Этот протокол описывает микроинъекцию и электропорацию in vivo для регионально ограниченного CRISPR-опосредованного редактирования генома в яйцеводе мыши.
Генно-инженерные модели мышей зародышевой линии (G-GEMM) предоставили ценную информацию о функции генов in vivo в развитии, гомеостазе и болезнях. Тем не менее, время и затраты, связанные с созданием и обслуживанием колонии, высоки. Недавние достижения в области CRISPR-опосредованного редактирования генома позволили генерировать соматические ГЭММ (S-ГЭММ) путем прямого нацеливания на интересующую клетку/ткань/орган.
Яйцевод, или фаллопиева труба у людей, считается тканью происхождения наиболее распространенного рака яичников, серозных карцином яичников высокой степени злокачественности (HGSC). HGSC инициируются в области фаллопиевой трубы дистальнее матки, расположенной рядом с яичником, но не проксимальным отделом фаллопиевой трубы. Тем не менее, традиционные мышиные модели HGSC нацелены на весь яйцевод и, таким образом, не повторяют состояние человека. Мы представляем метод микроинъекции раствора ДНК, РНК или рибонуклеопротеина (РНП) в просвет яйцевода и электропорации in vivo для нацеливания на эпителиальные клетки слизистой оболочки в ограниченных областях вдоль яйцевода. Существует несколько преимуществ этого метода для моделирования рака, таких как: 1) высокая адаптивность в нацеливании на область/ткань/орган и область электропорации, 2) высокая гибкость в целевых типах клеток (клеточная гибкость) при использовании в сочетании со специфическими промоторами для экспрессии Cas9, 3) высокая гибкость в количестве электропорированных клеток (относительно низкая частота), 4) не требуется специфическая линия мыши (иммунокомпетентное моделирование заболевания), 5) высокая гибкость в комбинации генных мутаций и 6) возможность отслеживания электропорированных клеток при использовании в комбинации с репортерной линией Cre. Таким образом, этот экономически эффективный метод повторяет инициацию рака человека.
Фаллопиева труба, называемая у мышей яйцеводом, представляет собой трубчатую структуру, которая соединяет матку с яичником. Он играет важную роль в размножении млекопитающих, обеспечивая среду для внутреннего оплодотворения и предимплантационного развития 1,2. Несмотря на его важность, мало что известно о его функции и гомеостазе, отчасти из-за развития методов экстракорпорального оплодотворения, позволяющих обойти любую проблему бесплодия, связанную с этим органом3. Тем не менее, было признано, что предраковые поражения серозной карциномы яичников высокой степени злокачественности (HGSC), агрессивного гистотипа рака яичников, на долю которого приходится около 75% карцином яичников и 85% связанных с ними смертей4, ограничены дистальным эпителием фаллопиевых труб 5,6,7,8 . Это указывает на то, что не все клетки в нашем организме одинаково восприимчивы к онкогенным воздействиям, а только уникальные/восприимчивые клетки в каждой ткани/органе становятся клетками происхождения рака, называемыми клеточной податливостью9. Таким образом, было показано, что эпителиальные клетки дистального отдела маточной трубы, расположенные рядом с яичником, отличаются от остальной части трубы10,11. Таким образом, традиционные мышиные модели HGSC, которые нацелены на все клетки яйцевода, не повторяют состояние человека. В недавнем исследовании мы использовали комбинацию CRISPR-опосредованного редактирования генома, электропорации яйцевода in vivo и отслеживания линий на основе Cre, чтобы успешно индуцировать HGSC путем мутации четырех генов-супрессоров опухолей в дистальном яйцеводемыши 12,13. В этой рукописи представлен пошаговый протокол, описывающий эту процедуру микроинъекции и электропорации in vivo для воздействия на эпителий слизистой оболочки яйцевода мыши.
Этот метод имеет ряд преимуществ. Он может быть адаптирован для воздействия на другие ткани/органы, включая паренхимуоргана 14. Хотя другие подходы к доставке генов in vivo, такие как лентивирусные и аденовирусные системы, могут быть использованы для достижения аналогичного тканеспецифического / органоспецифического нацеливания, область нацеливания легче регулировать с использованием различных размеров электродов пинцетного типа для доставки на основе электропорации. В зависимости от концентрации ДНК/РНК/рибонуклеопротеинов (РНП), параметров электропорации и размера электродов количество электропорированных клеток может быть изменено. Кроме того, конкретные типы клеток могут быть нацелены при использовании в сочетании с промоторами для экспрессии Cas9 без абсолютной необходимости в генетически модифицированных моделях мышей Germline (G-GEMM). Кроме того, в отличие от систем доставки вирусов, электропорация позволяет многократно доставлять плазмиды в отдельные клетки и меньше ограничивать размер вставной ДНК15. Скрининг генных мутаций in vivo также может быть выполнен с относительной легкостью из-за этой высокой гибкости. Кроме того, электропорированные ячейки могут быть отслежены или прослежены, когда этот метод используется в сочетании с репортерными линиями Cre, такими как Tdtomato или Confetti16,17.
Важнейшими шагами в этом подробном протоколе являются микроинъекция раствора ДНК/РНК/РНП в просвет яйцевода и контроль силы и площади электропорации. Утечка раствора ДНК/РНК/РНП во время микроинъекции может вызвать трансфекцию нежелательных участков/клеток. Для последовательной и эффективной электропорации предпочтительно заполнять раствором просвет яйцевода (рис. 3C, D). Это связано с тем, что область электропорации в основном контролируется размером и размещением электродов. Слабая электропорация уменьшает количество электропорированных клеток, а жесткая электропорация может вызвать электропорацию нежелательных клеток или нарушить структуру ткани. Количество электропорированных клеток можно варьировать, регулируя концентрацию раствора ДНК/РНК/РНП или параметры электропорации. Однако, поскольку высокое напряжение / тепловыделение во время электропорации может повредить ткань, эти параметры следует проверить перед использованием на живых/анестезированных мышах. Наконец, из-за сложного характера этой процедуры рекомендуется практиковать воздействие на тракт и микроинъекции на мертвых мышах перед выполнением этой операции на живых / анестезированных мышах.
Признано, что несколько генов участвуют в инициации рака, поэтому повторение этого события требует мультиаллельной модификации нескольких генов. Кроме того, известно также, что не все клетки одинаково восприимчивы к онкогенным мутациям9. Таким образом, моделирование рака требует определенных линий мышей Cre для достижения жесткого контроля онкогенных повреждений. Однако их доступность и специфичность вызывают различные проблемы, включая воздействие на нецелевые ткани и летальность19. Кроме того, традиционные G-GEMM несут высокие затраты на техническое обслуживание и требуют времени для генерации мышиной линии. Разработка технологии редактирования генома CRISPR/Cas9 и улучшение доставки генов в специфические соматические клетки позволили нам преодолеть эти проблемы. В этом протоколе мы представляем метод доставки ДНК/РНК/РНП для манипуляций с соматическим геномом, который может быть использован для моделирования рака без абсолютной необходимости в конкретных линиях мыши12. Путем инъекции растворов ДНК/РНК/РНК в просвет и использования электродов типа пинцета разного размера для доставки на основе электропорации нацелены на ограниченные участки эпителия слизистой оболочки яйцевода мыши (рис. 4A-F). Это особенно полезно при моделировании инициации HGSC, которые происходят из дистального конца фаллопиевой трубы.
Представленный метод микроинъекций и электропорации in vivo очень универсален для нацеливания просвета на ткани/органы. Паренхима органа также подвержена нацеливанию с помощью этого метода14. Подходы к доставке вирусов, такие как лентивирусная и аденовирусная системы, также могут использоваться для аналогичных целей. Однако преимущества электропорации по сравнению с подходами к вирусной доставке заключаются в следующем: 1) многократная доставка плазмиды в отдельные клетки, 2) отсутствие ограничений на размер вставки15 и 3) простой контроль площади и времени доставки. Кроме того, специфичность таргетинга может быть улучшена за счет использования промоутеров, специфичных для линии. Иногда это затруднительно в вирусных системах из-за ограничения на вирусную упаковку.
Как и природа электропорации, электропорированные эпителиальные клетки случайным образом перемежаются со здоровыми, неотредактированными клетками (рис. 4G). Тем не менее, этот мозаицизм в генетически модифицированных и немодифицированных клетках может быть полезен для изучения инициации рака, поскольку он повторяет спорадический характер ранней инициации рака в иммунокомпетентном микроокружении. Частоту электропорированных клеток можно регулировать, изменяя концентрацию раствора ДНК/РНК/РНП и/или параметры электропорации. Используя CRISPR-Cas-опосредованное редактирование генов в сочетании с представленным протоколом, легко проводить скрининг нескольких генов и генерировать гетерогенные паттерны мутаций/аллельных комбинаций в целевых генах; это особенно полезно при моделировании рака, который проявляется значительным количеством геномных изменений, таких как HGSCs20,21. Кроме того, секвенируя гены-мишени во время прогрессирования рака, можно проследить клональную эволюцию опухолей и метастазов in vivo у иммунокомпетентных мышей12.
The authors have nothing to disclose.
Авторы благодарят Кэти Тенг и доктора Мэтью Форда за предоставление плазмид, используемых для получения репрезентативных результатов и оптимизации протокола. К.Х. был поддержан докторским грантом Fonds de recherche du Québec – Santé (FRQS), Фондом Доннора, Всемирной стипендией Delta Kappa Gamma, Центром исследований в области репродукции и развития (CRRD), аспирантами Хью Э. Берка, Роланда и Марселя Госселина и Александра Макфи.
0.22 µm sterile filter unit | LifeGene | SF0.22PES | |
1 mL syringe | Terumo Medical Corportation | SS-01T | |
1 mm tweezer-type electrodes | BEX CO., LTD | LF650P1 | |
3 mm tweezer-type electrodes | BEX CO., LTD | LF650P3 | |
30G x 1/2 Needle | BD | 305106 | Needle is attached to the 1 mL syringe when using injectable anesthetic or analgesic. |
Adson forceps | Fisher Scientific | 10-000-451 | |
Air-pressured syringe | BD | B302995 | Attached to the micromanipulator; as shown in Figure 2B |
Analgesic | – | – | Carprofen, dose: 5mg/kg. |
Antiseptic | Cardinal Health | OMEL0000017 | Baxedin: 2% chlorhexidine in 70% isopropyl alcohol |
Avertin (2,2,2-tribromoethanol) – Anesthetic | Sigma Aldrich | T48402-25G | |
Clamp mount micromanipulator | AD Instruments | MM-33 | |
Curved serrated forceps | Fisher Scientific | NC0696845 | |
Dissecting microscope | Zeiss | SteREO Discovery.V8 | Apochromat S, 0.63X, FWD 107mm. Attached KL 200 LED for top light, labelled as light source in Figure 2B. |
Eye lubricant | Alcon | – | Systane ointment (Lubricant eye ointment) |
Glass capillary needles | Sutter Instrument Co. | B100–50-10 | Outside diameter: 1 mm, inside diameter: 0.5 mm, length: 10 cm |
Hartman hemostats | Fisher Scientific | 50-822-711 | |
Heating pad/disc | – | – | SnuggleSafe Pet Bed Microwave Heating Pad was used in this protocol. Microwave for 2-5min, and test with back of gloved hand. |
Magnetic Mount for micromanipulator | AD Instruments | MB-B | Used to keep the clamp mount micromanipulator stable and upright during injection. |
Micro bulldog clamp | Fisher Scientific | 50-822-230 | 3 cm |
Micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | P-97 Flaming/Brown type micropipette puller. Program used: P = 500, Heat = 576, PULL = 50, VEL = 80, DEL = 70 |
Petri dish | Fisher Scientific | 263991 | Autoclaved/sterile glass petridishes can also be used. |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Bio Basic Inc. | PD8117 | 10X PBS was diluted to 1X with DI water. Autoclave before use. |
Pulse generator/Electroporator | BEX CO., LTD | CUY21 EDIT II | Electroporation settings: 30 V, 3 pulses, 1 s interval, P. length = 50 ms, unipolar |
Rosa-LSLtdTomato mice | The Jackson Laboratory | 7914 | Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J |
Sharp-blunt dissection scissors | Fisher Scientific | 28251 | |
Sharp-pointed dissecting scissors | Fisher Scientific | SDI130 | |
Shaver | – | – | Hair removal cream can also be used. |
Silk braided sutures | Ethicon | 682G | 3/8 circle, gauge: 5-0, needle size: 18 mm, thread length: 75 cm. Staples can also be used. |
Tapered ultrafine tip forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
Thin absorbent paper | Kimberly-Clark Professional | 34120 | Kimwipes |
Trypan blue | STEMCELL Technologies | 7050 | Filtered using 0.22 µm sterile filter before use for microinjection. |