectrometerinstellingen: een volledige scan tussen m/z 70 Da en 1.000 Da; een resolutie van 70.000; een AGC-doelstelling van 1 × 106; en een maximale injectietijd van 20 ms. Bedien de bron in de polariteitsschakelmodus. Stel de sproeispanning in op 3,0 kV, het verwarmde capillair op 275 °C, de HESI-sonde op 350 °C, de mantelgasstroom op 40 eenheden, de hulpgasstroom op 15 eenheden en de veeggasstroom op 1 eenheid. Voer de gegevensanalyse uit met behulp van software die is gekoppeld aan de LCMS-workflow.OPMERKING: De software die wordt gebruikt met de bovenstaande workflow zijn XCalibur (Thermo) en TraceFinder (Thermo). De belangrijkste overwegingen voor data-analyse worden hieronder beschreven:Verwachte bewaartijden: Bepaal de retentietijd van elke metaboliet door de normen voor elke metaboliet van belang uit te voeren met behulp van de chromatografische methode voorafgaand aan het experiment.OPMERKING: De retentietijden van UMP en zijn isotopologen, inclusief 13C 3-UMP, zijn exact hetzelfde. Verwachte M/Z voor metabolieten: Als een metaboliet ioniseert in de negatieve ionmodus (zoals UMP), bereken dan de verwachte exacte massa met behulp van de molecuulformule van UMP minus een proton [C 9 H14N2O9P]. Voor metabolieten die ioniseren in positieve ionenmodus, berekent u de exacte massa met behulp van de molecuulformule plus een proton. Massa nauwkeurigheid: Bij gebruik van een orbitrap massaspectrometer wordt verwacht dat de metaboliet van belang en zijn isotopologen een massanauwkeurigheid ±5 mmu hebben. Gebruik software om dit te berekenen, rekening houdend met de verwachte M/Z en de daadwerkelijk gedetecteerde M/Z. Natuurlijke abundantie correctie: Alle traceringsgegevens zullen naar verwachting een natuurlijke abundantiecorrectie ondergaan om rekening te houden met de ~1% 13C en ~0,5% 15 N-isotopen in de natuur 15. 3. 13C5-glutamine stabiele isotoop traceren om SDH-activiteit te meten 13C5-glutamine stabiele isotoop tracering in aanhangende cellenOPMERKING: SDH-activiteit kan direct worden gecontroleerd door de interconversie van bepaalde isotopologen van fumaraat en succinaat te meten op 13C 5-glutaminetracering 7,16,17. De complexe III-remmer antimycine wordt gebruikt als controle om de netto directionaliteit van het SDH-complex te veranderen (figuur 4).Zaai tussen de 250.000 en 500.000 cellen in een schaal met 6 putten om de volgende dag 75% samenvloeiing te bereiken. Maak een bouillon van 50 mM 13C5-glutamine (zie tabel 1). Bereid traceermedium dat 2 mM 13C 5-glutamine bevat (zie tabel 1). Verander het medium in elke put in een medium dat 2 mM 13C5-glutamine bevat. Incubeer gedurende het juiste aantal uren om een stabiele staat van labeling van de cellen van belang te bereiken (zie de opmerking in stap 2.1.3). Isoleer de metabolieten volgens het protocol in stap 2.2. Analyseer de voorbeelden op LC-MS volgens de workflow die wordt beschreven in stap 2.3. Analyse van de SDH-activiteit op basis van etiketteringspatronenOPMERKING: De succinaatoxidatieactiviteit van het SDH-complex kan worden gecontroleerd door de verhouding van 13 C 4-fumaraat tot 13 C4-succinaat te beoordelen bij 13C5-glutaminetracering. De fumaraatreductieactiviteit van het SDH-complex kan worden gemonitord door de verhouding van 13 C 3-succinaat tot 13 C 3-fumaraat te beoordelen bij 13C5-glutaminetracering.Bereken het percentage etikettering van 13 C 3-fumaraat, 13 C 4-fumaraat, 13 C3-succinaat en 13 C4-succinaat. Om bijvoorbeeld het percentage van 13 C 3-fumaraat te bepalen, somt u alle geïntegreerde piekgebieden voor de fumaraatisotopologen op (ongelabeld fumaraat, 13C 1-fumaraat, 13 C2-fumaraat, 13 C 3-fumaraat en 13 C4-fumaraat) en deelt u het piekoppervlak voor 13C 3-fumaraat door het totale isotopogue-gebied. Vermenigvuldig met 100. Om de succinaatoxidatie te berekenen, deelt u het percentage 13 C 4-fumaraat door het percentage 13C 4-succinaat. Om de fumaraatreductie te berekenen, deelt u het percentage 13 C 3-succinaat door het percentage 13C 3-fumaraat. 4. Directe complexe I-activiteitstest OPMERKING: DCPIP is een kunstmatige elektronenacceptor; Het verandert in zijn gereduceerde vorm bij het accepteren van elektronen van ubiquinol. In deze test wordt ubiquinon gereduceerd tot ubiquinol via de complexe I-gemedieerde oxidatie van NADH tot NAD +. Het meten van de omzet van geoxideerd DCPIP in deze celvrije test is dus een proxy voor complexe I-activiteit 7,18. Zuiveren en kwantificeren van de mitochondriën uit cellenOPMERKING: Elk mitochondriaal zuiveringsprotocol kan worden gebruikt voor deze test19.Breid de cellen uit totdat 25-100 miljoen cellen zijn verkregen. Zuig het medium van de vaat, was met 1x PBS, zuig de PBS op en probeer de cellen te spinnen met 0,25% trypsine. Blus de trypsine met kweekmedium en pellet de cellen gedurende 5 minuten op 1.000 × g . Was de celpellets 2x in 5 ml 1x PBS en herhaal de centrifugatie op 1.000 × g gedurende 5 minuten om de cellen te pelleteren. Bewaar de gewassen pellets in een vriezer van −20 °C tot mitochondriale zuivering.OPMERKING: Bevries de celkorrels niet meer dan één keer. Bereid mitochondriale isolatiebuffer voor (zie tabel 1).OPMERKING: Natriumbevattende reagentia zoals NaOH mogen niet worden gebruikt om mitochondriale isolatiebuffers te bereiden, omdat natrium het mitochondriale membraanpotentiaal20 aantast en mitochondriale calciumhomeostaseverstoort 21. Resuspendeerde de celpellets tot 10 miljoen cellen per 1 ml mitochondriale isolatiebuffer. Resuspendeer bijvoorbeeld 100 miljoen gepelletiseerde cellen in 10 ml mitochondriale isolatiebuffer.OPMERKING: Zorg ervoor dat u de celklonten verstoort zonder bubbels in de buffer te introduceren. Verplaats 2 ml celsuspensie in een voorgekoelde glazen homogenisator met een werkvolume van 3-8 ml die compatibel is met een Potter-Elvehjem PTFE-stamper. Homogeniseer de cellen met 10-20 slagen en controleer de cellen onder een microscoop om de cellyse tijdens het homogenisatieproces te bevestigen. Verhoog het aantal slagen indien nodig om een efficiënte cellysis te garanderen.OPMERKING: Als het homogeniseren van de cellen met de bovenstaande methode niet effectief is voor het lyseren van de cellen, schakel dan over op een spuitlysismethode22. Breng 2 ml van het cellysaat over in een microcentrifugebuis op ijs en herhaal de bovenstaande stappen totdat de hele celsuspensie is gehomogeniseerd. Pellet de kernen en celresten gedurende 10 minuten bij 650 × g in een centrifuge van 4 °C. Verplaats het supernatant naar een nieuwe buis van 2,0 ml en herhaal de bovenstaande centrifugatie gedurende 10 minuten bij 4 °C bij 650 × g . Verplaats het supernatant naar een nieuwe buis van 2,0 ml en pellet de ruwe mitochondriën gedurende 10 minuten op 7.000 × g in een centrifuge van 4 °C. Gooi het supernatant weg en resuspensie van de pellet in 1 ml mitochondriale isolatiebuffer. Verplaats 50 μL in een nieuwe buis voor eiwitkwantificering. Herhaal de bovenstaande centrifugatiestap op de twee aliquots van het monster (het monster van 50 μL en het resterende ~950 μL). Gooi het supernatant weg en bewaar de pellets in een vriezer van −80 °C totdat ze klaar zijn voor gebruik. Voeg 200 μL RIPA-buffer toe aan de pellets van het aliquot van 50 μL om het eiwit te extraheren, vortex gedurende 10 minuten en centrifugeer met 21.000 × g om het eiwit te isoleren. Kwantificeer de hoeveelheid eiwit in het aliquot van 50 μL en gebruik dit getal om het resterende eiwit in het monster van 950 μL te kwantificeren. Als de eiwitkwantificering voor het aliquot van 50 μl bijvoorbeeld 1 μg/μl is, is het totale eiwit in de resterende mitochondriale pellet 950 μg (1 μg/μl × 950 μl). Het uitvoeren van de complexe I activiteit assayOPMERKING: De 143B osteosarcoomcellijn werd gebruikt voor deze test, maar het protocol kan worden aangepast voor alle gekweekte cellen.Resuspendie gezuiverde mitochondriën in de mitochondriale resuspensiebuffer (zie tabel 1) tot een eindconcentratie van 5 mg eiwit/ml. Voer vijf vries-/dooicycli uit in een vriezer van −20 °C om de mitochondriën te permeabiliseren. Maak de complexe I-activiteitstestbuffer (zie tabel 1). Meng 50 ug van de 5 mg/ml mitochondriale voorraad met 90 μL complexe I-activiteitsbuffer. Bereid vijf onbehandelde replicaties en vijf met rotenon behandelde (5 μM) replicaties voor om te controleren op complexe I-activiteit. Lees de basisabsorptie af bij 600 nm in een plaatlezer die is ingesteld op 37 °C. Start de reactie door NADH toe te voegen aan een eindconcentratie van 2 mM en volg de absorptie (600 nm) over een periode van 1 uur, waarbij ten minste elke 2 minuten wordt gemeten. De afname van de absorptie is indicatief voor een vermindering van DCPIP via complexe I-activiteit.OPMERKING: De NADH moet worden toegevoegd met behulp van een meerkanaalspipet om ervoor te zorgen dat alle monsters tegelijkertijd worden gestart. 5. LC-MS-gebaseerde test om de superoxideniveaus te meten OPMERKING: De fluorescentie-eigenschappen van MitoSox Red kunnen onafhankelijk van de reactie met superoxide23 veranderen. Deze op LC-MS gebaseerde test meet direct het product van superoxide dat reageert met MitoSox Red. De volgende test is enigszins gewijzigd ten opzichte van Xiao et al.24. 2-Hydroxy-mitoethidium (2-OH MitoE2+) is het product van de superoxidereactie (figuur 5). De Caki1-cellijn werd gebruikt voor deze test, maar het protocol kan worden aangepast voor alle gekweekte cellen. Behandeling van aanhangende cellen met MitoSox RedZaai tussen de 250.000 en 500.000 cellen in een schaal met 6 putten om de volgende dag 75% samenvloeiing te bereiken. Zorg ervoor dat u een set platen zaait voor de LC-MS-test en een dubbele set platen voor normalisatie van het aantal cellen. Bereid volledige DMEM met 10% warmte-geïnactiveerde FBS en 1% penicilline-streptomycine in dulbecco’s gemodificeerde Eagle medium. Ververs het medium in alle putten voor alle omstandigheden met 2 ml complete DMEM. Zorg ervoor dat u op dit moment medicijnen of behandelingen van belang toevoegt. Incubeer de cellen in een weefselkweekincubator gedurende 1 uur. Bereid positieve en negatieve controles voor. Bereid een voorraad tert-butylhydroperoxide van 50 mM verdund in PBS en een voorraad N-acetylcysteïne (NAC) van 250 mM verdund in DMSO (zie tabel 1).OPMERKING: Tertbutylhydroperoxide (tBuOOH) is een krachtige reactieve zuurstofsoort die zal fungeren als een positieve controle en de hoeveelheid van de 2-OH MitoE2 + verhoogt. NAC is een krachtige antioxidant die zal fungeren als een negatieve controle en neutraliseert de superoxide productie veroorzaakt door tBuOOH. Voeg 1 μL tBuOOH toe aan de positieve controleputten en 1 μL tBuOOH + 100 μL NAC aan de negatieve controleputten.OPMERKING: Het gebruik van een P2-pipet (0,1-2 μL-bereik) is de optimale manier om 1 μL over te brengen. Incubeer gedurende 1 uur in een weefselkweekincubator. Bereid 1 mM MitoSox Red-bouillon (zie tabel 1) en voeg 2 μL 1 mM MitoSox Red toe aan elke put om een eindconcentratie van 1 μM te bereiken. Incubeer gedurende 30 minuten in een weefselkweekincubator. Tel tijdens deze laatste incubatie een van de dubbele platen om de celtellingen te verkrijgen om de uiteindelijke LC-MS-gegevens te normaliseren. Isolatie van het geoxideerde Mitosox Red product uit de aanhangende cellenNeem een emmer droogijs en plaats koele isopropanol van HPLC-kwaliteit op het droogijs voordat u met de isolatie begint. Neem één bord per keer, zuig het medium uit de putjes en was 2x met 1 ml 1x PBS. Zuig alle resterende PBS uit de putten op voordat u doorgaat naar de volgende stap.OPMERKING: Zorg ervoor dat u de plaat kantelt tijdens de aspiratie en pipet tegen de wand van de schotel om verstoring van de aanhangende cellen te voorkomen. Plaats de plaat op droogijs en voeg 800 μL isopropanol van HPLC-kwaliteit toe aan elk putje. Incubeer de plaat gedurende ten minste 15 minuten in een vriezer van −80 °C om de cellysis te vergemakkelijken.OPMERKING: Op dit punt kan de volgende plaat uit de couveuse worden gehaald en de stappen 5.2.1-5.2.4 worden herhaald. Ga hiermee door totdat alle platen in de vriezer van −80 °C zijn uitgebroed. Neem één plaat tegelijk uit de vriezer, schraap elke put op droogijs met behulp van een cellifter en breng het lysaat over naar een microcentrifugebuis van 1,5 ml. Houd de buis op droogijs tot de volgende stap. Draai alle buizen gedurende 10 minuten bij 4 °C en centrifugeer vervolgens gedurende 10 minuten bij 4 °C bij maximale snelheid (ten minste 17.000 × g). Breng het supernatant over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en droog af in een vacuümconcentrator. Zodra het lysaat is gedroogd, bewaart u de metabolietkorrels bij −80 °C totdat ze klaar zijn voor LC-MS. LC-MS meting van MitoSox Red en 2-hydroxy-mitoethidium (2-OH MitoE2+)Bereid de monsters voor op LCMS op ijs door 100 μL van een 3:3:1 mengsel van HPLC-kwaliteit MeOH:chloroform:water toe te voegen. Vortex gedurende 10 min bij 4 °C. Verplaats 25 μL in elke LC-MS injectieflacon. Bewaar het resterende monster in de vriezer van −80 °C. Bereid de volgende vloeistofchromatografiebuffers voor: i) buffer A: water van HPLC-kwaliteit met 0,1% mierenzuur; ii) buffer B: acetonitril van HPLC-kwaliteit met 0,1% mierenzuur. Open de Thermo XCalibur Instrument Setup-app om te beginnen met het ontwikkelen van de methode. Zoek naar twee vakken in de linkerzijbalk van dit venster – het eerste vak maakt de ontwikkeling van chromatografiemethoden mogelijk en het tweede vak maakt de ontwikkeling van massaspectrometriemethoden mogelijk. Ontwikkeling van vloeistofchromatografiemethoden:Stel een stroomsnelheid van 0,25 ml /min in en start de methode op 20% B, oplopend tot 95% B over een periode van 12 minuten. Laat buffer B de volgende minuut weer zakken naar 20% B en houd dat niveau de volgende 2 minuten vast.OPMERKING: De laatste 2 minuten van het debiet bij 20% B is van cruciaal belang om de kolomdruk terug te laten zakken naar de begindruk en om de kolom in evenwicht te brengen met de juiste bufferverhoudingen. Als deze evenwichtsstap niet wordt meegenomen, zullen de retentietijden verschuiven voor alle volgende uitgevoerde monsters. Maak een Tune-bestand met de volgende parameters:Open de Tune-app en maak een nieuw tune-bestand. Pas eventuele overlappende instellingen van de module Methode-instelling (zie stap 5.3.9.3) ook toe op dit afstembestand, inclusief het scanbereik, de resolutie, de polariteit, het AGC-doel en de maximale IT. Stel het Sheath-gas in op 30, het Aux-gas op 3 en het Sweep-gas op 3. Stel de sproeispanning in op 3 kV, de capillaire temperatuur op 300 en het RF-niveau van de S-lens op 60. Ontwikkeling van massaspectrometriemethoden:Sleep vanuit de lijst linksonder met potentiële scans Full MS naar het midden van het venster. Zorg ervoor dat u na de drop op het volledige MS-vierkant klikt om de instellingen aan te passen. De totale duur van de MS-methode is 13 min.OPMERKING: De LC-methode is langer dan de MS-methode omdat de laatste 2 minuten voor kolomreconditionering zijn en niet voor metabolietkwantificering. Controleer aan de rechterkant van de module onder Eigenschappen van de methode of de duur van de methode en de uitvoeringstijd zijn ingesteld op 13.00 min. Voer deze volledige scan uit in de positieve modus met een resolutie van 70.000 en een AGC-doel van 1 × 106. Stel de maximale IT in op 100 ms en het scanbereik van 300 m/z tot 700 m/z. Observeer onder Bestanden afstemmen boven aan de module of het tune-bestand dat zojuist is gemaakt, aan deze methode is gekoppeld. Voer de methode voor MitoSox Red-detectie uit met 2 μL-monsterinjecties.