אפיון התנהגותי של מודל עכבר תסמונת אנג'למן

תסמונת אנג’למן (AS) היא מחלה נוירו-התפתחותית נדירה. המקור הגנטי הנפוץ ביותר של AS הוא מחיקה גדולה של אזור 15q11-q13 של הכרומוזום שמקורו באם, שנמצא בכמעט 74% מהחולים¹. מחיקה של אזור זה גורמת לאובדן של UBE3A, הגן הסיבתי העיקרי של AS המקודד E3 ubiquitin ligase. האלל האבהי של הגן UBE3A בתאי עצב מושתק בתהליך המכונה הטבעה. כתוצאה מכך, הטבעה אבהית של הגן מאפשרת ביטוי אימהי בלבד במערכת העצבים המרכזית (CNS)². לכן, מחיקת גן UBE3A מכרומוזום שמקורו באם מובילה להתפתחות תסמיני AS. בבני אדם, AS מתבטא בסביבות גיל 6 חודשים, עם פיגור התפתחותי שנמשך לאורך כל שלבי ההתפתחות וגורם לתסמינים מתישים חמורים אצל אנשים מושפעים ^3,4. תסמיני הליבה של ההפרעה כוללים את הגירעון של מיומנויות מוטוריות עדינות וגסות, כולל הליכה אטקסית קופצנית, ליקוי דיבור חמור ונכות אינטלקטואלית. כ-80% מחולי AS סובלים גם מהפרעות שינה ואפילפסיה. נכון להיום, הטיפול הזמין היחיד הוא תרופות סימפטומטיות, המפחיתות התקפים אפילפטיים ומשפרות את איכות השינה¹. לכן, פיתוח מודלים חזקים של בעלי חיים עם פנוטיפים התנהגותיים הניתנים לשחזור לצד ניתוח פנוטיפ מעודן יהיה חיוני כדי להבהיר את המנגנונים הפתופיזיולוגיים של ההפרעה ולגלות תרופות וטיפולים יעילים.

המורכבות של ההפרעה האנושית המשפיעה על מערכת העצבים המרכזית דורשת מאורגניזמי המודל להיות בעלי גנום, פיזיולוגיה והתנהגות דומים. עכברים פופולריים כאורגניזם מודל בשל מחזור הרבייה הקצר שלהם, גודלם הקטן והקלות היחסית של שינוי DNA. בשנת 1984 הציע פול וילנר שלושה קריטריונים בסיסיים לאימות מודל המחלה: מבנה, פנים ותוקף ניבוי, המשמשים לקביעת ערך^{המודל 5}. בפשטות, תוקף המבנה משקף את המנגנונים הביולוגיים האחראים להתפתחות ההפרעה, תוקף הפנים משחזר את הסימפטומים שלה, ותוקף הניבוי מתאר את תגובת המודל לתרופות טיפוליות.

כדי לדבוק בעקרונות לעיל, בחרנו באטיולוגיה הגנטית הנפוצה ביותר, מחיקה גדולה של מוקד 15q11.2-13q האימהי כולל הגן UBE3A, כדי ליצור עכברי מודל AS. השתמשנו בטכניקת CRISPR/Cas9 כדי למחוק אזור באורך 76,225 bp המשתרע על פני כל הגן UBE3A, ומקיף הן את רכיבי הקידוד והן את האלמנטים שאינם מקודדים של הגן, בעכברים מרקע C57BL/6N⁶. לאחר מכן גידלנו את החיות כדי להשיג עכברים הטרוזיגוטיים מסוג UBE3A^+/−. לצורך אימות פנים של המודל, השתמשנו בבעלי חיים מצלבים של נקבות UBE3A+/− וזכרים מסוג בר כדי להשיג צאצאי UBE3A⁺/- (זן בשם C57BL/6NCrl-UBE3A/Ph ומאוחר יותר הוקצה כ-UBE3A ^mGenedel/+) ולשלוט בהמלטות. בדקנו את המוטוריקה העדינה והגסה שלהם, את הרגשנות ואת ההשפעה שלהם כדי לשחזר את תסמיני הליבה AS. במאמר קודם הערכנו גם את התפקודים הקוגניטיביים של בעלי החיים, שכן חולי AS סובלים גם מלקות אינטלקטואלית⁶. עם זאת, לא מצאנו ליקויים קוגניטיביים בעכברי UBE3A^mGenedel/+, אולי בגלל גילם הצעיר של בעלי החיים בזמן הבדיקה⁷. בחינה מאוחרת יותר של בעלי החיים המבוגרים יותר, בסביבות גיל 18 שבועות, גילתה ליקוי בגמישות התנהגותית במהלך למידה היפוכה בפרדיגמת העדפת המקום. עם זאת, המורכבות של הציוד המועסק לניתוח זה דורשת מודול מתודולוגי נפרד והוא אינו נכלל כאן.

המבחנים ההתנהגותיים המוצגים כאן שייכים לכלי הפנוטיפ הנפוצים במחקר גנטי, הודות לערך הניבוי הגבוה שלהם ותוקף המבנה המספיק ^8,9,10. השתמשנו בבדיקות אלה כדי לאמת מודל עכברי של AS על ידי סיכום תסמיני הליבה של המחלה האנושית באופן שניתן לשחזר ואינו תלוי בגיל. הרגשנות של החיה הוערכה במבוך פלוס מוגבה ובמבחני שדה פתוחים. שני הניסויים הללו מבוססים על קונפליקט גישה-הימנעות, שבו בעלי חיים חוקרים סביבה חדשה בחיפוש אחר מזון, מחסה או הזדמנויות הזדווגות, ובו בזמן נמנעים ממדורים חרדתיים¹¹. בנוסף, מבחן השדה הפתוח משמש לבדיקת פעילות לוקומוטורית^{של עכבר 8}. מבחן מתלה הזנב נמצא בשימוש נרחב במחקר דיכאון כדי לסנן תרופות נוגדות דיכאון חדשות או פנוטיפים דמויי דיכאון במודלים נוקאאוט עכבר¹². מבחן זה מעריך את הייאוש שבעלי חיים מפתחים לאורך זמן במצב שאין מנוס ממנו. למידה מוטורית ומאפייני הליכה מפורטים נקבעו על הרוטרוד וב- DigiGait, בהתאמה. סיבולת בעלי חיים על המוט המאיץ מאפיינת את כישורי שיווי המשקל ותיאום התנועה שלו, בעוד ניתוח מפורט של דפוסי הצעדים של העכבר הוא הערכה רגישה של ליקויים עצביים-שריריים הקשורים להפרעות תנועה נוירוגנרטיביות רבות^13,14,15. בדיקת גריסת הקן היא חלק מהמתודולוגיה הסטנדרטית לאיתור התנהגות אימפולסיבית במכרסמים, ומכיוון שהיא משתמשת בהתנהגות טבעית של בניית מכרסמים, היא מעידה על רווחת בעל החיים^16,17.

גודלן של קבוצות הניסוי היה תוצאה של פשרה כדי לעמוד בדרישות חוק 3R ושימוש יעיל בביצועי הרבייה של המושבות. עם זאת, כדי להשיג כוח סטטיסטי, היו לקבוצות לא פחות מ -10 פרטים, בשל הקמת כמות מספקת של זוגות רבייה. למרבה הצער, ביצועי הרבייה לא תמיד הביאו למספר מספיק של בעלי חיים.