in vivoマイクロインジェクションとエレクトロポレーションを用いた体細胞ゲノム改変マウスモデル

動物は、タイプIIバイオセーフティキャビネットを含む専用室に配置された、フィルタートップ付きの静的マイクロアイソレーションケージに収容されました。すべての動物の作業は、機関のガイドラインに従って行われ、マギル大学の医学健康科学部の動物管理委員会(AUP#7843)によって承認されました。 1.マイクロインジェクション針の準備 次のプログラムでマイクロピペットプーラーを使用して、ガラスキャピラリーチューブを鋭いポイントに引き込みます:P = 500、Heat = 576、PULL = 50、VEL = 80、DEL = 70。 一対のテーパー超極細先端鉗子を使用して、図1A、Bに示すように、抜剖顕微鏡の下で引っ張られた毛細管の尖った端を切り取り、開口部を作成します。これは卵管を損傷し、遅い注射を防ぐので、開口部が大きすぎないことを確認してください。 図1:マイクロインジェクション針の準備。 (A、B)尖った端(A)で毛細管を引っ張って切り取り、開口部(B)を作成しました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 2.腹腔内注射のための麻酔薬の準備 手術当日に濾過、希釈アベルチンを調製する。アベルチン(2,2,2-トリブロモエタノール)原液をtert-アミルアルコール中に1.6 g/mLの濃度で激しく攪拌して調製し、暗所で保存します。 アベルチンストック溶液を1.25%v/v等張生理食塩水で希釈し、ドラフト内で最終濃度20 mg/mLにします。希釈したアベルチンをボルテックスし、0.22 μmの滅菌フィルターでろ過します。暗闇の中で保管してください。 3.手術領域の準備 手術エリアは、専用の無菌環境、できればクリーンベンチまたはバイオセーフティキャビネットである必要があります。必要に応じて、滅菌手術機器、顕微鏡、マイクロマニピュレーター、エレクトロポレーターを配置します。この例を 図 2 に示します。 加熱パッド/ディスクを加熱し、清潔で設備の整ったケージの下に置きます。このケージは、手術後のマウスを収容するために使用されます。 滅菌した1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を滅菌ペトリ皿に注ぎます。きれいなはさみを使用して、吸収紙をおおよそ1 cm x 1 cmの正方形にカットします。これらの吸収紙を1x PBSに落とし、浸します。 4.注射用溶液と針の準備 手術当日に注射液を調製してください。DNA/RNA/RNPをろ過したトリパンブルーと混合して、それぞれ200 ng/μLおよび5%の最小最終濃度にします。注射前に室温で保管してください。注意: 1 mLシリンジを使用して100%トリパンブルーを取り込み、使用前に0.22μmの滅菌フィルターでろ過してください。 引っ張ったキャピラリーニードル(以下、マイクロインジェクションニードルと呼びます)を、磁気マウントで安定化されたクランプマウントマイクロマニピュレーターに取り付けます( 図2Bに示すセットアップ)。 2 μLの注射液を滅菌ペトリ皿にピペットで入れます。顕微鏡で観察しながら、マイクロマニピュレーターに取り付けられた空気圧シリンジを使用して、この溶液の1〜2μLをマイクロインジェクション針にゆっくりと取ります。気泡を避けたり、マイクロインジェクション針に気泡を取り込んだりしないでください。 図2:手術領域の準備 。 (A)クリーンベンチ内の手術エリアのセットアップ。(B)右利きの人のための解剖顕微鏡とマイクロマニピュレーターのセットアップ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 5.女性の生殖管を露出させる ろ過、希釈されたアベルチン(麻酔薬)を0.25〜0.5 mg / gの用量で腹腔内投与することにより、6〜8週齢の雌マウスに麻酔をかけます。.これに続いて、カルプロフェン(先制鎮痛薬)を5 mg / kgの用量で皮下投与します。.注:麻酔薬として使用できる他の代替品は、イソフルランまたはケタミン/キシラジンです。 吸収紙を清潔で加熱されたパッド/ディスクに置きます。次に、麻酔をかけたマウスをこの加熱吸収紙の上に、背側を上に向けて置きます。手術中の乾燥を防ぐために、各目に目の潤滑剤を塗布します。注意: 手の甲でテストして、加熱パッド/ディスクが触るとわずかに暖かいことを確認します。 麻酔をかけたマウスのつま先を一対の鉗子でつまんで、深部麻酔停止をテストします。将来の切開部位( 図3Aに示す場所)の周りの背側の毛皮を取り除き、消毒剤で素肌を拭きます。 まっすぐな鈍い鉗子のペアを使用して素肌をつまみ、滅菌された鋭い鈍いはさみを使用して体の正中線に沿って長さ1 cmの切開を作成します。切開部周辺を消毒剤できれいにします。 滅菌Adson鉗子のペアを使用して、切断部位の片側をつまんで保持します。次に、一対の滅菌湾曲した鋸歯状の鉗子を使用して、正中線の切開から始めて横方向に移動して、皮膚を体壁から穏やかに分離します。 腎臓の下の脂肪パッドを見つけます。一対の滅菌ストレート鈍い鉗子を使用して、脂肪パッドの真上の体壁をつまむ。血管を避けるように注意しながら、滅菌された鋭く尖った解剖ハサミを使用して体壁に小さな切開を作成します。 まっすぐな鈍い鉗子で体壁をつまんだまま、一対の滅菌鈍い湾曲した鉗子を切開部に挿入し、体壁に作成された切開部を広げます。 鈍い湾曲した鉗子で目に見える脂肪パッドをつかみ、穴から引き出して卵巣、卵管、子宮を露出させます。 生殖管を露出させておくには、 図3Bに示すように、滅菌ブルドッグクランプで脂肪パッドをクランプします。 6. 生体内 卵管注射とエレクトロポレーション 加熱した吸収紙と麻酔したマウスを、解剖顕微鏡のステージ上に生殖管を露出させて、管を観察できるように注意深く置きます。顕微鏡下で観察したビューの一例を 図3Bに示す。 溶液の入った注射針も顕微鏡で観察できるようにマイクロマニピュレーターを調整します。 一対の滅菌テーパー超極細先端鉗子を使用して、注入される卵管の領域を安定して保持する。注入される領域は、マイクロインジェクション針の方向と一致しなければならない。注意: ブルドッグクランプを使用して、脂肪パッドと生殖管を固定し、必要に応じて管を最適な位置にそっと回転/移動します。 マイクロマニピュレーターを調整して、マイクロインジェクション針で卵管を穿刺すると同時に、テーパー状の極細先端鉗子を使用して卵管を針に送ります。マイクロインジェクションの針をそっと動かして、卵管に挿入されたことを確認します。注意: マイクロインジェクション針をコイル状の卵管のターニングポイントではなく、まっすぐなセグメントに挿入して、複数の穿刺や注射液の漏れを防ぎます。 顕微鏡で青色溶液の動きと卵管内腔の拡大を観察しながら、卵管に最大1 μLの溶液をゆっくりと注入します。内腔に気泡が入らないように注意してください。100%トリパンブルーを注入した卵管の代表的な画像を 図3C、Dに示します。 卵管から針を外します。標的とする領域を、滅菌済みの1x PBSにあらかじめ浸した吸収紙で覆います(ステップ3.3から)。 あらかじめ浸した紙とターゲットとする領域/領域を電極ピンセット(ターゲットとする領域のサイズに応じて1 mm、3 mm、または5 mm)でつかみ、体から引き離してから、パルス発生器/エレクトロポレーターで次の設定を使用してエレクトロポレーションします。 30 V、3パルス、1秒間隔、 50msのパルス長、ユニポーラ。注意: 電極間の距離は、電極が卵管を変形させることなくターゲット領域にクランプできるように設定する必要があります。推奨距離は約1mmです。 エレクトロポレーション後、吸収紙をはがし、マウスを(加熱した吸収紙を下にして)ヒートパッドに戻します。ブルドッグクランプを外し、露出した生殖管を体壁の下に慎重に押し戻します。セクション5を繰り返して、反対側の生殖管を露出させます。注:エレクトロポレーションは、マウスの発情期に関係なく、内腔が溶液で満たされている限り成功します。 露出した管を滅菌1x PBSにあらかじめ浸した吸収紙で覆い、乾燥を防ぎ、手順4.2と4.3を繰り返して2回目の注射用のマイクロインジェクション針を準備します。注意: 必要に応じてマイクロインジェクションニードルを交換します。必要に応じて滅菌1x PBSを適用することにより、露出した組織の乾燥を防ぎます。 上記の手順を繰り返して、反対側の卵管を注入して電気移植します。注意: 手術中および手術後に、必要に応じて目の潤滑剤を再塗布してください。 両方の卵管をエレクトロポレーションして体壁の下に戻した後、背側切開部位を縫合またはステープルで留めます。縫合には、止血材を使用して絹編組縫合糸の針をつかみます(3/8円、ゲージ:5-0、針サイズ:18 mm、糸の長さ:75 cm)。一対の滅菌湾曲した鋸歯状の鉗子を使用して切断部位の片側をつまんで保持し、次に止血剤を使用して縫合糸を操作して創傷を閉じます。 加熱されたパッド/ディスクの上に置かれたきれいなケージにマウスを移動し(手順3.2から)、マウスがアクティブになるまで監視します。 次の3日間、24時間ごとに5 mg / kgのカルプロフェンを皮下投与し、次の10日間監視します。. 図3:女性の生殖管曝露とマイクロインジェクション。 (A)Rosa-LSLtdTomatoマウスの背側の正中線切開の位置(黄色の線で表示)。(B)女性の生殖管への曝露。脂肪パッドは、滅菌ブルドッグクランプを使用してクランプされ、管を固定し、露出したままにしました。(C,D) 生体内 卵管注射の代表的な画像。マイクロインジェクション針を遠位膨大部(AMPと表示)に挿入し、ろ過した100%トリパンブルーを管内に注入しました(C)。解剖された卵管の代表的な画像は、注入されたトリパンブルー溶液が遠位および近位卵管内腔全体に分布することを実証する(D)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。