In Vivo Mikroenjeksiyon ve Elektroporasyon Kullanan Somatik Genom Mühendisliği Fare Modelleri

Hayvanlar, tip II biyogüvenlik kabini içeren özel bir odada bulunan filtre üstlü statik mikroizolasyon kafeslerine yerleştirildi. Tüm hayvan çalışmaları kurumsal yönergelere uygun olarak gerçekleştirildi ve McGill Üniversitesi Tıp ve Sağlık Bilimleri Fakültesi Hayvan Bakım Komitesi (AUP #7843) tarafından onaylandı. 1. Mikroenjeksiyon iğne hazırlama Aşağıdaki programa sahip bir mikropipet çektirici kullanarak bir cam kılcal boruyu keskin bir noktaya çekin: P = 500, Isı = 576, PULL = 50, VEL = 80, DEL = 70. Bir çift konik ultra ince uçlu forseps kullanarak, Şekil 1A, B’de gösterildiği gibi bir açıklık oluşturmak için diseksiyon mikroskobu altında çekilen kılcal tüpün sivri ucunu kırpın. Açıklığın çok büyük olmadığından emin olun, çünkü bu yumurta kanalına zarar verir ve yavaş enjeksiyonu önler. Resim 1: Mikroenjeksiyon iğnesi hazırlama. (A,B) Bir açıklık (B) oluşturmak için kesilen sivri uçlu (A) çekilmiş kılcal boru. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. 2. İntraperitoneal enjeksiyon için anestezinin hazırlanması Ameliyat gününde filtrelenmiş, seyreltilmiş avertin hazırlayın. Avertin (2,2,2-tribromoetanol) stok çözeltisi, tert-amil alkol içinde 1,6 g/mL konsantrasyonda kuvvetli bir şekilde karıştırılarak hazırlanır ve karanlıkta saklanır. Avertin stok çözeltisini% 1.25 v / v izotonik salin ile bir duman davlumbaz içinde 20 mg / mL’lik bir nihai konsantrasyona kadar seyreltin. Seyreltilmiş vertiği vorteks edin ve 0,22 μm steril bir filtreden geçirin. Karanlıkta kalın. 3. Ameliyat alanının hazırlanması Ameliyat alanı özel steril bir ortam, tercihen temiz bir tezgah veya biyogüvenlik kabini olmalıdır. Steril cerrahi ekipmanı, mikroskop, mikromanipülatör ve elektroporatörü gerektiği gibi düzenleyin. Bunun bir örneği Şekil 2’de gösterilmiştir. Isıtma yastığını/diskini ısıtın ve temiz, tam donanımlı bir kafesin altına yerleştirin. Bu kafes, ameliyattan sonra fareleri barındırmak için kullanılacaktır. Steril bir petri kabına steril 1x fosfat tamponlu salin (PBS) dökün. Emici kağıdı yaklaşık 1 cm x 1 cm boyutlarında kareler halinde kesmek için bir çift temiz makas kullanın. Bu emici kağıt parçalarını ıslatmak için 1x PBS’ye bırakın. 4. Enjeksiyon için çözelti ve iğnenin hazırlanması Enjeksiyon solüsyonunu ameliyat günü hazırlayın. DNA / RNA / RNP’leri filtrelenmiş tripan mavisi ile her biri 200 ng / μL ve sırasıyla% 5’lik minimum nihai konsantrasyona kadar karıştırın. Enjeksiyondan önce oda sıcaklığında saklayın.NOT: Kullanmadan önce 0 tripan mavisi almak için 1 mL şırınga kullanın ve 0,22 μm steril filtreden süzün. Bundan böyle mikroenjeksiyon iğnesi olarak adlandırılan çekilmiş kılcal iğneyi, manyetik bir montaj ile stabilize edilmiş kelepçe montaj mikromanipülatörüne takın (kurulum Şekil 2B’de gösterilmiştir). Enjeksiyon çözeltisinin 2 μL’lik pipetini steril bir Petri kabına yerleştirin. Mikroskop altında gözlemlerken, mikromanipülatöre bağlı hava basınçlı şırıngayı kullanarak bu çözeltinin 1-2 μL’sini yavaşça mikroenjeksiyon iğnesine alın. Kabarcıklardan kaçının / mikroenjeksiyon iğnesine kabarcıklar alın. Şekil 2: Ameliyat alanı hazırlığı . (A) Temiz bir tezgah içinde ameliyat alanı kurulumu. (B) Sağ elini kullanan bir birey için diseksiyon mikroskobu ve mikromanipülatör kurulumu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. 5. Kadın üreme sisteminin açığa çıkarılması 6-8 haftalık bir dişi fareye, filtrelenmiş, seyreltilmiş avertin (anestezik) intraperitoneal olarak 0.25-0.5 mg / g dozunda anestezi uygulayın. Bunu takiben, karprofen (preemptif analjezik) deri altından 5 mg / kg’lık bir dozda uygulayın.NOT: Anestezik olarak kullanılabilecek diğer alternatifler izofluran veya ketamin / ksilazindir. Emici kağıdı temiz, ısıtılmış bir ped/disk üzerine yerleştirin. Ardından, anestezi uygulanmış fareyi sırt tarafı yukarı bakacak şekilde bu ısıtılmış emici kağıda yerleştirin. Ameliyat sırasında kurumayı önlemek için her göze göz kayganlaştırıcısı uygulayın.NOT: Elinizin arkasıyla test ederek ısıtma yastığının/diskinin hafifçe dokunulacak kadar sıcak olduğunu onaylayın. Anestezi uygulanan farenin ayak parmağını bir çift forseps ile sıkıştırarak derin anestezik arrest için test edin. Prospektif insizyon yerinin etrafındaki sırt kürkünü çıkarın ( Şekil 3A’da gösterilen yer) ve çıplak cildi antiseptik ile silin. Çıplak cildi sıkıştırmak için bir çift düz künt forseps kullanın ve bir çift steril keskin künt makas kullanarak vücut orta çizgisi boyunca 1 cm uzunluğunda bir kesi oluşturun. Kesi etrafındaki alanı antiseptik ile temizleyin. Bir çift steril Adson forseps kullanarak kesim bölgesinin bir tarafını sıkıştırın ve tutun. Daha sonra, bir çift steril kavisli tırtıklı forseps kullanarak, cildi orta hat insizyonundan başlayarak ve yanal olarak hareket ederek vücut duvarından yavaşça ayırın. Yağ yastığını böbreğin altına yerleştirin. Bir çift steril düz künt forseps kullanarak, vücut duvarını doğrudan yağ yastığının üzerine sıkıştırın. Kan damarlarından kaçınmaya özen göstererek, bir çift steril keskin sivri uçlu diseksiyon makası kullanarak vücut duvarında küçük bir kesi oluşturun. Vücut duvarını düz künt forsepslerle sıkıştırırken, insizyona bir çift steril künt kavisli forseps yerleştirin ve vücut duvarında oluşturulan kesiyi genişletin. Görünür yağ yastığını künt kavisli forseps ile tutun ve yumurtalık, yumurta kanalı ve uterusu ortaya çıkarmak için delikten dışarı çekin. Üreme sistemini açıkta tutmak için, yağ yastığını Şekil 3B’de gösterildiği gibi steril bir bulldog kelepçesi ile kelepçeleyin. 6. In vivo yumurta kanalı enjeksiyonu ve elektroporasyonu Isıtılmış emici kağıdı ve anestezi uygulanmış fareyi, diseksiyon mikroskobu sahnesine maruz kalan üreme sistemi ile dikkatlice yerleştirin, böylece yol gözlemlenebilir. Mikroskop altında gözlemlenen görünümün bir örneği Şekil 3B’de gösterilmiştir. Mikromanipülatörü ayarlayın, böylece çözelti içeren enjeksiyon iğnesi mikroskop altında da gözlemlenebilir. Bir çift steril konik ultra ince uç forseps kullanarak, enjekte edilecek yumurta kanalı bölgesini sabit tutun. Enjekte edilecek bölge mikroenjeksiyon iğnesinin yönüne uygun olmalıdır.NOT: Gerekirse, yolu yavaşça en uygun konuma getirmek / hareket ettirmek için yağ yastığını ve üreme sistemini sabitleyen bulldog kelepçesini kullanın. Mikromanipülatörü mikroenjeksiyon iğnesiyle yumurta kanalını delecek şekilde ayarlayın, aynı anda konik ultra ince uç forsepslerini kullanarak yumurta kanalını iğneye besleyin. Yumurtalık kanalına yerleştirildiğini doğrulamak için mikroenjeksiyon iğnesini yavaşça hareket ettirin.NOT: Birden fazla delinmeyi ve enjeksiyon çözeltisinin sızmasını önlemek için mikroenjeksiyon iğnesini sarmal yumurta kanalının dönüm noktası yerine düz bir segmente yerleştirin. Mavi çözeltinin hareketini ve mikroskop altında yumurta kanalı lümeninin genişlemesini gözlemlerken, yumurta kanalına yavaşça 1 μL’ye kadar çözelti enjekte edin. Lümenin içine herhangi bir kabarcık sokmamaya dikkat edin. 0 tripan mavisi enjekte edilen yumurta kanallarının temsili görüntüleri Şekil 3C,D’de gösterilmiştir. İğneyi yumurta kanalından çıkarın. Hedeflenecek alanı, steril 1x PBS’ye batırılmış bir parça emici kağıtla örtün (adım 3.3’ten itibaren). Önceden ıslatılmış kağıdı ve hedeflenecek alanı/bölgeyi bir çift elektrot cımbızıyla (hedeflenecek bölgenin boyutuna bağlı olarak 1 mm, 3 mm veya 5 mm) kavrayın ve darbe jeneratörü/elektroporatör üzerindeki bu ayarları kullanarak elektroporasyon yapmadan önce gövdeden çekin: 30 V, üç darbe, 1 s aralık, 50 ms darbe uzunluğu, tek kutuplu.NOT: Elektrotlar arasındaki mesafe, elektrotların yumurta kanalını deforme etmeden hedeflenen bölgeye kenetlenebileceği şekilde ayarlanmalıdır. Önerilen mesafe yaklaşık 1 mm’dir. Elektroporasyondan sonra, emici kağıdı çıkarın ve fareyi (ısıtılmış emici kağıt altındayken) tekrar bir ısı yastığına yerleştirin. Bulldog kelepçesini açın ve açıkta kalan üreme sistemini vücut duvarının altına dikkatlice geri itin. Diğer taraftaki üreme sistemini ortaya çıkarmak için bölüm 5’i tekrarlayın.NOT: Elektroporasyon, lümen çözelti ile doldurulduğu sürece fare östrus aşamasından bağımsız olarak başarılıdır. Açıkta kalan kanalı, kurumasını önlemek için steril 1x PBS’ye batırılmış emici kağıtla örtün, ardından 4.2 ve 4.3 adımlarını tekrarlayarak mikroenjeksiyon iğnesini ikinci enjeksiyon için hazırlayın.NOT: Mikroenjeksiyon iğnesini gerektiği gibi değiştirin. Gerektiğinde steril 1x PBS uygulayarak maruz kalan dokunun kurumasını önleyin. Yumurta kanalını karşı tarafa enjekte etmek ve elektroporat etmek için yukarıdaki adımları tekrarlayın.NOT: Göz kayganlaştırıcısını ameliyat sırasında ve sonrasında gerektiği gibi tekrar uygulayın. Her iki yumurta kanalı da elektroporate edildikten ve vücut duvarının altına geri yerleştirildikten sonra, dorsal insizyon bölgesini dikiş veya zımbalayın. Dikiş için, ipek örgülü dikişlerin iğnesini kavramak için bir hemostat kullanın (3/8 daire; ölçer: 5-0; iğne boyutu: 18 mm; iplik uzunluğu: 75 cm). Bir çift steril kavisli tırtıklı forseps kullanarak kesim bölgesinin bir tarafını sıkıştırın ve tutun, ardından yarayı kapatmak için dikişi manipüle etmek için hemostatı kullanın. Fareyi ısıtılmış bir pedin/diskin üzerine yerleştirilmiş temiz bir kafese taşıyın (adım 3.2’den itibaren) ve fare etkin olana kadar izleyin. Sonraki 3 gün boyunca her 24 saatte bir deri altından 5 mg / kg karprofen uygulayın ve sonraki 10 gün boyunca izleyin. Şekil 3: Kadın üreme sistemine maruz kalma ve mikroenjeksiyon. (A) Rosa-LSLtdDomates faresinin dorsal tarafındaki orta hat insizyonunun yeri (sarı çizgi olarak gösterilir). (B) Kadın üreme sistemine maruz kalma. Yağ yastığı, yolu sabitlemek ve açıkta tutmak için steril bir bulldog kelepçesi kullanılarak kelepçelendi. (C,D) İn vivo yumurta kanalı enjeksiyonunun temsili görüntüleri. Distal ampulla (AMP etiketli) içine bir mikroenjeksiyon iğnesi yerleştirildi ve sistem açıkta kalırken yumurta kanalı lümenine filtrelenmiş% 100 tripan mavisi enjekte edildi (C). Disseke edilmiş bir yumurta kanalının temsili görüntüsü, enjekte edilen tripan mavisi çözeltisinin distal ve proksimal oviduct lümeni (D) boyunca dağıldığını göstermektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.