Здесь мы демонстрируем использование клеточного электрического импеданса (CEI) в качестве очень простого и понятного метода изучения вирусной инфекции и репликации вируса Зика в клетках человека в режиме реального времени. Кроме того, анализ CEI полезен для оценки противовирусных соединений.
Технология электрического импеданса на основе ячеек (CEI) измеряет изменения импеданса, вызванные растущим или манипулируемым монослоем адгезивной ячейки на лунках культуральной пластины, встроенных в электроды. Технология может быть использована для мониторинга последствий заражения вирусом Зика (ZIKV) и репликации адгезивных клеток в режиме реального времени, поскольку этот вирус обладает высокой цитопатогенностью. Это простой анализ, который не требует использования меток или инвазивных методов и имеет преимущество в предоставлении данных в режиме реального времени. Кинетика инфекции ZIKV сильно зависит от используемой клеточной линии, штамма вируса и множественности инфекции (MOI), которые не могут быть легко изучены с помощью обычных конечных анализов. Кроме того, анализ CEI также может быть использован для оценки и характеристики противовирусных соединений, которые также могут обладать динамическими ингибирующими свойствами в ходе инфекции. В этой статье о методах дается подробное объяснение практического выполнения анализа CEI и его потенциального применения в исследованиях ZIKV и противовирусных исследованиях в целом.
Вспышки вируса Зика (ZIKV) связаны с серьезными осложнениями заболевания, такими как микроцефалия и синдром Гийена-Барре 1,2,3. Хотя будущие эпидемии вероятны из-за различных факторов риска, таких как распространение комаров-переносчиков и растущая урбанизация, на сегодняшний день ни одна вакцина или противовирусный препарат еще не вышли на рынок 3,4. Поэтому традиционные методы исследования ZIKV должны быть дополнены новыми инструментами для изучения этого вируса и его потенциальных противовирусных соединений. Противовирусные исследования часто основаны на фенотипических анализах, где конечной точкой является наличие определенного параметра, такого как появление вирус-индуцированного цитопатического эффекта (CPE) или продуцирование определенного вирус-индуцированного белка с помощью репортерного гена 5,6,7. Однако эти методы имеют считывание конечных точек, являются трудоемкими и могут потребовать сложного анализа. Таким образом, методы, основанные на импедансе, предлагают привлекательную альтернативу.
Электрический импеданс на основе ячеек (CEI) определяется как сопротивление току, протекающему от одного электрода к другому, вызванное адгезивным слоем ячейки, засеянным в колодцы, содержащие электроды. Установленная технология CEI, используемая в этой методологии, представляет собой датчик импеданса электрического элемента и подложки (ECIS), первоначально разработанный Giaever и Keese 8,9. Это используется в широкой области биологических исследований, таких как метастазирование рака, токсикология и заживление ран10,11,12. Его принцип основан на электрическом поле, которое генерируется непрерывным распределением напряжений переменного тока (AC) в диапазоне частот13. Клетки подвергаются воздействию этих неинвазивных электрических полей, и через заданные промежутки времени измеряются изменения импеданса, вызванные ростом клеток или изменениями клеточной адгезии или морфологии14. Кроме того, изменение жизнеспособности клеток также приводит к изменениям импеданса, что делает технологию полезным инструментом для мониторинга инфекции цитопатогенными вирусами15,16,17. Поскольку морфологические изменения клеточного слоя будут обнаружены в наноразмерном диапазоне, технология предлагает высокочувствительный инструмент обнаружения. Анализ CEI, описанный в этой статье, представляет собой простой, неинвазивный, не требующий меток метод в режиме реального времени для измерения изменений импеданса клеточного слоя с течением времени.
Хотя CEI не использовался для оценки течения инфекции ZIKV или ее потенциальных противовирусных препаратов, его использование в качестве диагностического инструмента было исследовано до18 года. В недавнем исследовании впервые было подтверждено использование анализа CEI для определения противовирусной активности нескольких ингибиторов ZIKV в клетках A54919. В этой статье о методах более подробно описывается этот анализ CEI и распространяется на различные адгезивные клеточные линии, а также на различные штаммы ZIKV при различных кратностях инфекции (MOI). Таким образом, показано многостороннее использование этого метода в противовирусных исследованиях флавивирусов. Метод имеет решающее преимущество мониторинга клеток в режиме реального времени, что позволяет обнаруживать важные моменты времени инфекции и динамическую ингибирующую активность потенциальных противовирусных соединений. Взятые вместе, технология CEI предлагает мощный и ценный инструмент, дополняющий текущий спектр противовирусных методологий.
В этой статье описывается использование анализа CEI в противовирусных исследованиях ZIKV. Преимущество анализа заключается в мониторинге в режиме реального времени и, следовательно, может использоваться для оценки кинетики инфекции ZIKV и ингибирования противовирусных препаратов селективными соединениями. Данные, полученные с помощью этого метода, позволяют объективно и визуально наблюдать за вирус-индуцированным CPE и эффективностью потенциального противовирусного соединения.
Поскольку CEI является очень чувствительным методом, при проведении этого клеточного анализа необходимо соблюдать большую осторожность. Крайне важно, чтобы проводилось точное пипетирование, чтобы максимально избежать вариаций пипетирования. Кроме того, другие факторы, которые могут повлиять на результаты эксперимента, такие как количество клеток и используемый вирусный запас, должны оставаться постоянными между повторениями эксперимента. Это факторы, которые сильно влияют на кинетику роста и инфекции клеток и, следовательно, могут привести к изменению расчетных значений CIT50 и/или других параметров.
При выполнении анализа CEI в присутствии (потенциальных) противовирусных соединений важно определить, влияют ли они на импеданс клеток в отсутствие вируса. Этот метод настолько чувствителен, что изменения импеданса могут быть измерены значительно ниже цитотоксических концентрацийсоединения 19.
Хотя в этой статье показаны только данные ZIKV, анализ может быть легко применен к другим цитопатогенным (flavi) вирусам с минимальными усилиями по оптимизации, такими как определение оптимальной частоты мониторинга CEI. Адаптация анализа CEI была использована с различными вирусами человека и животных, такими как чикунгунья, грипп А, а также вирусы герпеса человека и лошадей25,26,27,28. Здесь он также используется в качестве простого метода для количественного определения титров вируса или для идентификации противовирусных соединений. В этих исследованиях использовался анализ клеток в реальном времени, альтернативный метод CEI.
Использование технологии CEI ограничено типами адгезивных ячеек, поскольку принцип анализа основан на свойствах адгезивных ячеек распространяться по лункам, встроенным в электроды. Поверхностные покрытия лунок, такие как фибронектин, могут быть использованы для улучшения прикрепления клеток29. У методики есть и другие недостатки, первый из которых связан с ее стоимостью. Помимо инвестиций в устройство мониторинга CEI и сопутствующее оборудование и программное обеспечение, расходные материалы также несколько дороги. Кроме того, поскольку протокол требует мониторинга вирусной инфекции в течение нескольких дней, можно оценить одну 96-луночную пластину в неделю. Вместе с высокой стоимостью это ограничивает использование настройками низкой и средней пропускной способности.
Из-за этих проблем с пропускной способностью технология не подходит для настроек антивирусного скрининга. Тем не менее, он очень привлекателен на начальных экспериментальных этапах, например, при оценке восприимчивости клеток для изучения инфекции ZIKV в определенных условиях, связанных с заболеванием. Технология также полезна с трансфицированными или нокаутированными клеточными линиями, чтобы легко наблюдать изменения в кинетике инфекции, например, при наличии или отсутствии определенных рецепторов входа. Это интересно при исследовании участия клеточных факторов в инфекции ZIKV. Кроме того, на более поздних доклинических этапах, когда был выбран определенный ведущий кандидат, анализ CEI может быть использован для дальнейшей углубленной характеристики выбранного соединения. Биосенсоры CEI также могут быть модифицированы путем иммобилизации определенных элементов биораспознавания, таких как вирус-специфические антитела, для обнаружения вирусов18. В целом это подчеркивает универсальное использование CEI в условиях вирусологии.
The authors have nothing to disclose.
Авторы благодарят Клемана Хеймана и Горрита Луцма за корректуру рукописи. Исследование было поддержано внутренними грантами Лаборатории вирусологии и химиотерапии (Rega Institute, KU Leuven).
A549 cells | American Type Culture Collection (ATCC) | CCL-185 | These cells are cultured in MEM Rega-3 supplemented with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 0.075% sodium bicarbonate. |
Acridine Orange/Propidium Iodide Stain | Logos Biosystems | F23001 | Live/dead stain |
Cellstar polypropylene tubes, 15 mL | Greiner bio-one | 1,88,271 | |
Cellstar polypropylene tubes, 50 mL | Greiner bio-one | 2,27,261 | |
Dulbecco's Modified Essential Medium (DMEM) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 41965-039 | Cell culture medium for U87 and HEL 299 cells |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
ECIS cultureware 96W20idf | Applied BioPhysics | 96W20idf PET | Assay plate for CEI device |
Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) Z array station | Applied BioPhysics | CEI device, including 96 well station, external control module and laptop with control, acquisition and display software. The necessary software is installed before shipment. NOTE: this device is currently out of production and has been replaced by the more advanced ECIS Z-Theta device | |
Falcon polystyrene tubes, 5 mL | Corning | 352054 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SV30160.03 | Cell culture medium additive for all used cells |
HEL 299 cells | ATCC | CCL-137 | These cells are cultured in DMEM supplemented with 10% FBS and 0.01 M HEPES. |
HEPES buffer, 1 M | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15630-056 | Cell culture medium additive for U87 cells |
Labyrinthopeptin A1 | Kind gift from Prof. Dr. Roderich Süssmuth, Technische Universität Berlin, Germany | Antiviral compound used as an example in this protocol. It is dissolved in DMSO. | |
L-Glutamine, 200 mM | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | Cell culture medium additive for A549 cells |
Luna cell counting slides | Logos Biosystems | L12001 | |
Luna-FL dual fluoresence cell counter | Logos Biosystems | L20001 | Cell viability counter |
Minimum Essential Medium Rega-3 (MEM Rega-3) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 19993013 | Cell culture medium for A549 cells |
Sodium Bicarbonate, 7.5% | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 25080-060 | Cell culture medium additive for A549 cells |
Tissue culture flask T75 | TPP | Y9076 | |
Trypsin-EDTA, 0.25% | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 25200-056 | Dissociation reagent |
U87 cells | ATCC | HTB-14 | These cells are cultured in DMEM supplemented with 10% FBS and 0.01 M HEPES. |
Virkon Rely+On tablets | Lanxess | 115-0020 | Disinfectant sollution |
Zika virus (ZIKV) MR766 | ATCC | VR-84 | ZIKV prototype strain, isolated from sentinel Rhesus monkey in Uganda in 1968 |
ZIKV PRVABC59 | ATCC | VR-1843 | ZIKV strain isolated from patient in Puerto Rico in 2015 |