ヒト人工多能性幹細胞の成熟免疫表現型を有する脳微小血管内皮細胞様細胞への分化

図1:プロトコルの概要。 この原稿は、hiPS細胞をEECM-BMEC様細胞に分化させるための段階的なプロトコルを提示しています。適切なスキームは、各ステップでの細胞集団を示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 hiPScラインHPS1006は、文部科学省の国家バイオリソースプロジェクトを通じて理研BRCから提供されました。 1. 内皮前駆細胞(EPC)へのhiPS細胞分化誘導 細胞外マトリックス(ECM)コーティングプレートおよび試薬基底膜マトリックスコーティング12ウェルプレートを調製し、2.5 mgのマトリックスゲルを50 mL遠沈管に分注し、-20°Cで最大6か月間保存します。冷蔵庫(4°C)に保管した冷たいダルベッコの改質イーグル培地/栄養混合物F-12(DMEM / F12)30mLをチューブに加えます。ゲルが溶けるまでピペッティングで穏やかに混合し、12ウェルプレートの各ウェルに500 μLの溶液を加えます。プレートをインキュベーター(37°C、5%CO2)に少なくとも1時間入れます。注意: 基底膜マトリックスゲルは温度に敏感であり、分注とプレートコーティングに関する製造元の指示に従って取り扱う必要があります。細胞外マトリックスタンパク質の濃度はバッチ間で変化し得る。正確さを確実にするために、正確な濃度は、ロット番号を使用して、特定のバッチの品質証明書シートで参照する必要があります。たとえば、正確な濃度が10.0 mg / mLの場合、250 μLのゲルを使用して合計2.5 mgになります。 ROCK阻害剤を滅菌水に10mMの濃度になるように溶解することにより、rhoキナーゼ(ROCK)阻害剤ストック溶液を調製する(表1)。ストック溶液を100〜200μLの容量で分注し、凍結融解サイクルを避けるために-20°Cで保存します。 5 gのL-アスコルビン酸を50 mLの滅菌水に溶解してL-アスコルビン酸の100 mg/mLストック溶液を作り、-20°Cで保存します(表1)。6.25 mLのグルタミンと305 μLのL-アスコルビン酸ストック溶液を500 mLの高度なDMEM / F12に加え、LaSR培地24 を作成します(表1)。2〜8°Cで最大2週間保管します。 CHIR99021を希釈していないジメチルスルホキシド(DMSO)に終濃度10 mMまで溶解することにより、CHIR99021溶液を調製します(表1)。凍結融解サイクルを避けるために溶液を100〜200μLの容量に分注し、-20°Cで最大1年間保管します。ストック溶液の作業アリコートを4°Cで最大1か月間保存します。 450 mLのDMEM/F12に50 mLの熱不活化ウシ胎児血清を加えて、DMEM/F12-10培地を調製します。培地を2〜8°Cで最大1か月間保管します(表1)。 33.3 mLの7.5%ウシ血清アルブミン(BSA)を467 mLのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に加えて、フローバッファー-1を調製します(表1)。2〜8°Cで最大6か月間保管します。 特異化ヒジPS細胞の播種とEPC分化のための拡大(-3日目から-1日目)6ウェルプレート内のhiPSCコロニーが自発分化を示さず、継代に適した密度(通常は約80%のコンフルエンシー(2.5-3.5 x 106 細胞))である場合に分化を開始します。顕微鏡下で自然分化細胞を注意深く監視し、未分化細胞を排除するために複数の継代が必要かどうかを確認します。細胞培養培地および細胞外マトリックスに関する情報については、ステップ1.4.15以下の注を参照してください。 培地を吸引し、1 mLの解離試薬をウェルに加え、37°Cで5〜7分間インキュベートします。 解離試薬溶液をウェルの表面に2〜3回穏やかにピペッティングすることにより、細胞を解離および単数化します。 剥離した細胞を4 mLのhiPSC維持培地を含む15 mLチューブに移し、細胞を完全に再懸濁します。細胞計数用に10 μLのアリコートを予約します。 20〜25°Cで200 x g で5分間遠心分離することにより、細胞をペレット化します。 細胞をカウントし、基底膜マトリックスコーティングされた12ウェルプレートで適切な密度のhiPSC(ウェルあたり75-400 x 103 )を達成するために必要な体積を計算します(ステップ1.1.1)。 ウェルからコーティング溶液を吸引し、10 μM ROCK阻害剤を含む1 mLのhiPS細胞培地を各ウェルに加えます(1:1,000希釈)。遠心分離後、上清を吸引し、1 mLのhiPS細胞培地でペレットを解離させます。 ステップ1.2.4で決定した必要量のhiPSCを12ウェルプレートの各ウェルに追加します。2〜4枚の12ウェルプレートで、hiPSCクローンを鑑別するのに十分であり得る。ステップ1.2.4を参照して、細胞の播種に必要なプレートの数を決定します。 プレートをインキュベーター(37°C、5%CO2)に入れる。プレートをゆっくりと前後にスライドさせてからインキュベーター内で左右にスライドさせて、細胞を均等に分配します。 翌日(すなわち、−2日目)に、ROCK阻害剤を欠く2mLのhiPSC維持培地と培地を交換する。翌日(-1日目)に、培地を2 mLの新鮮なhiPS細胞維持培地と交換します。 グリコーゲンシンターゼキナーゼ3(GSK-3)阻害剤CHIR99021によるEPCの誘導(0日目から5日目)0日目に、各ウェルのhiPSC維持培地を8 μM CHIR99021を含む2 mLのLaSR培地と交換します。 1日目に培地を吸引し、8 μM CHIR99021を含む新しいLaSR培地2 mLを加えます。 2日目、3日目、および4日目に、培地をCHIR99021を含まない2mLの新しいLaSR培地と交換します。 CD31を精製するための磁気活性化細胞ソーティング(MACS)+ EPC (5日目)5日目に、培地を吸引し、次に1 mLの解離試薬を各ウェルに加えた後、37°Cで6〜8分間インキュベートします。 マイクロピペットで細胞を解離して単離し、40 μmのセルストレーナーを通過させて、10 mLのDMEM/F12-10培地を含む50 mLチューブに懸濁液をろ過します。2つ以上の12ウェルプレートから採取した細胞懸濁液を、少なくとも2つの50 mLチューブにろ過します。 DMEM/F12-10培地(最大50 mL)を加えて消化反応を停止します。徹底的にピペットし、細胞をカウントするために10 μLを予約します。20〜25°Cで200 x g で5分間遠心分離することにより、細胞をペレット化します。 上清を除去した後、10 mLのDMEM/F12-10培地を加え、細胞懸濁液を新しい15 mLチューブに移します。20〜25°Cで200 x g で5分間遠心分離することにより、細胞をペレット化します。 上清を吸引し、バッファー100 μLあたり1.0 x 107 細胞の密度でフローバッファー-1に再懸濁します。 FcRブロッキング試薬を1:100の比率で添加し、5分間インキュベートしてから、1:200に希釈したフルオレセインイソチオシアネート(FITC)標識CD31抗体を添加します。懸濁液を20〜25°Cの暗所で30分間インキュベートする。 10 mLのフローバッファー-1を追加し、フローサイトメトリー分析用に10 μLの懸濁液を予約して、CD31+ 細胞の画分を測定します(図2)。 200 x g で20-25°Cで5分間遠心分離することにより、細胞をペレット化します。 その後、上清を除去し、フローバッファー-1溶液100 μLあたり7 細胞1.0 x 10の密度に再懸濁します。FITCセレクションカクテル(細胞懸濁液100 μLあたり5 μL)を追加します。ピペッティングで十分に混合し、暗所で20〜25°Cで15分間インキュベートします。 細胞懸濁液100 μLあたり5 μLの磁性ナノ粒子を加え、よくピペットでピペットし、暗所で20〜25°Cで10分間インキュベートします。 細胞懸濁液を5 mLフローサイトメトリーチューブに移し、フローバッファー-1を加えて総容量2.5 mLにします。フローサイトメトリーチューブを磁石に5分間入れます。 連続運動で磁石を反転させ、FITC-CD31抗体で標識されていない細胞を含む細胞懸濁液をデカントします。磁石とチューブを逆位置に2〜3秒間維持してから、残りの液体を取り除きます。チューブを直立位置に戻す前に、チューブの端にある液滴を吸引します。 マグネットからフローサイトメトリーチューブを取り出し、2.5 mLのフローバッファー-1を加えて残りのCD31+ 細胞を洗浄します。細胞を2〜3回穏やかに上下にピペッティングして、細胞を再懸濁します。フローチューブを磁石に5分間入れます。 手順1.4.11〜1.4.12を3回繰り返してから、手順1.4.11をもう一度繰り返して、合計4回の洗浄を行います。 フローチューブを磁石から取り外し、指示量の適切な培地(例:拡張EC培養用のヒトリンパ管内皮無血清培地[hECSR]または凍結用の凍結培地)をチューブに加えて、精製CD31+ 細胞を再懸濁します。懸濁液の10 μLアリコートを2つ予約し、1つは細胞計数用、もう1つはフローサイトメトリー分析を実行して、MACS後のサンプル中のCD31+ 細胞の純度を評価します(図2)。フローサイトメーターがすぐに利用できない場合は、分析までアリコートを4°Cで保存してください。 次の手順(手順2まで)をすぐに実行できない場合は、この時点でCD31+ EPCをフリーズします。EPCの拡張と選択継代については、ステップ2に進みます。注:基底膜マトリックスコーティングプレートおよびhiPSC維持培地(mTeSR1)の代わりに、ビトロネクチン25コーティング12ウェルプレートおよびより安定したhiPSC維持培地(mTeSRプラス)を使用できます。ビトロネクチンコーティング12ウェルプレートを調製するには、ビトロネクチンを希釈バッファーで最終濃度10 μg/mLに希釈し、500 μLの希釈溶液を12ウェルプレートの各ウェルに移します。プレートを20〜25°Cで少なくとも1時間放置します。特異化されたhiPS細胞の播種密度は、基底膜マトリックスコーティングプレートに使用されるものに匹敵します。培地またはマトリックス組成を変更すると、hiPS細胞の増殖および自発的分化に影響を与える可能性があり、通常、新しい培養条件に適応するのに1〜2週間かかります。より安定なhiPSC維持培地をhiPSC維持に用いる場合、この培地をhiPSC維持培地の代わりにEPC分化に用いることができる。この場合、ROCK阻害剤を除去するために、より安定したhiPSC維持培地を-2日目に交換する必要があり、-1日目の交換はスキップできます。 2. 脳微小血管内皮細胞様細胞(BMEC様細胞)と平滑筋様細胞(SMLC)を分化させるための拡張内皮細胞培養法(EECM) コラーゲンコーティングプレートおよび試薬の調製結晶化コラーゲンIV型5 mgを滅菌水5 mLに溶解して、コラーゲンコーティング6ウェルプレートを調製します。4°Cで一晩インキュベートしてから、分注して-20°Cで保存します。 コラーゲンIVを滅菌水で1:100に希釈して10 μg/mL溶液を生成し、1 mLの10 μg/mLコラーゲンIV溶液を6ウェルプレートの各ウェルに追加します。プレートを37°Cで少なくとも30分間インキュベートします。 プレートは37°Cで最大1週間保存できます。 5 mLのFGFをダルベッコPBS5 mLに溶解してヒト線維芽細胞増殖因子2(FGF2)のストック溶液を調製し、最終濃度0.1%になるように7.5%BSAを添加し、ストック溶液を20〜200 μLの容量に分注します。これらは-20°Cで最大3ヶ月間保存できます(表1)。ストック溶液は4°Cで最大1ヶ月間保存できます。凍結融解サイクルを避けてください。98 mLのhECSR培地に2 mLのB-27サプリメントと20 μLのFGF2を加えて、hECSR培地を調製します(表1)。hECSR培地は、2〜8°Cで最大2週間保存できます。 30 mLのhECSR培地に15 mLのウシ胎児血清、5 mLのDMSO、および25 μLのROCK阻害剤溶液を加えて、EPC、EECM-BMEC様細胞、およびSMLC用の凍結培地を準備します(表1)。凍結培地は、2〜8°Cで最大2週間保存できます。 拡張内皮細胞培養のためのEPCの播種6ウェルプレートからコラーゲン溶液を除去します。次に、5 μM ROCK阻害剤を含む2 mLのhECSR培地(1:2,000希釈)に1.0-2.0 x 105 精製CD31+ EPCを移します。プレートをインキュベーター(37°C、5%CO2)に入れる。プレートを前後にゆっくりとスライドさせてから左右にスライドさせて、セルを均等に分配します。 翌日、ROCK阻害剤を含むhECSR培地を除去し、ROCK阻害剤を含まない新鮮なhECSR培地2mLを加える。100%コンフルエントに達するまで、hECSR培地を1日おきに交換します。注意: 週末に定期的な給餌スケジュールを維持できない場合は、週の最後の営業日の夕方と週末の後の早朝に培地を交換することができます。 EECM-BMEC様細胞およびSMLCを精製するための選択的継代ECと非EC集団の混合物を含む6ウェルプレートからhECSR培地を除去します。各ウェルに1 mLの解離試薬を加えます。 顕微鏡下で細胞の形態を注意深く監視します。EC(非ECではない)が明るく丸く見える場合(通常は2〜5分以内)、プレートの端をタップしてECCを取り外します。ほとんどの非ECはプレートに取り付けられたままです。 マイクロピペットを使用して切り離されたECを収集し、非ECを再懸濁しないように注意してください。ECを、解離試薬1 mLあたり4 mLのDMEM/F12-10を含む15 mLまたは50 mLの遠沈管に移します。 残りの結合した非ECを含むウェルに2 mLのhECSR培地を加えてSMLCを確立します。 プレートをインキュベーターに置きます。 EC懸濁液を遠沈管にピペットで入れて完全に混合し、細胞計数用に10 μLの懸濁液を予約します。残りの細胞を20-25°Cで200 x g で5分間遠心分離します。 ペレットから上清を取り除き、1.0-2.0 x 105 ECあたり2 mLのhECSR培地を追加します。 新しい6ウェルプレートからコラーゲンIV溶液を取り出したら、2mLのEC懸濁液を各ウェルに加え、続いて5%CO2と共に37°Cでインキュベートした。プレート内の細胞を均等に分配するには、インキュベーターの棚の上で前後左右にゆっくりと動かします。 ECが100%コンフルエンシーに達するまで、hECSR培地を1日おきに交換します。 純粋なEC単層が得られるまで、ステップ2.3.1〜2.3.7を繰り返します。次の手順を実行できない場合は、CD31+ ECをフリーズします(手順2.4.2を参照)。EC機能を分析するには、手順3に進みます。注:一般に、機能解析に適したECのほぼ純粋な培養物を得るには、2〜3回の選択継代が必要であり、これらの細胞をEECM-BMEC様細胞と見なしています。5〜6回以上の継代の後、細胞増殖は通常遅くなりますが、この変数はhiPSC株に依存します。 SMLCを培養するには、hECSR培地を1日おきに交換します。SMLC馴化培地(CM)を収集するには、培地を交換するたびに、収集した培地を0.22 μmフィルターに通します。CMは、EECM-BMEC様細胞のVCAM-1発現をアップレギュレートするために使用できます。SMLC が 100% コンフルエンシーに達するまで SMLC-CM をプールします。 EPC、EECM-BMEC様細胞、SMLC凍結保存および解凍EPCを凍結するには、最後のMACS洗浄(ステップ1.4.13)に続いて、EPCをhECSR培地ではなく凍結培地に1.0〜2.0 x 106 細胞/ mLの密度で再懸濁します。1 mLの細胞懸濁液をクライオチューブに分配します。クライオチューブを制御された速度凍結装置に入れ、すばやく-80°Cに移します。 長期保存の場合は、凍結後24〜48時間でチューブを液体窒素タンクに移動します。 EECM-BMEC様細胞およびSMLCを凍結するには、ウェルから培地を除去した後、解離試薬(1 mL /ウェル)を添加し、細胞が剥離するまでプレートを5%CO2 で37°Cでインキュベートします(EECM-BMEC様細胞およびSMLCの場合はそれぞれ5〜7分および20〜30分)。解離試薬1 mLあたり4 mLのDMEM/F12-10を含む15 mLまたは50 mLの遠沈管で細胞を収集します。 ピペットで十分に混合し、細胞計数用に10 μLの細胞懸濁液を予備します。200 x g で20-25°Cで5分間遠心分離することにより、細胞をペレット化します。 上清を除去し、細胞を凍結培地に1.0-2.0 x 106 細胞/mLの密度まで完全に再懸濁します。1 mLの細胞懸濁液を新しいクライオチューブに分配します。 クライオチューブを制御された速度凍結装置に入れ、すぐに-80°Cに移します。 長期保存のために、チューブは凍結後24〜48時間で液体窒素タンクに移すことができる。 EPC、EECM-BMEC様細胞、およびSMLCを解凍する場合は、クライオチューブのバイアルを手の間で転がすか、細胞がほぼ完全に解凍されるまで37°Cの水浴中でインキュベートします。500 μLのDMEM/F12-10を加え、4 mLのDMEM/F12-10培地を含む15 mLチューブに細胞懸濁液を静かに移します。1 mLのDMEM/F12-10を加えてクライオチューブを1回洗浄し、細胞を200 x g で20-25°Cで5分間遠心分離します。 上清を吸引し、5 μM ROCK阻害剤(1:2,000希釈)を含む2 mLのhECSR培地にペレットを再懸濁して、EPCの場合は2 mLあたり1.0〜2.0 x 10 5細胞、EECM-BMEC様細胞およびSMLCの場合は2 mLあたり2.0〜3.0 x 105細胞の密度に再懸濁します。 コラーゲン溶液を吸引した後、コラーゲンコーティングされた6ウェルプレートのウェル間で細胞懸濁液を分配します。 プレートを37°C、5%CO2 のインキュベーターの棚上でゆっくりと前後に動かし、次に左右に動かして、ウェル内の細胞を均等に分散させます。 翌日、ROCK阻害剤を欠く新鮮なhECSR培地と培地を交換する。100%コンフルエンシーが達成されるまで、hECSR培地を1日おきに交換します。次に、EPCの選択的継代(ステップ2.3を参照)およびEECM-BMEC様細胞の機能解析(ステップ3を参照)に進みます。分子特性評価および機能アッセイを行う前に、EECM-BMEC様細胞は100%コンフルエントである必要があり、これは通常、融解後2〜3日で達成される。 3. EECM-BMEC様細胞およびSMLCの検証 低分子トレーサーの透過性アッセイEECM-BMEC様細胞バリアの完全性を評価するには、フルオレセインナトリウム透過性を測定することによって、西原ら26が記載したようにする。EECM-BMEC様細胞をフィルターインサートに播種して、完全な単層を発達させ、フルオレセインナトリウムの透過性を測定します。 重要な分子を評価するための免疫蛍光染色。単層またはSMLCのEECM-BMEC様細胞の接合分子、接着分子、または細胞骨格タンパク質の発現をモニターするための免疫蛍光染色には、チャンバースライド、96ウェルプレート、またはインサートフィルター付きメンブレンを使用します。西原ら26に記載されているように、炎症性サイトカイン刺激の有無にかかわらず、細胞表面接着分子のEECM-BMEC様細胞発現を評価します。 EECM-BMEC様細胞上の細胞表面接着分子の発現を解析するためのフローサイトメトリーフローサイトメトリーを使用して、ICAM-1、ICAM-2、VCAM-1、P-セレクチン、E-セレクチン、CD99、および血小板内皮細胞接着分子-1(PECAM-1)を含むCNSへの免疫細胞移動に関与する細胞表面接着分子の半定量的発現を評価します。EECM-BMEC様細胞をSMLC馴化培地を用いて炎症性サイトカインの存在下および非存在下で16〜18時間培養する。 機能的接着分子の発現を評価するための静的条件下での免疫細胞接着アッセイ西原ら26 に記載の方法を用いて、EECM-BMEC様細胞の細胞表面接着分子が機能しているか否かを判定する。 簡単に説明すると、EECM-BMEC様細胞を5.5 x 104 / cm2 のチャンバースライドに播種し、コンフルエントになるまで増殖させます。約24時間後、炎症誘発性サイトカインの存在下または非存在下で培養培地をSMLC馴化培地に変更し、EECM-BMEC様細胞をさらに16時間インキュベートします。 実験当日、凍結保存された免疫細胞(T細胞または末梢血単核球[PBMC]など)をT細胞洗浄バッファー(表1)で解凍し、T細胞培地中の蛍光色素(細胞トラッカー色素など)で標識します(表1)。免疫細胞用の培地の最適化は、研究対象の特定の種類の免疫細胞に合わせて調整する必要があります。 16ウェルチャンバースライドで、EECM-BMEC様細胞に2 x 104 Th1細胞を追加します。具体的には、Th1細胞などのエフェクターT細胞を用いた場合、PBMCと比較してEECM-BMEC様細胞へのより大きな接着を示すことが観察されている(西原ら[2022])。したがって、EECM-BMEC様細胞に添加されるPBMCの数は、純粋なエフェクターT細胞と比較して多くする必要があります。 単層のEECM-BMEC様細胞を用いて免疫細胞を遊走アッセイ培地中で30分間インキュベートする(表1)。30分後、スライドを穏やかに洗浄し、ダルベッコのPBSが入っているジャーに浸して2回洗浄し、続いて2.5%グルタルアルデヒド溶液で4°Cで2時間固定します。 固定後、ダルベッコのPBSが入った瓶に浸してスライドを2回洗い、カバーガラスで取り付けます。続いて、EECM-BMEC様細胞単層に付着した免疫細胞を計数するためのスライド上の単層の中心の蛍光顕微鏡画像を取得する。